金花茶（Camellia nitidissima）是山茶科山茶属金花茶组植物，于20世纪60年代在我国广西首次被发现，是茶花家族中唯一开黄色花的物种。金花茶被赋予“神奇的东方魔茶”“植物界大熊猫”“茶族皇后”的美誉［1］，并被纳入我国珍稀濒危保护物种之列。现有诸多研究结果表明，金花茶含有丰富的黄酮类化合物［2-4］，黄酮类化合物作为一种天然的植物次生代谢物，具有多种生物学功能，包括抗氧化［5］、降血糖［6］、抗癌［7-8］、抗肿瘤等［9-10］，其中以抗氧化作用最为突出，并构成其他功能的基础。人体许多疾病的发生源于体内自由基过多，而黄酮类化合物的强抗氧化性可有效清除、抑制自由基，且能避免体细胞因受到氧化而衰老［11］。基于黄酮类化合物的以上生物学功能，可开发出相关药品和保健品，以预防相关疾病的发生及延缓衰老等，目前市场上有较多金花茶黄酮类相关的初级食用产品［12］，但缺乏金深加工产品，如要实现深加工，则需要掌握金花茶黄酮类化合物的高效提取、分离及测定方法，并深知金花茶中各种黄酮类化合物生物学功能。关于金花茶黄酮类化合物的提取方法，主要有有机溶剂提取法［13］、超声波辅助提取［14］以及应用较少的酶解法［15］；金花茶黄酮类化合物的分离大多采用大孔树脂吸附法［16］及色谱法［17］，膜分离法较少应用［18-19］；金花茶黄酮类化合物的测定方法以分光光度法为主［20］，高效液相色谱法［21-23］及液相色谱与质谱联用法具有较大应用潜力［24］。鉴于金花茶黄酮类化合物的相关理论研究较为缺乏，本研究就黄酮类化合物及金花茶中已分离鉴定出的黄酮类具体成分进行了详细阐述，对黄酮类化合物的多种生物学功能进行了综述，并对金花茶中黄酮类化合物提取、分离、测定的各种方法及其优缺点等进行了分析，以期为今后金花茶中黄酮类化合物的高效提取分离测定方法的选择应用及医药保健等产品的开发利用提供理论支撑。
黄酮类化合物是一种天然的植物次生代谢产物，一般指两个苯环通过中央三碳链相互连结而成的一系列具有C6-C3-C6基本结构的化合物［25］，各种天然黄酮类化合物都是在此基本结构上形成的衍生物。黄酮类化合物由于助色团而呈现黄色，不但种类繁多，而且结构类型各异，生物活性具有多样化。现已分离鉴定出9 000多种黄酮类化合物，从结构上来看，不同黄酮类化合物其黄酮骨架上羟基、甲基以及配糖体等取代基组合方式存在差异［26］，这是黄酮类化合物种类多样性的重要原因。根据结构上的不同，可大致将黄酮类化合物分为黄酮、黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、二氢黄酮醇、花色素和异黄酮类物质［27］。
许多研究者对金花茶中黄酮类化合物的成分进行了深入探究，发现了不同结构的黄酮类化合物。陈全斌等［2］以金花茶叶为试验材料，先提取了其中的总黄酮，然后通过分离技术获得高纯度甙元，经过色谱结合核磁共振等方法，对其黄酮成分进行结构判断，首次发现金花茶的叶片中含有黄酮甙，也证实了其甙元为槲皮素和山奈酚。彭晓等［3］利用色谱法从金花茶中分离出槲皮素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁、牡荆素、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷等7种黄酮类化合物。Peng等［4］从金花茶花瓣中分离得到槲皮素7-O-（6″-O-E-咖啡酰）-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等4种黄酮类化合物，还鉴定出一种新的酰化类黄酮糖苷。黄艳等［28］从显脉金花茶叶片中分离得到7个单体化合物，其中包含括山萘酚。周洁洁等［29］从长柱金花茶中分离并鉴定得到5，7-二羟基色原酮-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、落新妇苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖等4种黄酮类化合物。邹登峰等［30］从金花茶中分离得到芦丁和芹菜素6，8-二-C-β-吡喃葡萄糖苷两种黄酮类化合物。梁香等［31］采用液相色谱与质谱联用法检测金花茶中的黄酮成分，发现了儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶酚、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、芦丁、异槲皮苷、花青素、槲皮素、山柰酚、儿茶素没食子酸酯等黄酮类活性成分。很多研究结果表明，金花茶中黄酮类化合物种类具有多样性，其种类不仅与金花茶品种有关，而且提取分离方法不同也会影响鉴定结果。在金花茶黄酮类化合物的提取分离测定方面，还需要有一套标准化的操作规程。金花茶原生种有40多种，目前研究结果只是对常见的几种金花茶进行了黄酮类化合物的提取和鉴定，其他种类金花茶中的黄酮类化合物还需要提取、分离并鉴定。
研究结果表明，人体各种疾病的发生源于体内自由基的增多，而黄酮类化合物在清除、抑制自由基方面具有显著功效，表现出较强的抗氧化性，从而避免机体因受到氧化攻击而产生衰老［11］。宁恩创等［5］通过大孔树脂分离出金花茶中的黄酮，然后构建了不同的体外自由基体系，以测定金花茶中黄酮的体外抗氧化性，结果发现：金花茶所含黄酮类化合物在低浓度时就能实现对羟基自由基的清除，并表现出剂量效应；在清除超氧阴离子自由基效果更为明显，也呈现出较好的剂量效应，且优于对照组的茶多酚；能有效抑制ROO·自由基的产生。李石容［17］研究发现，金花茶黄酮类化合物3个组分YKC1、YKC2、YKC3对羟基自由基的清除率呈剂量关系，当YKC2浓度为1.2 mg/mL时清除率为71.3%；金花茶黄酮类化合物对超氧阴离子自由基的清除效果表现为当YKC2浓度为0.25 mg/mL时，清除率为57.8%；各组分对DPPH自由基均有很好的清除效果。周洁洁［32］通过体外自由基体系，利用分光光度法对长柱金花茶叶中总黄酮清除羟基自由基能力和DPPH自由基清除率进行测定，发现长柱金花茶提取液浓度在0.10～1.0 mg/mL时，样品溶液对羟基自由基的清除率随着浓度的增加而提高；当提取液浓度在0.05～0.25 mg/mL时，随着样品浓度的增大，其对DPPH自由基的清除率逐渐提高至50%，清除效果比较明显。可见，黄酮类化合物可以有效清除体内自由基，表明金花茶黄酮类化合物具有开发成保健品的潜质。
全世界患有糖尿病的人数日益增多，我国每年在糖尿病上的医药投入非常高昂，该疾病困扰了很多人，医疗机构正通过各种途径寻找和开发治疗糖尿病的药物。李丹等［33］研究发现一些中药能够达到降低人体血糖浓度的功效，并对糖尿病并发症产生抑制作用，如可以促使胰岛素分泌、清除自由基及影响相关蛋白的表达等。关于金花茶黄酮类化合物在降血糖方面的功效，Wang等［6］结果表明，金花茶黄酮类化合物能影响糖类转化，起到抑制血糖升高的作用；此外，黄酮类化合物对糖尿病并发症也有一定效果，该研究为开发金花茶中黄酮类化合物、生产降血糖药品提供了理论基础。
黄酮类化合物抗氧化活性的功效是其抗癌作用的基础，黄酮类化合物能有效清除、抑制脂质细胞周围的自由基，从而降低自由基引起的脂质过氧化程度，同时还可以起到预防细胞结构遭到破坏的作用。赛米热·艾尼瓦尔［7］采用噻唑蓝（MTT）比色法，检测不同浓度高良姜中总黄酮对宫颈癌SiHa细胞存活的影响，发现总黄酮浓度在50～100 µg/mL时可引起SiHa细胞凋亡，研究还发现总黄酮能够抑制宫颈癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡，其作用有剂量和时间依赖性。杨懋勋［8］发现野生白木香中5种黄酮类化合物对人前列腺癌细胞株DU145、PC-3及人肝癌细胞株HepG2显示抑制活性。因黄酮类化合物具有多样性，不同黄酮类化合物结构在抗癌方面的机理及功效各不相同，有待深入研究。
黄酮类化合物具有抗肿瘤作用，其主要机理有减缓肿瘤细胞增殖进程、促使肿瘤细胞衰亡、影响相关细胞信号转导中一些酶类活性等［9］。农彩丽等［34］试验表明，金花茶黄酮类化合物在体外对人体4种肿瘤细胞，即人肝癌细胞株（SMMC-7721）、人高分化鼻咽癌细胞株（CNE-1）、人胃腺癌细胞株（SGC-7901）、人大细胞肺癌细胞株（H460）的增殖都有抑制效果，而且表现出剂量依赖关系。Peng等［4］从金花茶茶花的提取物中分离得到一种新的酰化类黄酮糖苷，即槲皮素7-O-（6″-O-E-咖啡酰）-β-D-吡喃葡萄糖苷，该物质不仅能抑制人体淋巴瘤细胞增殖，还能诱发人体淋巴瘤细胞凋亡。赵元华等［35］研究发现，金花茶不仅叶和花具有抗肿瘤作用，种子也同样有效，即金花茶整个植株不同部位所含黄酮类化合物都可以起到抗肿瘤效果，开发价值较大。
除了以上诸多功能外，黄酮类化合物还具有其他多种功能，如在抗菌、抗炎、增强人体免疫功能、治疗骨质疏松、预防动脉粥样硬化等方面也都有功效［10］，这些功能主要基于其强抗氧化性和螯合能力等，具体表现为黄酮类化合物可以清除自由基、螯合金属离子等。关于金花茶黄酮类化合物对人体骨骼增殖的作用方面，刘阳阳等［36］研究显示其可以促进人体骨骼肌细胞C2C12的增殖分化，具体促进增殖机制可能与金花茶黄酮类化合物抑制NF-kB表达有关。
水提法也称为“煎煮法”，是传统的植物成分提取方法，即把植物材料加水后煮，待充分浸出后取其汁，该方法优点是设备简单、操作容易、成本较低，缺点是只能提取水溶性的黄酮类化合物，黄酮得率和含量都较低。宁恩创等［2］采用热水浸提方法结合有机溶剂除杂，对金花茶新鲜叶片中的总黄酮化合物进行了提取，结果显示总黄酮提取得率为0.19%。罗新星等［37］通过水提法3次提取金花茶叶片水提物，并结合冷冻干燥技术获得金花茶叶片水提物粉末，检测到金花茶叶片中主要活性成分黄酮类含量为12.99%。水提法作为一种传统的提取方法，其提取率不高，如需较高提取率，还要结合其他方法才能达到预期。
有机溶剂提取黄酮类化合物的方法是目前应用最为广泛的一种方法，常用提取溶剂有甲醇、乙醇、乙醚等，该方法对脂溶性基团占优势的黄酮类化合物而言提取效果较好。有机溶剂提取法的优势是对设备要求不高、产品得率高、总体成本低，缺点是杂质含量高、提取物纯度低［13］。苏建睦等［38］采用70%乙醇对金花茶茶花中的黄酮类化合物进行提取，经过2 h水浴回流提取，最后得到普通金花茶、毛瓣金花茶及扶绥中东金花茶花中总黄酮含量分别为4.80%、13.78%、6.12%。周洁洁［32］研究认为，长柱金花茶叶中总黄酮最佳提取条件为95%乙醇、料液1∶40、提取温度40℃、提取3次、每次提取时间2 h，其总黄酮含量为57.5 mg/g。王坤等［39］采用70%乙醇对金花茶叶片中的黄酮类化合物进行提取，结果显示普通金花茶、显脉金花茶、凹脉金花茶及小花金花茶叶片中总黄酮含量分别为4.39%、6.12%、13.44%、4.56%。在采用有机溶剂提取法时，需要注意溶剂的选择，不同有机溶剂对黄酮类化合物的提取效果存在差异；选定有机溶剂后，溶剂浓度、提取温度、提取时间都影响到金花茶黄酮类化合物的提取率，因此需筛选、优化提取方法。
近年来，超声波辅助提取法逐渐应用于黄酮类化合物的提取，其原理主要是利用超声波的能量使细胞膜破裂，促进细胞内化合物释放、溶出，同时超声波还会产生机械振动、扩散、击碎等效应，这将进一步加速细胞内物质的释放［14］。超声波辅助提取法的优点是效率高、操作简单、应用范围广，缺点是提取过程噪音大。李石容等［17］研究表明，在20%乙醇、料液比1∶45、温度70℃、超声功率300 W、提取1次的工艺条件下，金花茶花中黄酮类化合物的提取效果最佳、得率高达13.7%，高于非超声波提取的对照试验（得率9.89%）；该研究还比较了不同超声功率（200、250、300、350、400 W）对金花茶花黄酮类化合物得率的影响，在料液比1∶50、乙醇浓度20%、提取温度60℃的条件下，当提取功率在200～400 W时，金花茶花黄酮类化合物得率随着提取功率的增大先后降低，功率为300 W时达最大值12.7%。牛广俊等［40］使用层次分析法对金花茶超声波提取工艺进行了评价，认为该方法可以节约提取时间，总黄酮提取率高（15.88%）。超声波辅助提取法需要与其他方法结合使用，超声功率大小设定直接影响提取结果，需经过多次试验确定最佳工艺。
酶解法是指在植物黄酮类化合物提取中加入适当酶，促使其发生酶解反应，从而使得黄酮提取率更高。植物中的许多黄酮类化合物存在于植物细胞内，被纤维素细胞壁所包围，若加入纤维素酶，即通过酶解反应促进细胞壁破坏，减少黄酮类化合物提取的阻力，有利于其充分提取；此外，酶解反应在常温下即可发生，这样有助于黄酮类化合物结构的保护，避免了高温破坏［15］。金花茶叶片表面蜡质化、叶脉多、组织紧密，秦小明等［41］在金花茶鲜叶黄酮类等物质提取过程中加入了果胶酶，促使其发生酶解反应，结果表明金花茶总黄酮含量为鲜叶的0.46%、提取率达80.2%。酶解法优势明显，比一般方法的提取率高，提取时间也较短，有助于金花茶黄酮类化合物的高效提取。
大孔树脂是一种人工合成的有机高分子聚合物吸附剂，其典型特点是具有立体孔结构，主要应用于植物天然产物成分的分离纯化。大孔树脂吸附法的优点是吸附量大、选择性好、再生容易等［16］。大孔树脂有不同型号，实际应用中需根据分离纯化目的和样品性质来选择型号。湛志华等［42］在金花茶叶片黄酮类化合物的分离纯化过程采用了D-101大孔树脂吸附方法，结合75%乙醇洗脱、旋干，得到金花茶粗黄酮，再用无水酒精精制获得精制黄酮，黄酮粗品中总黄酮含量为2.33%，黄酮精品中总黄酮含量为4.62%。宁恩创等［5］则采用XAD-16大孔吸附树脂对金花茶粗黄酮进行分离，获得分离后的组分F1、F2、F3；该研究发现使用大孔树脂作为分离介质，再经过乙醇洗脱剂，可实现金花茶黄酮的有效分离，黄酮总得率接近70%，烘干后组分F2及F3中黄酮含量均达70%以上。可见，大孔树脂吸附法在金花茶黄酮类化合物的分离纯化中效果明显，但该方法需要配合其他试剂和操作（如乙醇洗脱）才能实现最终分离纯化目的。
色谱分离法主要原理是利用分离物在不同固液相之间流动速度的不同而达到分离目的。该法目前在生物、医药及食品等领域的研究过程应用广泛，常见的色谱法包括柱色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等［17］。黄艳等［28］采用薄层硅胶柱分离、薄层色谱鉴别及重结晶等方法分离显脉金花茶的提取物，得到山萘酚等7个单体化合物。邹登峰等［43］研究建立了金花茶叶黄酮类成分的高效液相色谱指纹图谱，该研究者在对金花茶黄酮类化合物提取的另一项研究中，通过硅胶柱色谱和半制备液相色谱分离得到4种化合物，其中包括芦丁和芹菜素6,8-二-C-β-吡喃葡萄糖苷［30］。陈秋虹等［44］运用硅胶柱色谱、薄层色谱及高效液相色谱相结合技术，分离纯化得到长柱金花茶的多种黄酮物质。色谱法能有效分离金花茶中的黄酮类化合物，研究者一般将多种色谱法结合使用，从而达到更好的分离效果。
膜分离技术的原理是应用人工合成的高分子膜，根据其两侧浓度差、压力差等实现对物质的分离和纯化，现有膜分离方法主要有微滤、纳滤、超滤、反渗透等，目前滤膜材料品种不多，仍需进一步开发［18-19］。杨继住等［45］研究认为，在纳滤浓缩过程中，膜的渗透通量随操作压力和温度的上升而加大，随浓缩时间的延长而减小，最终能实现对金花茶提取液中黄酮类物质的富集；该研究者认为，在简化工艺、缩短周期及节能方面，纳滤分离技术要比传统真空浓缩技术更具优势。迄今，在金花茶黄酮类化合物的分离中，膜分离技术还未被广泛应用，可能是膜材料品种较少所致，未来随着膜材料的逐渐丰富，该技术也会更多地应用在实际中。
分光光度法的基本原理是以芦丁为标准品，Al（NO3）3络合体系显色，一般在510 nm处有最大吸收峰，通过测定其吸光度，计算出其中的总黄酮含量。该方法虽然容易受到处理过程颜色变化的影响而产生测量误差，但仍是最常用的总黄酮含量测定方法，原因是该方法操作简单、测定成本低、仪器要求不高［20］。黄兴贤等［46］采用分光光度法对14种金花茶叶片中的总黄酮含量进行了测定，研究发现，苹果金花茶中总黄酮含量最高、为22.011%；普通金花茶新叶、一年叶、两年叶中总黄酮含量分别为10.145%、3.079%、2.290%，即新生叶中总黄酮含量明显高于老叶。罗新星等［37］也采用分光光度法测定了金花茶叶水提物中总黄酮的含量，所测黄酮活性成分含量为12.99%。分光光度法由于测定方法简单、成本低等优点，目前应用较为广泛，但是该方法精确度不高，仅能测定总黄酮含量，对精确度要求较高的则需要考虑结合其他方法。
高效液相色谱法是以经典的液相色谱为基础，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内被分离后再进行检测，从而实现对样品的分析，高效液相色谱是测定黄酮类化合物的有效方法，效率较高［21-23］。周兴文等［47］采用高效液相色谱法，对不同发育时期金花茶花瓣中的栎精-7-O-β-D-葡萄糖苷、栎精-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素等3种黄酮类物质的绝对含量进行测定，发现3种成分含量均表现为先上升后下降，最大值分别达到1228.6682、228.1467、2.9361 µg/g。牛广俊等［48］采用高效液相色谱法对19种金花茶叶片中的黄酮含量进行测定，发现不同品种金花茶叶片中黄酮含量差异显著，证实了不同品种金花茶叶在品质上存在较大差异。高效液相色谱法在金花茶黄酮类化合物的测定上精确性明显较高，可以具体到其中一种黄酮化合物含量的测定。
液相色谱与质谱仪是液相色谱与质谱的联用，将两者的优势相结合，是一种高端分析仪器。液相色谱能够将样品中的成分有效分离，质谱则可以对分离出的成分逐个分析，得到其分子量、浓度甚至结构等信息。液相色谱与质谱联用法已成为当前最为精确的一种测定方法，与其他方法相比，其能达到更佳的选择性和更低的检测限，对黄酮类化合物的分析具有较高的灵敏度，而且耗时较短［24］。梁香等［31］采用液相色谱与质谱联用方法，检测到金花茶中黄酮类物质主要为槲皮素和山柰酚，总黄酮含量达3.0%，认为该方法测定金花茶中黄酮类化合物效果较好，适于金花茶黄酮类成分的分析检测。液相色谱-质谱仪器较为高端，分离测定效果明显优于其他方法，在今后应用中潜力巨大。
金花茶中黄酮类化合物是一类重要的天然产物，金花茶也因含有大量且多样化的黄酮类化合物而逐渐引起人们重视。近10年来，研究者们积极探究如何从金花茶中提取纯度高、活性强的天然黄酮类化合物成分，并试图通过各种技术方法，如超高效液相色谱与质谱连用技术，实现定性定量分析金花茶中黄酮类化合物成分和含量，并已检测到数十种黄酮类成分，但对检测出的每一种黄酮类化合物的具体生物学功能机理方面的研究，目前仍较为缺乏，现有研究主要是针对金花茶中总黄酮类化合物生物学功能的报道，因此，今后研究中有必要加强对各种黄酮类化合物的生物学功能研究。
金花茶是我国珍稀濒危保护物种，现存金花茶原生种质资源40余种，当前关于金花茶中黄酮类化合物的研究主要以普通金花茶、毛瓣金花茶、凹脉金花茶、显脉金花茶等常规栽培种为主，仍有许多金花茶种质资源未见报道，未来可扩大研究范围。不同品种的金花茶，其黄酮类化合物的成分及含量也不尽相同，只有通过对多种金花茶进行研究，才能筛选出开发价值较高的品种。此外，如何将提取出来的金花茶黄酮类化合物进一步加工成有抗氧化、抗肿瘤、抗癌等功能的医药、保健及食品等，即深加工技术也是今后研究的一个方向，市场上关于金花茶黄酮类化合物的产品还较少，具有良好开发潜力。
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Research Progress in Biological Functions and Methods of Extraction, Seperation, Determination of Flavonoids from Camellia nitidissima