【研究意义】泡桐（Paulownia）为玄参科（Scrophulariaceae）泡桐属（Paulownia）落叶乔木，原产中国，在国内25个省（市、区）有自然分布，是我国栽培历史最悠久的树种之一［1-3］。泡桐作为我国最重要的造林树种之一，具有生长迅速、生长周期短等特点，其材质轻而韧、不翘裂，具有防潮隔热、耐酸耐腐等性能，是制造家具、胶合板及造纸等的良好材料［4-5］。生物固氮是指固氮微生物将大气中游离态氮转化为化合态氮的过程，即将不能被植物所利用的氮气转化为能够被植物利用的氮的过程，是地球上氮循环的一个重要组成部分［6］。非豆科植物同与之共生的微生物组成的固氮系统，在自然界中占据了重要地位。因此，研究泡桐根瘤内生细菌与泡桐的固氮结瘤情况，对探索构建非豆科树木的固氮体系以及发现新的固氮菌和固氮结瘤树种作为新的种质资源具有重要意义。【前人研究进展】对根瘤内生菌的研究，主要集中在大豆、胡卢巴、苜蓿等豆科植物［7-9］。对非豆科植物的研究中，黄宝灵等［10］发现罗汉松根际存在结瘤现象并分离出一株根瘤内生细菌LHS9601；冯健玲等［11］从杨梅根瘤中分离获得3个弗兰克氏菌属的内生菌株MF3、MF6和MF9；周德明等［12］从四川桤木和台湾桤木根瘤中分离出菌株AC0812S009和AC0812T017两株根瘤内生菌，并初步判定为弗兰克氏菌；宋福强等［13］从沙枣根瘤内成功分离和鉴定出27个纯菌株，其中有4株放线菌、14株细菌、9株真菌；张爱梅等［14］通过高通量测序对3个不同海拔西藏沙棘根瘤中的菌群组成和多样性进行了分析，结果表明除了能与沙棘共生固氮的弗兰克氏菌外，还存在其他微生物群落。【本研究切入点】虽有研究报道非豆科植物具有结瘤固氮现象并对其根瘤内生菌进行了鉴定，但与豆科植物的共生固氮相比，对非豆科植物的固氮研究却少得多。通过野外调查，发现泡桐根际存在结瘤现象，但对其与固氮微生物共生形成根瘤以及根瘤内生菌的分离鉴定至今国内外尚未见报道。【拟解决的关键问题】本试验对从广西钦州市采集的泡桐根瘤样品进行分离，通过传统生理生化特性研究、16S rDNA全序列分析测定和系统发育分析，对分离纯化的内生细菌进行初步鉴定，为深入研究泡桐根瘤内生细菌的结瘤固氮特性和对植株生长的作用提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地位于广西钦州市。钦州市属亚热带季风海洋气候，年平均气温22℃，1月气温全年最低，平均气温在10℃以上。年均雨量为2 104.2 mm，夏、秋两季湿热多雨，降雨量占全年81.7%，年均蒸发量1 652.5 mm，空气相对湿度81%，冬季为干冷少雨季节，雨量不大，降水量仅占全年雨量的5.9%，属于丘陵地貌，采集样地土壤为砂壤土。
1.2 根瘤的采集、分离和纯化
于2017年9月30日从广西钦州市泡桐林采集结瘤量多的新鲜细根，选取饱满、个大的根瘤用自来水冲洗表面泥沙，在无菌操作条件下，分别用75%酒精和0.1%升汞进行表面消毒，用无菌水冲洗干净后，将根瘤置于灭过菌的研钵中研磨，加入少量无菌水，用接种针蘸取汁液在加入刚果红的YMA［15］培养基上进行划线分离，28℃培养至菌落出现，挑取对刚果红不吸色的单个典型菌落进行纯化。
1.3 生理生化试验
3-酮基乳糖反应、牛肉膏蛋白胨实验、利用碳源实验、利用氮源实验、淀粉水解实验、柠檬酸盐生长等均按常规方法［16］进行；B.T.B反应参照黄维南等［17］的方法，在1 000 mL YMA培养液中加入0.5%溴麝香草酚蓝溶液5 mL，接种1周后观察结果，以不接种为对照，3次重复。
1.4 16S rDNA全序列测定和分析
1.4.1 细菌DNA提取和16S rDNA扩增 将纯化后的细菌菌株接种于YMB培养基，于28℃振荡培养至生长对数期，提取基因组DNA。分别以供试9株菌株的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA特异引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。
扩 增 体 系：DNA模 板 1.0 µL；27F（10µmol/L）0.8 µL；1492R（10 µmol/L）0.8 µL；2×PCR Mix 10 µL；双蒸水补足至20 µL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环；72℃延伸10 min。
PCR扩增产物用0.8%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增到长约1.5 kb的PCR反应物送上海美吉生物医药科技公司测序。
1.4.2 16S rDNA序列系统发育分析 将双向测序获得的16S rDNA全序列在生物技术信息网页http://www.ncbi.nlm.nib.gov/进行BLAST序列分析及同源性比较，找到与GenBank中同源性高的相关序列作为参照菌株。用MEGA 5.0中的邻接法（neighbor-joining method）自举值（Boot-strap）1 000次构建系统发育树，确定各菌株在微生物系统发育学上的地位。
2 结果与分析
2.1 泡桐根瘤内生细菌的分离结果
经过分离纯化获得9株泡桐根瘤内生细菌，所有菌株在YMA培养基上第1天内生长少；第2天开始大量生长，由表1可知，形成明显菌落，大部分菌落表面湿润、有光泽。除菌株PG-7外，其余菌株形态都为杆状，革兰氏染色均为阴性，有鞭毛，无芽孢，只有33%的菌株有荚膜。从总体形态特征观察结果来看，从泡桐根瘤分离的菌株菌落特征与根瘤菌的菌落具有更多相似性。
表1 泡桐根瘤内生细菌的形态观察结果
Table 1 Results of morphological character tests of endophytic bacteria of Paulownia root nodules
菌株Strain鞭毛Flagllum PG-1 圆形，凸起 4～5 半透明，乳脂白色 杆状 G- 无 无 有PG-2 圆形，凸起 3～4 半透明，乳脂白色 杆状 G- 无 无 有PG-3 圆形，凸起 3～5 半透明，乳脂白色 杆状 G- 无 无 有PG-4 圆形，扁平 1～2 不透明，乳白色 杆状 G- 无 无 有PG-5 圆形，扁平 2～3 不透明，乳白色 杆状 G- 无 有 有PG-6 圆形，凸起 2～4 半透明，乳脂白色 杆状 G- 无 有 有PG-7 圆形，凸起 4～5 半透明，乳黄色 螺旋状 G- 无 无 有PG-8 圆形，凸起 2～3 半透明，乳脂白色 杆状 G- 无 有 有PG-9 圆形，凸起 2～3 半透明，乳脂白色 杆状 G- 无 无 有菌落形状Colony shape菌落直径Colony diameter（mm）菌落颜色Colony color菌体形态Thallus morphology革兰氏染色Gram stain芽孢Spore荚膜Capsule
2.2 泡桐根瘤内生细菌的生理生化特性
2.2.1 碳源利用 由表2可知，不同菌株对不同碳源利用效果不同，能不同程度地利用单糖和双糖。9株供试菌株在无糖基础培养基上生长一般，PG-3不能在添加有麦芽糖的培养基上生长，PG-5对碳源要求最高、不能利用蔗糖，且在含其余7种碳源培养基上均生长较差。除PG-5和PG-3外，其余菌株均能利用供试的5种单糖和3种双糖，绝大部分菌株生长良好。
表2 泡桐根瘤内生细菌碳源利用试验结果
Table 2 Results of the carbon sources utilization test of endophytic bacteria of Paulownia root nodules
注：“+++”生长良好，“++”生长较好，“+”生长一般，“+-”生长差，“-”不生长。
Note: “+++”:favored growth ,“++”: better growth, “+”: general growth, “+-”: poor growth, “-”: no growth.
PG-1 +- ++ + ++ +- ++ + + +PG-2 + + + ++ + ++ + + ++PG-3 + + + + + - + + +PG-4 + + + + + + + ++ +PG-5 +- +- +- - +- +- +- +- +-PG-6 + + + + ++ ++ ++ ++ +++PG-7 + + + ++ ++ + +++ ++ ++PG-8 + + + + + + ++ ++ +++PG-9 + + + + + + ++ + ++
2.2.2 无机氮源利用 从表3可以看出，不同菌株对无机氮源的利用情况不同。第7天时，除PG-6、PG-8菌株外，其他菌株均能利用铵态氮为氮源，占全部菌株的78%；除PG-5菌株外，其余菌株均能利用硝态氮为氮源，占全部菌株的89%，表明绝大多数菌株能较好地将无机氮源转化为可利用氮源。PG-3和PG-5在第3天时，分别不能利用硝态氮和铵态氮，而在第7天时均能利用这两种氮源，说明菌株在不同生长时期对于氮源的利用有差异。
2.2.3 部分生理生化反应 表4显示，所有供试菌株的淀粉水解和3-酮基乳糖反应均呈阴性，除PG-8菌株外都能利用柠檬酸盐；在B.T.B反应试验中，除PG-7菌株产碱外，其余菌株均产酸。供试菌株中有3株能还原硝酸盐，占全部菌株的33%。有56%的菌株能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好。
表3 泡桐根瘤内生细菌无机氮源利用试验结果
Table 3 Results of the inorganic nitrogen sources utilization test of endophytic bacteria of Paulownia root nodules
注：“+++”生长良好，“++”生长较好，“+”生长一般，“+-”生长差，“-”不生长。
Note: “+++”:favored growth, “++”: better growth, “+”: general growth, “+-”: poor growth, “-”: no growth.
PG-1 + + ++ ++PG-2 + + ++ ++PG-3 + + - +PG-4 ++ ++ ++ ++PG-5 - + - -PG-6 - - + +PG-7 + ++ + +PG-8 - - + +PG-9 +- + +- +
表4 泡桐根瘤内生细菌部分生理生化特性
Table 4 Parts of the physiological and biochemical characteristics of endophytic bacteria of Paulownia root nodules
注：“+”阳性，“-”阴性。
Note: “+”: positive, “-”: negative.
硝酸盐还原KNO3 reduce PG-1 - - + 产酸 - +PG-2 - - + 产酸 - +PG-3 - - + 产酸 + -PG-4 - - + 产酸 + -PG-5 - - + 产酸 + -PG-6 - - + 产酸 - -PG-7 - - + 产碱 + +PG-8 - - - 产酸 - -PG-9 - - + 产酸 + -菌株Strain淀粉水解Starch hydrolysis 3-酮基乳糖3-ketol-actose柠檬酸盐利用Citrate used B.T.B反应B.T.B test牛肉膏蛋白胨Beef extract peptone
2.3 泡桐根瘤内生细菌的16S rDNA序列测定结果
2.3.1 16S rDNA序列分析 将所测得的16S rDNA全序列输入生物技术信息网页http://www.ncbi.nib.gov/，用BLAST程序与GenBank上的参比菌进行序列分析及同源性比较，结果（表5）发现菌株PG-3、PG-5、PG-6、PG-8、PG-9与数据库中根瘤菌属的同源性达到100%。因此，可将分离出的泡桐根瘤内生细菌分为根瘤菌属、土壤杆菌属、草螺菌属、伯克氏菌属4类，表明泡桐瘤内生细菌具有遗传多样性。
表5 泡桐根瘤内生细菌16S rDNA序列比对结果分类
Table 5 The classification according to the results of 16S rDNA sequence blast of endophytic bacteria of Paulownia root nodules
根瘤菌属 Rhizobium PG-3、PG-5、PG-6、PG-8、PG-9土壤杆菌属Agrobacterium PG-1、PG-2草螺菌属Herbaspirillum PG-4伯克氏菌属Burkholderia PG-7
2.3.2 16S rDNA全序列系统发育分析 将9株泡桐根瘤内生菌株的16S rDNA全序列通过系统发育分析得出各菌株间相似性及系统发育树状图（图1），图1显示，在系统发育树中，26个菌株分别聚类于不同分支，供试的PG-1和PG-2菌株处于土壤杆菌属（Agrobacterium）和根瘤菌属（Rhizobium）的交叉分支中，并与土壤杆菌属的遗传距离最近，同源性达到100%，因此可以确定菌株PG-1和PG-2是隶属于Agrobacterium属的种。PG-3、PG5、PG-6、PG-7和PG-8与根瘤菌属不同的种构成分支，PG-6、PG-8和PG-9处于同一分支中，且PG-8和PG-9具有98%的相似水平，可能为同一个种，与Rhizobium multihospitium strain XM06（MK249668.1）菌株的遗传距离最近、同源性为96%。PG-4与Herbaspirillum sp. RFNB25（FJ266335.1）的遗传距离最近、同源性为100%，PG-7与Burkholderia sp. G103（KJ948371.1）的同源性为100%。根据16S rDNA全序列和16S rDNA序列构建的系统发育树结果，确定PG-3、PG-5、PG-6、PG-8和PG-9菌株均属于根瘤菌属，PG-4属于草螺菌属（Herbaspirillum），PG-7属于伯克氏菌属（Burkholderia）。
图1 基于16SrDNA序列构建的系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic dendrogram of 26 strains based on 16S rDNA gene sequences
3 讨论
从泡桐树根瘤上经分离、纯化获得9个根瘤内生菌株，在生理生化方面具有明显差异性，表现出菌株的复杂性和多样性。根瘤菌是一类革兰氏染色为阴性的杆状细菌，一般不具有芽孢。本试验分离的9株泡桐根瘤内生细菌菌株中，所有菌株革兰氏染色均为阴性，且均不具有芽孢，除菌株PG-7外，其余菌株形态均为杆状。
根据1984年Jordan等报道，根瘤菌区别于其他土壤杆菌的反应特征是不能利用3-酮基乳糖、柠檬酸盐和淀粉、不液化明胶。从本试验研究结果来看，并不能完全根据上述反应特征进行区别。根据资料报道，采集自不同区域、不同宿主植物的根瘤菌在生理生化特性方面都有不同性质。供试菌株中只有一株菌株不能利用柠檬酸盐，有相关研究表明根瘤菌也能利用柠檬酸盐［18-19］。供试菌株大部分能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好，刘灵芝等［20］对北方地区大豆根瘤菌研究发现，部分菌株表现牛肉膏蛋白胨阳性反应，但韦原莲等［21］、吕成群等［22］研究表明所有根瘤菌均不能利用牛肉膏蛋白胨。在B.T.B试验中，只有一株菌株产碱，其余都产酸。多数供试菌株能不同程度地利用KNO3和（NH4）2HPO4两种氮源。一般情况下，根瘤菌能利用各种糖，特别是快生根瘤菌对糖的种类选择性不强［23］。在本试验中，绝大部分菌株都能在含有碳源的培养基上生长良好。经初步鉴定，所有菌株在生理生化特性中表现出一些根瘤菌的特性，但也表现出一些与根瘤菌不相符的特性，因此，对于这些菌株的分类地位还无法确定，需要进一步研究。
通过对9株供试菌株进行16S rDNA全序列比对结果，确定9株供试菌株可分为4个细菌属。PG-3、PG-5、PG-6、PG-8和 PG-9等 5个 菌株属于根瘤菌属，占所有菌株的56%；PG-1和PG-2为土壤杆菌属，占供试菌株的22%；PG-4属为草螺菌属；PG-7为伯克氏菌属。伯克氏菌（Burkholderia）在农业上可作为生物降解、生物控制及促进植物生长的根圈微生物，杨群［24］对厚荚相思树种根瘤菌的多样性研究中，也分离出一株隶属于伯克氏菌属的菌株QX6-8，回接时单株结瘤数最高，结瘤率也达到了100%。草螺菌（Herbaspirillum）是一类可在高糖培养基上生长但不利用蔗糖的新细菌类群，但在本试验中，菌株PG-4却能利用蔗糖。王婷等［25］研究发现，两株茶树内生草螺菌均不具备固氮酶活性，而王秀呈等［26］从水稻根部分离出一株具有高效固氮酶活的草螺菌属菌株DX35，说明同属内生细菌不同种类生理功能呈现明显的多样性。本试验中PG-4是否具有固氮酶活性，还需进一步研究。土壤杆菌（Agrobacterium）是属于根瘤菌科的革兰氏阴性细菌，但不固氮，绝大多数能使植物致癌，本试验在泡桐根瘤内分离出了土壤杆菌，说明存在癌变的潜在可能，需要及时防治。
4 结论
本研究结果表明，分离自同一寄主的根瘤内生细菌其生理生化特性方面存在较大的差异性，因此认为细菌在进化过程中，受到生态环境的影响，使其生理生化性质也受到了改变，表现出了丰富的多样性。从泡桐根瘤内分离纯化到的9株菌株，经鉴定分为4个属，其中根瘤菌处于优势地位，其次还有土壤杆菌属、草螺菌属和伯克氏菌属，这表明泡桐瘤内生细菌具有遗传多样性，这些差异也为泡桐在林业上的生产应用提供了多样的、可供选择的资源。泡桐作为我国重要的速生造林树种之一，想要提高林木生产量、降低营林成本，对其接种与之相适应的、共生固氮性能良好的根瘤内生菌非常重要。需进一步探讨泡桐树种根瘤内生菌的侵染结瘤特性，并为筛选优良泡桐树种根瘤内生菌提供依据。
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