【研究意义】土壤酶是土壤的重要组成部分，其来源主要有植物根系、微生物分泌释放土壤酶及土壤动植物区系及其残体释放酶。土壤酶在土壤物质转化、能量代谢和污染土壤修复等过程中发挥着重要作用［1］，其活性受自然因素、植物根系因素和人为因素等很多因素影响。近年来，以土壤酶活性为指标，评价外来物质对土壤生态毒理学效应已成为环境科学领域的研究热点之一［2-3］。脲酶是土壤氮循环的关键酶，广泛分布于土壤，专一性水解尿素生成氨、二氧化碳和水。脲酶活性反映土壤有机氮向有效态氮的转化能力和土壤无机氮的供应能力［4］，是评价生态环境质量优劣和土壤肥力高低的重要指标。喷施宝叶面肥是最早在国内推广的叶面肥料，适用于各种土壤和作物，具有增产、提质、抗逆和防病等效果［5］，目前其对土壤环境的影响评价还比较欠缺。长期以来，采用农药制剂防治茶树病虫害，是保障茶叶产量和品质的一项重要措施。其中，哒螨灵、联苯菊酯（天王星）和毒死蜱等3种杀虫剂仍被用于茶园害虫防治。哒螨灵又名速螨酮、哒螨酮等，属杂环类低毒杀虫杀螨剂，其药效好、持效期长，可用于苹果、梨、柑桔等果树，也被广泛用于茶叶生产［6］。联苯菊酯（天王星）是一种中等毒性的拟除虫菊酯类农药，对茶园环境鳞翅目食叶害虫、小绿叶蝉、茶蚜、黑刺粉虱、茶叶象甲和茶叶螨类等主要害虫均有较好的防治效果，常被用于无公害茶叶生产。毒死蜱又名乐斯本、白蚁清、氯吡磷、杀死虫，属中等毒性杀虫剂，多适用于茶树上多种咀嚼式和刺吸式口器害虫的防治。【前人研究进展】农药的大规模使用改变了土壤理化性质，并导致一定程度的环境污染。近年来，有关化学农药对土壤脲酶活性影响的研究取得了一定进展。李霞等［7］研究了多种杀菌剂对土壤脲酶活性的影响，发现5种农药均会对脲酶活性产生抑制作用。谢勇波等［8］认为在不同土壤肥力条件下，不同杀虫剂对土壤脲酶的影响效果不一样，有的杀虫剂能抑制土壤脲酶的活性，有的却能激活，还有的先抑制后激活。谢慧等［9］发现杀虫剂哌虫啶对脲酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶表现为抑制作用，却能使脱氢酶活性得到激活。在国外，有学者认为除草剂丁草胺能明显抑制非淹水土壤的脲酶活性［10］，杀菌剂稻瘟净对土壤脲酶活性的影响则表现为施药6周后激活，而长期使用则明显抑制的效应［11］。【本研究切入点】科学合理评价喷施宝叶面肥的环境效应。【拟解决的关键问题】模拟茶园土壤喷施农药的研究方法，探讨叶面肥喷施宝对3种农药（哒螨灵、联苯菊酯、毒死蜱）胁迫下茶园土壤脲酶活性的影响，为了解叶面肥和化学杀虫剂对土壤理化性质的影响提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 土壤样品 试验于2015年9—12月在福建师范大学福清分校试验基地进行，供试土样采自福建省安溪县西坪镇茶园（117°36′E、24°50′N）石底红壤，红壤外观特征为干燥、小颗粒，采样深度3～20 cm，取回实验室后26 ℃自然风干，研钵磨碎后过2 mm筛，进行土壤理化基本性质检测。
1.1.2 主要药品 甲苯，山东京博石油厂。喷施宝叶面肥为有机水溶肥料（喷施宝广谱型，塑料软包装，每包10 mL），广西喷施宝集团有限公司产品。供试农药：20%哒螨灵可湿性粉剂，河北沧州中天化工有限责任公司；天王星乳油（ 含2.5%联苯菊酯），苏州富美实植物保护有限公司；48%毒死蜱，浙江新农化工股份有限公司。
1.1.3 主要仪器 GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；7200型分光光度计：上海民怡仪器仪表有限公司；AB204-E酸度计：上海雷磁仪器厂；P402N电子天平：上海精密科学仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计 按田间推荐剂量添加以水稀释的喷施宝叶面肥和3种农药。每种农药设4个处理（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和CK），其中CK为清水对照，即不添加喷施宝和农药的清水（表1）。每个处理3次重复，小区面积约4 m2。各处理均按照铁观音茶园管理办法所推荐的使用剂量施用，分别在喷药后3 d、5 d、7 d取样测定土壤脲酶活性。
表1 试验设计
Table 1 Design of experiment
处理Treatment毒死蜱ChlorpyrifosⅠ 20%哒螨灵4000倍+喷施宝1000倍哒螨灵Pyridaben天王星Bifenthrin 48%毒死蜱1000倍+喷施宝1500倍Ⅲ 20%哒螨灵4000倍 2.5%天王星1500倍 48%毒死蜱1000倍CK 清水 清水 清水48%毒死蜱1000倍+喷施宝1000倍Ⅱ 20%哒螨灵4000倍+喷施宝1500倍2.5%天王星1500倍+喷施宝1000倍2.5%天王星1500倍+喷施宝1500倍
1.2.2 土壤理化基本性质检测［12］ 土壤粘粒含量采用吸管法测定；土壤容重采用环刀法测定；pH测定采用水提取（水∶土=2.5∶1），电位法测定参照NY/T1377-2007。有机质含量测定采用重铬酸钾容量法（NY/T85-1988）；全氮含量测定采用半微量开氏法（NY/T 53-987）；全磷含量测定采用氢氧化钠熔融-分光光度法（NY/T88-1988）；全钾含量测定采用氢氧化钠熔融-火焰光度法（NY/T87-1988）；碱解氮含量测定采用碱解扩散法；有效磷含量测定采用碳酸氢钠浸提-分光光度法（NY/T148-1990）；速效钾含量测定采用乙酸铵浸提-火焰光度法（NY/T889-2004）。土壤基本理化性质为粘粒（＜0.002 mm）含量38.45%，容重1.12 g/cm3，pH 4.56，有机质1.13%，全氮1.081 g/kg，全磷0.429 g/kg，全钾2.926 g/kg，碱解氮48.512 mg/kg，有效磷36.241 mg/kg，有效钾92.1 mg/kg。
1.2.3 脲酶活性测定 脲酶活性测定采用苯酚-次氯酸钠比色法（靛酚蓝比色法）［13］。土壤脲酶活性以反应24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克数表示。
式中，M为土壤脲酶活性值（U/g）；X样品为样品试验的光密度值在标准曲线上对应的NH3-N毫克数（mg）；X无土为无土对照中的光密度值在标准曲线上对应的NH3-N毫克数（mg）；X无基质为无基质对照中光密度值在标准曲线上对应的NH3-N毫克数（mg）；N为土壤克数（g）。
1.2.4 数据处理与分析 用Excel 2003和SPSS 15.0软件对数据进行单因素方差分析，各处理间的显著差异采用单因素方差分析（ANOVA），平均值多重比较采用最小显著极差法。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵标准曲线的绘制
吸取配制好的硫酸铵标准溶液10 mL，定容至100 mL，配制成工作液。吸取工作液1、3、5、7、9、11、13 mL，移于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至20 mL，再加4 mL苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20 min后显色定容。1 h后在波长578 nm处比色。重复测定3次取平均值，以硫酸铵浓度为横坐标、以光密度值为纵坐标绘制曲线（图1）。标准曲线方程为y = 0.2188 x +0.0329，R2= 0.9902，线性关系良好。
图1 硫酸铵标准曲线
Fig. 1 Standard curve of ammonium sulfate
2.2 喷施宝对哒螨灵胁迫下土壤脲酶活性的影响
喷施宝对哒螨灵胁迫下茶园土壤脲酶活性的影响见图2。图2表明，药后3 d和5 d，处理Ⅲ的脲酶活性分别为0.5953、0.5971 U/g，而对照为0.5973、0.5787 U/g，差异不显著。喷药第7天，处理Ⅲ的脲酶活性为0.5531 U/g，而对照为0.4491 U/g，尽管随着时间推移，土壤中脲酶活性呈现下降趋势，但只喷施哒螨灵的处理比对照高23%。药后3 d，处理Ⅰ、Ⅱ脲酶活性分别为0.4483、0.4583 U/g，与对照差异显著，分别降低了22%、24%。处理Ⅰ、Ⅱ的脲酶活性也均显著低于处理III，分别降低25%、23%，而处理Ⅰ、Ⅱ间差异不显著。药后5～7 d，处理Ⅰ、Ⅱ的脲酶活性逐渐升高，恢复到与处理Ⅲ、CK没有显著差异。可见，哒螨灵对茶园土壤脲酶活性的影响不显著，而叶面肥喷施宝对茶园土壤脲酶活性的降低有利。
图2 喷施宝对哒螨灵胁迫下土壤脲酶活性的影响
Fig. 2 Effect of Penshibao on soil urease activity under the stress of Pyridaben
2.3 喷施宝对天王星胁迫下土壤脲酶活性的影响
喷施宝对天王星胁迫下茶园土壤脲酶活性的影响见图3。图3表明，药后3、5、7 d，处理III的脲酶活性分别为0.5883、0.5677、0.4737 U/g，而对照分别为0.6007、0.5857、0.4687 U/g，与对照差异不显著。药后3 d，处理I的脲酶活性为0.4977 U/g，处理Ⅱ、Ⅲ及对照分别为0.5893、0.5883、0.6007 U/g，极显著低于其他3个处理，分别下降16%、15%和17%，而其他3个处理间差异不显著。随着处理时间延长，处理Ⅰ、Ⅱ的脲酶活性呈逐渐升高而后下降的变化趋势，药后7 d，其脲酶活性分别为0.4683、0.4067 U/g，此时处理Ⅲ和对照分别为0.4737、0.4687 U/g，处理Ⅰ、Ⅱ的脲酶活性已恢复到与另外两组差异不显著的水平。可见，联苯菊酯对茶园土壤脲酶活性的影响不显著，而叶面肥喷施宝施用早期对茶园土壤脲酶活性的降低有利。
图3 喷施宝对天王星胁迫下土壤脲酶活性的影响
Fig. 3 Effect of Penshibao on soil urease activity under the stress of Bifenthrin
2.4 喷施宝对毒死蜱胁迫下土壤脲酶活性的影响
喷施宝对毒死蜱胁迫下茶园土壤脲酶活性的影响见图4。图4表明，药后3、5 d，3个处理的脲酶活性均显著低于对照。处理第7天，各处理脲酶活性逐渐恢复升高，除处理Ⅲ与对照差异显著外，处理Ⅰ、Ⅱ与对照差异不显著，但其脲酶活性仍高于单独喷施毒死蜱的处理，表明毒死蜱和叶面肥喷施宝对茶园土壤脲酶活性的影响均表现为先显著抑制后逐渐恢复的效应，而在试验早期混合使用喷施宝有利于缓解单独喷施48%毒死蜱1 000倍对脲酶活性的抑制作用。
图4 喷施宝对毒死蜱胁迫下土壤脲酶活性的影响
Fig. 4 Effect of Penshibao on soil urease activity under the stress of Chlorpyrifos
3 讨论
腐植酸叶面肥在提高作物酶活性、增加光合色素、促进光合作用和提高作物抗逆性方面具有显著作用［15］。尽管叶面肥通过作用于叶片为作物提供营养物质，但实际喷施过程中大部分回到土壤环境，尤其是液态有机肥。因此，有关叶面肥复配农药使用对土壤生态环境的影响评价必须引起关注。化学农药进入土壤后，对土壤酶活性产生了一定影响，进而影响土壤生态和土壤质量。土壤酶作为土壤环境变化和监测预警的敏感指标［3，16］，具有较好的应用前景，但目前应用土壤酶评价土壤农药污染水平的研究主要针对单一农药，很少涉及多种农药复配作用的复合污染研究［17］。脲酶是一种重要土壤酶，是对尿素水解起作用的唯一土壤酶，常被用作土壤中微生物活性及土壤质量的指标，在氮肥利用和土壤氮素代谢方面有重要意义［18-20］。近年来，我国农业生产倡导节水农业，水肥一体化栽培技术正被大量推广，水溶性有机肥的使用逐年增加，其中叶面肥与农药混配使用是农业生产中一种新的药肥施用模式，但其对土壤生态环境的影响尚待深入研究。在众多叶面肥中，被誉为“中华肥王”的喷施宝是近年来广泛用于蔬菜、果树、桑树等植物上的增产肥料［21］。喷施宝叶面肥是螯合的超浓缩植物叶面肥，含有作物生长必需的氮、磷、钾、硼、锌、铜、钼等元素和腐植酸、黄腐酸等天然生理活性物质。以黄腐酸为主要成分的喷施宝叶面肥为弱酸性，可与大多数中性或偏酸性农药混用，不产生负面影响［22］。由于土壤中能降解残留农药的酶类来源于植物和微生物，游离在土壤中的酶系会在不利环境条件下被摧毁或钝化［23］，喷施宝叶面肥是否通过影响农药施用背景下茶园土壤微生物的活动从而影响土壤脲酶活性，其作用机理有待进一步探讨。由于本试验采用的3种杀虫剂除主成分外，还有较高含量的农药助剂，这些助剂能否对土壤脲酶活性产生影响值得进一步研究。另外，本试验是在模拟条件下进行的，实际操作过程由于茶园生态环境的复杂性与不稳定性，农药种类、使用方法、使用浓度及其作用机理的差异，都可能对试验结果产生影响，因此，有关叶面肥复配杀虫剂对茶园土壤酶活性的影响也有待进一步探讨。
4 结论
本研究探讨了叶面肥喷施宝复配3种杀虫剂的使用对茶园土壤脲酶活性的影响。结果表明，在试验早期，杀虫剂哒螨灵既不抑制也不激活茶园土壤的脲酶活性，后期却表现为激活效应，脲酶活性比对照高23%。李蓓［14］认为，哒螨灵残留累积对土壤酶系统影响较小。在本试验条件下，哒螨灵对土壤脲酶活性没有显著影响，低浓度哒螨灵对土壤脲酶在施药初期有轻微激活作用，高浓度则处于抑制状态。在整个试验周期，联苯菊酯并不能对茶园土壤的脲酶活性产生显著影响。叶面肥喷施宝结合杀虫剂哒螨灵或联苯菊酯的使用，在试验早期，叶面肥喷施宝均明显抑制了茶园土壤的脲酶活性，随着时间推延，其对茶园土壤脲酶活性的影响逐渐减弱，最终使土壤脲酶活性恢复到原有水平。毒死蜱和叶面肥喷施宝对茶园土壤脲酶活性的影响均表现为先显著抑制后逐渐恢复的效应，而在试验早期混合使用喷施宝有利于缓解单独喷施毒死蜱对脲酶活性的抑制作用。综观整个过程，叶面肥喷施宝对茶园土壤脲酶活性的影响可能与叶面肥激活土壤中微生物的生物量从而导致其脲酶活性的恢复提高有关。
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