【研究意义】板栗（Castanea mollissima Blume）属于壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea），品种约有300多个［1］。目前我国板栗的栽培面积排在世界首位，板栗味道甘美，具有养胃健脾、补肾强筋、活血止血等功效，深受人们喜爱。且栽培历史悠久，因板栗本身适应范围较为广泛，抗逆性较强，同时又方便种植管理，板栗果实产量也相当可观［2］。因此，板栗成为我国最早驯化的经济林果实之一，广西目前主要板栗栽培地点集中在河池、百色、桂林、南宁、凭祥等地。但随着板栗种植面积的扩大，板栗落果及果实病害的发生也日益严重，病害严重的甚至导致果实腐烂、脱落，严重影响板栗产量。因此，对板栗采前落果及果实病害进行深入调查及防治方法具有现实意义。【本研究切入点】目前，板栗是隆安县一个林业产业，在精准扶贫中起到重要作用。由于板栗产业发展迅速，已成为隆安县农民的重要经济收入来源，为广西农民收入增长提供了强有力的支持。【前人研究进展】目前已报道的文献多为板栗种植或栽培等方面的研究，病害方面也只是对板栗叶、枝上发生的病害，未见对板栗果实病害方面的研究报道，缺乏针对广西西北部板栗病虫害调查及防治等方面的研究［3］。【拟解决的关键问题】为明确广西隆安县板栗采前落果及果实病害的发生情况，在隆安县定军村种植区开展板栗落果及病害种类调查，对其病原菌进行形态学鉴定、致病性试验［4］，并进行采前落果及果实病害田间药剂防治试验，选出有效防治的药剂，为板栗落果及果实病害防治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验地位于广西南宁市隆安县古潭乡，属于南亚热带季风气候，年平均气温21.7℃，极端低温-0.8℃，年均降雨量1 310.1 mm，年均蒸发量1 652.5 mm，空气相对湿度80%，日照充足，四季差异较小，按平均候温统计，该地区属于春秋相连，夏长无冬或基本无冬，四季皆适宜耕作的地区［2］。土壤类型为赤红壤，土层深厚，高达1 m以上，土壤pH值为4.71，属于酸性土壤。
供试林分为隆安县古潭乡定军村14 年生板栗林，树高4～6 m，平均冠幅2.3 m×2.4 m，平均地径22.5 cm，株行距5.0 m×4.5 m，郁闭度0.9。
病果于2017年8月26日采自隆安县定军村种植园“双季板栗”品种果仁变黑病果。接种果采自隆安县定军村种植园“双季板栗”品种健康果。
1.2 板栗果实病害危害情况调查方法
普查法：在2017年6月7日发病盛期进行调查，对隆安县板栗采取多点调查，共1～2次，在晴天中午以后调查。同一林分内采取5点取样，每点果实取样数量不少于30个，观察记录发病果实数量，计算病果率和病情指数。调查记录林分概况、起源、土壤情况、海拔、管理措施。
系统调查：2017年7—8月果熟期至收果期，每隔5 d，在调查林分内采取5点取样，每点果实取样数量不少于30个，观察记录发病果实数量，计算发病率和病情指数，绘出田间病害消长曲线［5-6］。
1.3 果实主要病害的病原菌分离及纯化［7-8］
1.3.1 病原菌培养 将病果用清水冲洗干净，用0.1%氯化汞溶液浸泡消毒5～8 min，无菌水漂洗3次，将漂洗过的材料置于提前放有无菌滤纸的培养皿中，吸去表面水分后，在病害处取5 mm大小的小块，将组织块接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上，每皿放 4～5个组织块，每个组织部位重复5～6皿，于25℃恒温培养箱中黑暗培养。
1.3.2 病原菌分离及纯化 据菌落形态、菌丝颜色、菌落边缘形状等特征，对菌落进行分类，在无菌环境下用镊子分别将不同菌落的菌丝置于新的PDA培养基培养。待菌丝长出后，用接种针从菌落边缘挑取新鲜的菌丝接种到新的PDA平板上纯化培养，反复纯化培养，直至得到单一的菌种，对所得菌种进行记录，并且将纯化后的菌种接种至PDA斜面培养基的试管中置于4℃冰箱备用。
1.3.3 病原菌的形态学鉴定 对纯化后的菌株进行镜检，应将纯化后保存在4℃冰箱的菌种进行活化，然后取菌丝接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，放入25 ℃恒温黑暗培养箱中培养一定时间后观察其菌落形态、颜色等特征。采用插片法培养，在已接有病原菌的PDA培养基上45°角插入已经灭菌的盖破片，一定时间后取出，放于载破片上进行镜检。并做好拍照记录。根据菌落生长特征和显微镜下形态判断丝状真菌的种类。
1.3.4 病原菌致病性试验 接种前，挑取菌落边缘菌丝接种于PDA培养基上活化5 d后，再接种。选择健康、大小基本一致的果实。将培养已活化的病原菌，用打孔器（直径大小约为5 mm）打出大小一致的菌丝块，进行活体接种和离体接种。接种方式设针刺伤法和无伤接种法两种，并以同大小空白PDA培养基处理作为空白对照。每接种方式不同处理均设置3次重复。试验所用的板栗果实为健康无组织病害的近熟期果，并且接种前用75 %酒精消毒10 s，用无菌水冲洗3次以上。对于板栗果实的离体接种，根据其组织面积大小接种不同数量菌丝块使用吸满无菌水的滤纸放入一定大小的无菌培养皿中，并定期喷洒无菌水进行保湿，各处理均置于25℃左右条件下进行保湿培养，每天观察并记录发病情况。活体接种，将5 mm菌丝块接种至75%酒精消毒并用无菌水冲洗3次的健康板栗果实，用无菌纸压于菌饼上，再用橡皮筋固定，然后套袋保湿。使用5 mm空白PDA培养基块处理作为空白对照。每种菌株及对照接种果实数为30个，设置3次重复。对于接种后发病的植株，对发病部位进行病原再分离。若能得到相同的菌株，则可以确定其致病性；反之，则不能。
1.3.5 田间防治试验方法 田间防治试验地选择隆安县定军村板栗示范基地，试验时间为2017年7—8月，选择12年板栗作为施药对象，田间防治试验药剂的选择参照已有文献中报道的对果实病原菌杀菌效果最强的杀菌剂以及市场内对板栗果实病害防治效果最强的单剂或混剂杀菌剂，即选择2%春雷霉素800倍液、40%苯醚甲环唑1 000倍液、2%春雷霉素+40%苯醚甲环唑800～1 000倍液、20%噻菌铜800倍液及40%多菌灵800倍液进行田间防治试验，以清水为对照。因地势原因板栗种植不规则，因此小区设随机区组试验，集中地区随机区组设置6个小区，每个小区7株板栗，每小区对应一种不同药剂及清水对照，保证同一片地区每种处理的板栗株树一致，每个处理3次重复。共喷药3次，每次间隔15 d，最后一次喷药15 d后调查板栗落果及发病情况。
试验数据采用Excel软件进行统计分析，对统计结果采用SPSS21.0进行单因素方差分析及多重比较。
2 结果与分析
2.1 果实病害调查结果分析
调查结果（表1）显示，隆安县板栗果实发病率在所调查的5个样点中最小值为18.18%，最大值为38.00%，平均发病率为25.63%，病害严重影响果实质量和产量，降低果农经济收入，其次收获期被感染的栗果与好果无明显区别，但食用时具有苦味，感染严重的栗果在表面形成腐烂型、褐斑型和黑斑型3种坏死斑点［9］。
表1 病果率调查结果
Table 1 Investigation result of the diseased fruit rate
发病率Disease rate（%）样点数Sample number果苞数（个）Fruit bud number总果实数（粒）Total fruit number发病果实数（粒）Diseased fruit number 1 50 152 43 28.29 2 50 155 35 22.58 3 50 143 26 18.18 4 50 149 31 20.81 5 50 150 57 38.00平均Average value 50 149.8 38.4 25.63
2.2 致病性试验结果分析
通过致病性试验，将果实采摘并去苞处理，对病果进行统计分析［10-12］，结果（表2）表明：接种不同菌株栗果发病率最大值为37.87%，最小值为24.35%，各处理平均发病率为29.97%；接种B、F菌株板栗果实病害发病率均高于空白对照，差值最大为7.90%；接种A、C、D、E菌株发病率均小于空白对照，最大差值为5.62%。致病性试验后将病果病害部位进行培养、分离及纯化，最终得到3种菌株编号为B、D、F，与前期实地调查果实病害相一致，其病害发病率分别为29.17%、29.32%、37.87%。
2.3 菌株形态学鉴定
从发病果实样本上经多次分离纯化及致病性试验得到3种菌株，编号为B、D、F（表2）。根据菌落形态、菌落颜色、菌落质地、生长速度、菌丝生长状况及40倍镜检等方面分析。菌株B在PDA 培养基28℃培养10 d即可长满平板，生长初期为砖红色、质密，随着菌丝增长后期为粉色，菌丝较发达短绒状，生长速度慢，经40倍显微镜镜检，菌丝成树枝状，有分支，稍弯曲，淡绿色。菌株D在PDA培养基28℃条件下菌落生长速度较快，整个菌落整齐而平坦，气生菌丝绒状或棉絮状，菌落初期为白色，生长中期菌落中间出现灰黑色，后期渐变为黑色，在电子显微镜下观察呈丛生网状，有分支，淡绿色。菌株F 在 PDA 培养基28℃条件下菌落生长初期为淡粉色，后期为白色，椭圆形，边缘缺刻，菌丝不发达，短绒状，经镜检菌丝呈树枝状，有分支球形，分生孢子梗数根丛生，具隔膜，稍弯曲，分生孢子聚生于小梗上，呈卵圆形或椭圆形，单胞，大小为8～14µm×7～11 µm，无色至淡色透明。
表2 致病性试验统计结果
Table 2 Statistical results of pathogenicity test
分离得到病原菌种类Pathogenic bacteria species A 90 271 66 24.35 B F B 90 267 91 34.08 B F C 90 273 76 27.84 B F D 90 264 77 29.17 B D F E 90 269 73 27.14 B F F 90 272 103 37.87 B D F CK 90 266 78 29.32 B D F平均Average value 90 267 81 29.97病原菌Pathogen接种果数（个）Inoculated fruits number总果实数（粒）Total fruit number发病果实数（粒）Diseased fruit number发病率Disease rate（%）
2.4 不同杀菌剂处理对板栗落果率及发病率的影响
本试验结果（表3）显示，各处理平均落果率在10.60%～43.54%之间。5种杀菌剂处理对板栗落果均有一定防治作用，其中多菌灵杀菌剂防治效果最佳，落果率为10.60%，苯醚甲环唑、噻菌铜、春雷霉素+苯醚甲环唑和春雷霉素4种处理落果率分别为20.67%、22.78%、24.52%和30.24%。结果表明落果率与对照相比均表现极显著差异，且5种杀菌剂处理之间表现显著差异，说明5种杀菌剂处理对板栗落果有一定的防治作用。
表3 不同杀菌剂处理对板栗落果率及果实病害率的影响
Table 3 The effects of different fungicides treatment on the rates fruit drop and fruit diseases of chestnuts
注: 同列数据后大写英文字母不同者表示差异极显著。
Note: Different capital letters in the same column represented extremely significant difference.
落果率（%）Nut drop rate处理Treatment果实病害率（%）Fruit disease rate多菌灵Carbendazim春雷霉Kasugamycin 19.69±2.18E 25.09±0.91D苯醚甲环唑Diphenoxazole 20.67±8.33E 28.52±2.26B噻菌酮Thiodiazole-copper 22.78±2.64D 26.53±4.95C春雷霉素+苯醚甲环唑Kasugamycin + diphenoxazole 10.60±1.97F 30.24±8.10B 24.52±5.72C 33.49±1.76A CK 43.54±7.70A 29.63±1.62A
由表3可知，在果实发病率中，各处理发病率最小为19.69%，最大为33.49%，总体平均值为27.16%。其中春雷霉素+苯醚甲环唑处理发病率最高，比空白对照高3.86个百分点，多菌灵药剂处理果实发病率为19.69%，在6种处理中发病率最低，且与其余5种处理存在较大差异。
3 讨论
本研究对广西隆安县板栗落果及病害情况进行调查，发现该地域板栗采前落果主要是病害发生导致，感染严重的病果出现腐烂型、褐斑型、黑斑型等症状，这一调查结果与侯保林等［13］研究的栗仁斑点病有相似之处。板栗果实病害的发生与环境、栽培技术及管理措施存在一定的关联性，为寻找板栗病害发生的主导因子，提出较好的营林措施。因此防治落果首先要加强管理技术，通过科学筛选杀菌剂，加强药物用量或开展合理喷药［14-16］。但因农药是多分子化学药品，在自然状态下大量使用不易挥发降解，对生态环境和人体有害，在生产上推广应用一定浓度的农药勿过量，为了避免增强此类病害的抗药性，多菌灵可以与上述3种杀菌剂交互使用［17］。由调查数据可知，对于板栗病害防治更应加强栗林管理，减少树体损伤，提高树势，采用预防为主综合治理的手段，化学、物理及生物防治技术相结合，充分发挥各防治技术优势，取长补短，发挥总体作用，最终达到全面防治效果［18］。
4 结论
通过对14年生板栗果实落果及病害防治，结果表明：在自然生长状况下，板栗采前落果和果实发病率随着树龄的增大，其落果率及发病率上升。板栗在自然生长状态下其发病率最高可达38.00%，最低达18.18%，平均为25.63%。但若进行多菌灵杀菌剂科学合理喷施，其发病率可明显下降到19.69%。5种杀菌剂处理中，多菌灵对板栗病害防治效果最好，发病率最低；苯醚甲环唑、春雷霉素+苯醚甲环唑、噻菌酮也有一定防治效果［19］。在采果前，选择应用多菌灵800倍液在7—8月果实近熟期喷洒3次，效果显著。另外，通过对果实病害部位的分离、纯化及致病性试验最终得到3种编号为B、D、F的菌株，与前期实地调查果实病害相一致。
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