【研究意义】荔枝是一种广受欢迎的鲜食水果，消费者对荔枝果品的质量和食用安全更为关注和敏感。荔枝生产中普遍施用有机肥，其中以禽畜粪肥最为常见[1]。由于近年在蔬菜作物上的大部分研究均认为施用禽畜粪肥会提高蔬菜重金属含量，社会上出现荔枝果实会被禽畜粪肥中重金属污染的观点，部分荔枝种植户甚至拒绝施用粪肥。因此，研究禽畜粪肥中金属在荔枝果实的累积及对果实品质的影响，回答含金属粪肥能否在荔枝上施用的疑问，并促进粪肥在荔枝的合理安全施用，具有重要意义。【前人研究进展】为了防治禽畜疾病、促进禽畜生长和提高饲料报酬，禽畜饲料中通常添加微量元素（金属元素）添加剂。然而，由于禽畜对金属的利用率较低，大部分金属随粪尿排出，导致禽畜粪中金属残留较高[2-6]。而且，粪肥中的金属主要以可提取态存在，生物有效性和移动性较高[7-8]。施用含金属残留的禽畜粪，可显著提高蔬菜的Cu、Zn、As、Cd等含量[8-12]。【本研究切入点】目前施用含金属的禽畜粪对作物吸收累积金属影响的研究，主要集中在蔬菜作物上，罕见在多年生木本果树作物上的报道。荔枝是我国最重要的热带亚热带果树，树体吸收和果实累积来自粪肥的金属的能力尚不清楚。【拟解决的关键问题】本研究采集含有高金属残留的猪粪，在华南地区典型荔枝园连续施用3年，以明确荔枝果实品质及金属含量随猪粪施用量及施用年限提高的变化，为高金属残留的粪肥能否在荔枝上施用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验于2015—2018年在广州市增城区荔城街东林果场（113°45′56.32″E、23°14′33.85″N）进行。试验地土壤类型为赤红壤，质地为砂质黏壤土，土壤pH为4.2±（0.2），有机质含量14.1（±0.2） g/kg，碱解氮 44.9（±1.2） mg/kg，有效磷1.0（±0.2） mg/kg，速效钾 23.0（±1.0） mg/kg，有效钙 93.6（±1.6） mg/kg，有效镁7.7（±0.2） mg/kg，有效铁 26.6（±1.2） mg/kg，有效锰 1.2（±0.1） mg/kg，有效铜 0.8（±0.1） mg/kg，有效锌 0.9（±0.2） mg/kg。该园土壤酸性强，土壤肥力整体较低。
1.2 试验材料
试验用猪粪每年均采集于肇庆市四会区龙莆镇某猪场。猪粪不添加其他物质，约堆沤1个月后施用。堆沤后猪粪基本性质见表1。
表1 2015—2018年所用猪粪基本理化性质
Table 1 Basic physicochemical properties of pig manure used during 2015-2018
年份Year pH总锌Total Zn（mg/kg）2015 6.75 615.7±2.0 36.0±2.5 14.7±1.1 15.2±1.5 3338±96 711±40 791±0.2 2954±35 2016 6.81 508.1±1.6 20.9±0.0 30.6±0.0 12.5±0.0 3490±74 741±10 178±3.0 1280±23 2017 6.37 593.8±1.6 34.5±0.0 13.4±0.0 12.4±0.0 6974±82 243±1 590±6.0 855±10有机质Organic matter（g/kg）全氮Total N（g/kg）全磷Total P（g/kg）全钾Total K（g/kg）总铁Total Fe（mg/kg）总锰Total Mn（mg/kg）总铜Total Cu（mg/kg）
供试荔枝品种为妃子笑，树龄15年，种植密度5 m×5 m。选取大致等高种植、长势基本一致的荔枝树作为试验树。
1.3 试验方法
试验设4个猪粪用量处理，分别为0（CK）、20、40、80 kg/株，每个处理3次重复，每个重复2株树。2015—2018年，每年采果后在每株树滴水线下挖3～4条施肥沟，在施用等量复合肥的基础上，按不同处理施入经堆沤的猪粪。试验树的田间管理措施与生产完全一致。
1.4 样本采集和测试
在每年果实集中收获期，在每株树不同方位采集果实80个，以两株树的果实合并作为1个重复的样本。果实带回实验室后再次混匀，马上将果皮、果肉和果核剥离。用搅拌机将果肉制为匀浆，用WYT（0～80%）手持糖量计测定果肉固形物含量，用费林试剂法测定可溶性糖含量，用中和滴定法测定可滴定酸含量，用pH计测定果肉匀浆pH值。同时，果肉鲜样均用硝酸-高氯酸消解法消解，然后用原子吸收分光光度法测定Fe、Mn、Cu 和 Zn 含量[13]。
2016年，果实游离氨基酸用茚三酮柱后衍生法测定。果肉用酸水解法进行前处理，过滤后直接上机测定游离氨基酸含量[14]。所用氨基酸分析仪为日立L-8900型，配备色谱柱为日立855-4507型。检测条件：柱温为程序变温，反应柱温为135℃；柠檬酸（锂）pH缓冲液梯度洗脱，流速为洗脱泵0.35 mL/min，衍生泵为0.30 mL/min；检测波长为570 nm+440 nm，分析时间为148 min。检出的氨基酸包括风味氨基酸、γ-氨基丁酸等共28种，其中，天冬氨酸+赖氨酸+谷氨酸为鲜味氨基酸，甘氨酸+丙氨酸+苏氨酸+丝氨酸+组氨酸+脯氨酸为甜味氨基酸，缬氨酸+蛋氨酸+异亮氨酸+亮氨酸+精氨酸为苦味氨基酸，酪氨酸+苯丙氨酸为芳香族氨基酸，总游离氨基酸则为所有检出氨基酸之和。另外，果皮和果核经105℃杀青、70℃烘干后粉碎制样，用硝酸-高氯酸消解法消解，然后用原子吸收分光光度法测定Fe、Mn、Cu和Zn含量。
2017年，用便携式光合仪（美国PP Systems公司，TPS-2型）测定果实膨大期叶片光合作用参数，包括蒸腾速率、气孔导度、净光合速率和胞间CO2浓度。
2018年，用果皮和果核鲜样测定Fe、Mn、Cu和Zn含量。
试验数据用Excel进行处理并作图，用SAS 9.0进行统计分析，用Duncan's法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 不同猪粪用量处理对荔枝叶片光合作用的影响
荔枝果实膨大期叶片光合参数测定结果（表2）显示，与不施用猪粪的对照相比，3个施用猪粪处理均不同程度降低叶片蒸腾速率和气孔导度，但处理间胞间CO2浓度差异未达显著水平。施用猪粪虽然有降低叶片净光合速率的趋势，但处理间差异也未达显著水平。这表明施用猪粪整体上对荔枝叶片光合作用影响并不大。
2.2 不同猪粪用量处理对荔枝果实品质的影响
3年荔枝果实品质测定结果（表3）表明，同一年份不同处理的果实可溶性固形物含量差别不大，果实pH、可溶性糖、可滴定酸含量、糖酸比虽然在某一年份存在差异，但3年间不同处理上述品质指标的变化差异并不相同，未表现出明显一致的规律。然而，不同年份间的果实品质数据差异显著，果实pH呈现逐年递增，而可溶性固形物、可溶性糖、可滴定酸含量呈逐年降低的规律。整体而言，猪粪用量对某一年的荔枝果实品质影响不大，但年份间的品质差异显著。
表2 果实膨大期不同猪粪用量处理荔枝叶片光合作用参数（2017）
Table 2 Photosynthetic parameters of litchi leaf at fruit swelling stage with various pig manure consumption (2017)
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
猪粪用量Pig manure consumption净光合速率Net photosynthetic rate（μmol/m2·s）0 （CK） 1.27±0.57a 95.10±52.21a 282.19±85.72a 5.43±2.17a 20 kg 0.70±0.39b 58.29±31.93b 301.40±118.79a 4.66±1.92a 40 kg 0.96±0.46ab 73.88±47.07ab 249.65±306.42a 4.60±2.36a 80 kg 0.71±0.290b 61.38±28.2b 253.42±50.56a 4.51±2.11a蒸腾速率Transpiration rate（mmol/m2·s）气孔导度Stomatal conductance（mol/m2·s）胞间CO2浓度Intercellular CO2 concentration （mg/L）
表3 不同猪粪用量处理荔枝果实品质
Table 3 Fruit quality of litchi in treatments with various pig manure consumption
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
年份Year糖酸比Sugar-acid ratio 2016 0 （CK） 4.59±0.10a 19.30±0.42a 17.37±0.06a 0.28±0.03a 63.4±6.5ab 20 kg 4.65±0.07a 18.80±0.35a 17.35±0.93a 0.25±0.01a 69.0±5.6a 40 kg 4.55±0.02ab 19.00±0.35a 16.65±1.17a 0.29±0.01a 58.3±4.2b 80 kg 4.46±0.07b 19.27±0.76a 17.21±0.17a 0.30±0.03a 57.6±5.4b 2017 0 （CK） 4.91±0.12a 18.80±1.00a 14.76±0.38ab 0.23±0.01ab 63.0±3.8bc 20 kg 5.00±0.08a 20.00±0.10a 15.10±0.28ab 0.24±0.01a 62.2±3.6c 40 kg 5.12±0.20a 18.67±0.45a 14.53±0.36b 0.20±0.02c 73.0±7.8a 80 kg 5.10±0.07a 19.67±0.35a 15.28±0.27a 0.21±0.01bc 71.6±1.4ab 2018 0 （CK） 5.34±0.07a 15.13±1.17a 11.68±0.41a 0.18±0.02a 67.2±7.3a 20 kg 5.22±0.22a 14.60±1.44a 11.68±0.25a 0.18±0.02a 67.3±8.9a 40 kg 5.25±0.14a 15.73±0.23a 12.00±0.07a 0.17±0.01a 70.3±5.3a 80 kg 5.25±0.12a 15.67±0.23a 12.14±0.25a 0.18±0.01a 69.3±3.6a Pig manure consumption pH 可溶性固形物Total soluble solid （%）猪粪用量可溶性糖Soluble sugar（%）可滴定酸Titratable acid （%）
游离氨基酸含量是评价水果及水果加工品的重要依据[15-16]。2016年果实游离氨基酸含量测定结果表明，不同处理果肉鲜味氨基酸、苦味氨基酸和芳香族氨基酸含量均未具有统计意义的差异（表4）。与对照相比，除施用猪粪20 kg/株提高果肉甜味氨基酸含量的作用未达显著水平外，施用猪粪40和80 kg/株均显著提高甜味氨基酸含量；-氨基丁酸含量则以40 kg/株处理最高，明显高于对照及20 kg/株处理，显著高于80 kg/株处理；不同处理的果肉总游离氨基酸含量虽然仍以40 kg/株处理最高，但处理间的差异均未达显著水平。整体而言，施用40 kg/株猪粪可提高果实风味，如猪粪用量进一步提高，则反而未观察到这种作用。
表4 不同猪粪用量处理荔枝果实总游离氨基酸及风味氨基酸含量（mg/mL）
Table 4 Flavor amino acid and total free amino acid contents in litchi fruits with various pig manure consumption(mg/mL)
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
猪粪用量Pig manure consumption总游离氨基酸Total free amino acid 0 （CK） 0.67±0.07a 1.41±0.08b 0.63±0.06a 0.15±0.04a 1.11±0.11ab 4.73±0.17a 20 kg 0.78±0.14a 1.55±0.10ab 0.74±0.03a 0.17±0.03a 1.10±0.16ab 5.17±0.29a 40 kg 0.68±0.10a 1.66±0.04a 0.76±0.13a 0.17±0.03a 1.28±0.20a 5.29±0.29a 80 kg 0.72±0.13a 1.62±0.12a 0.62±0.08a 0.12±0.03a 1.00±0.07b 4.75±0.33a鲜味氨基酸Flavor amino acid甜味氨基酸Sweet amino acid苦味氨基酸Bitter amino acid芳香族氨基酸Aromatic amino acid γ-氨基丁酸γ-ABA
2.3 不同猪粪用量处理对荔枝果实金属含量的影响
荔枝果肉金属含量测定结果显示，连续3年施用猪粪，仅2017年处理间果肉Mn含量存在统计学上的差异，但果肉Mn含量未随猪粪用量的增加而提高；其他年份施用猪粪处理果肉的Fe、Mn、Cu、Zn含量与对照差别不大，果肉4种金属含量与猪粪用量也未表现出密切关系（图1）。
荔枝果肉金属含量方差分析结果显示，虽然不同处理间果肉Fe含量差异达到显著水平，但果肉Fe含量并未随猪粪用量的增加而显著提高；不同处理果肉Mn、Cu、Zn含量差别不大（表5）。另外，除果肉Cu含量外，不同年份果肉Fe、Mn、Zn含量均存在显著差异。然而，仅有果肉Zn含量随猪粪施用年限的增加而提高，果肉Fe和Cu含量并未出现同样的规律。
表5 不同猪粪用量处理荔枝果肉金属含量方差分析
Table 5 Analysis of variance for metal contents in litchi pulp with various pig manure consumption
因素Factor 效应Effect Fe Mn Cu Zn处理Treatment 0（CK） 1.82 0.66 1.88 2.36 20kg 1.73 0.74 1.94 2.21 40kg 1.93 0.71 1.85 2.24 80kg 2.07 0.71 1.84 2.42年份Year 2016 1.26 0.66 1.94 2.17 2017 2.22 0.62 1.95 2.26 2018 2.11 0.84 1.74 2.49 P值 处理 0.005 0.407 0.875 0.454年份 ＜0.001＜0.001 0.134 0.048处理×年份 0.137 0.412 0.635 0.738
图1 不同猪粪用量处理荔枝果肉金属含量比较
Fig.1 Comparison of metal contents in litchi pulp in treatments with various pig manure consumption
荔枝果皮和果核金属含量测定结果显示，2015年施用猪粪80 kg/株，2016年荔枝果皮Cu含量、果核Fe和Zn含量均比其他处理显著提高，对果皮和果核其他金属含量影响不大；施用猪粪20和40 kg/株处理果皮和果核的4种金属含量均与对照没有显著差异（图2）。连续施用猪粪3年后，2018年不同处理间仅有果核Fe含量具有统计学上的差异，但Fe含量并未随猪粪用量的增加而提高；不同处理果皮和果核其他金属含量均差别不大，但果皮Mn含量有随猪粪用量增加而提高的趋势。
图2 不同猪粪用量处理荔枝果皮和果核金属含量
Fig.2 Metal contents in litchi peel and seed in treatments with various pig manure consumption
由于粪肥中金属并未明显影响荔枝果肉4种金属含量，而且每年不同处理果肉其他品质（pH、可溶性固形物、可溶性糖和可滴定酸含量、糖酸比及游离氨基酸含量）也缺乏某种明显一致的差别，因此，粪肥中金属含量对荔枝果实品质并未产生不良影响。
3 讨论
3.1 施用高含量金属猪粪引起荔枝果实金属污染的风险
我国目前还没有针对畜禽粪农用的重金属限量标准。《畜禽粪便安全使用准则》（NY-T 1334-2007）对畜禽粪的As、Cu和Zn含量作出了限定，对Fe和Mn含量则未进行限定。根据该准则规定的土壤pH水平及作物类别来衡量，本研究所用猪粪Cu含量分别超标97.8%（2015）和47.5%（2017），Zn含量分别超标146.2%（2015）和6.7%（2016）。我国最新的饲料卫生标准（GB 13078-2017）已将饲料有机胂添加剂禁用，因此，本研究不对饲料和鸡粪中的As含量进行探讨。
本试验结果表明，即使猪粪中含有数百甚至数千mg/kg的Fe、Mn、Cu、Zn，连续3年施用猪粪并未提高果肉4种金属含量，对果皮和果核4种金属含量也没有连续的、明显一致的影响。这说明来自猪粪的4种金属难以累积到荔枝果实，主要原因可能是：（1）荔枝树体高大，根系吸收的金属难以长距离运输累积在果实；（2）果树每年采果后均进行修剪，将原来累积有金属的结果母枝剪去，新抽生的秋梢老熟后作为翌年结果母枝，累积的金属相对较少。由于施用粪肥人力成本高，荔枝生产上果农较少连续每年大量施用粪肥，多数为每隔1年施用粪肥，而且用量通常为数十千克以内。因此，即使禽畜粪中含有较高含量的金属，常规施用粪肥显著提高荔枝果实金属含量的风险很低。
3.2 我国食品金属含量限量标准的变化
我国食品中铁限量标准（GB 15200-94）中并没有针对水果的限量标准，食品中铜限量卫生标准（GB 15199-94）中水果Cu限值为≤10 mg/kg，食品中锌限量卫生标准（GB 13106-91）中水果Zn限值为≤5 mg/kg。上述标准均已在2011年1月1日废止。此外，我国一直未出台针对水果Mn含量的限量标准。在我国最新的食品安全国家标准（GB 2762-2017）中，对水果的Fe、Mn、Cu和Zn含量均未作出限定。由此可见，即使施用含Fe、Mn、Cu和Zn残留较高的鸡粪，也不会出现荔枝果实被这些金属污染的问题。
Fe是几乎所有生物的必需营养元素，它广泛参与各种代谢过程，如氧气运输、DNA合成和电子运输等[17]。世界上有19.7亿人患有贫血，其中50%～80%由于缺Fe造成，故缺铁性贫血成为一个全球关注的健康问题[18-19]。植物和动物缺Cu和Mn也是一个世界性问题，尤其在土壤高pH的地区[20]。另外，世界范围内人体Zn毒害极为罕见，而缺Zn则普遍存在，缺Zn对人体生长、神经发育和免疫能力均有伤害，由于营养不良及食物Zn有效性低造成的缺Zn健康风险，远远大于Zn毒害的风险[21]。因此，施用粪肥提高荔枝果实Fe、Mn、Cu和Zn含量而影响人体健康的风险极低。
4 结论
在荔枝上连续3年以0～80 kg/株的用量施用高含量Fe、Mn、Cu、Zn的猪粪，对荔枝叶片光合作用和果实品质并没有明显一致的影响，果实中4种金属含量也未随猪粪用量的增加或施用年限的增加而提高。因此，即使养殖场禽畜粪肥含有较高金属残留，以常规方式在荔枝上施用，引起荔枝果品质量安全问题的风险很低。
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