【研究意义】黑水虻Hermetia illucens L.隶属双翅目Diptera水虻科Stratiomyidae扁角水虻属Hermetia，又名亮斑扁角水虻。可通过取食有机废弃物产出新型动物饲料及有机肥，是当前研究较多的一种资源昆虫[1-5]。国内外学者对黑水虻幼虫和成虫的生物学特性进行了较多研究[6-8]，但关于冷藏黑水虻虫卵的报道甚少。【前人研究进展】Holmes等对虫卵孵化的发育起始温度进行研究，认为黑水虻卵发育的起始温度在 12～16 ℃[9]。Shaphan等在研究温度和饮食对黑水虻生长发育的影响中发现：10 ℃时，虫卵无法孵化；15 ℃冷藏14 d，虫卵孵化率为10.6%（±2.1）%；20 ℃冷藏8 d，孵化率为59%（±10.6）%，冷藏效果不理想[10]。【本研究切入点】我们认为虫卵冷藏后无法顺利孵化的原因有以下几点：一是冷藏温度低于虫卵发育起始温度，同时未采用正确手段使虫卵休眠或滞育，虫卵死亡；二是冷藏过程中湿度不适宜，低温环境中，空气中水分低，虫卵易脱水死亡，而湿度过高时，水汽在虫卵表面凝结，虫卵死亡；三是虫卵储存的营养物质在冷藏过程中消耗过快，无法支撑虫卵正常孵化；四是基于Mazur提出低温对卵的伤害随卵的发育而减轻的观点[11]，推测不同发育阶段的虫卵对低温的耐受性不同。【拟解决的关键问题】综合以上4点考虑，为提高冷藏虫卵的孵化率，本试验将黑水虻卵发育划分为卵裂期、胚盘胚带形成期、原肠形成期、胚体分节期、破壳期（因体壁形成期与器官形成期发育时间交叉，故本研究统一为破壳期）5个时期，并将5个发育时期的虫卵分别在温度为12 ℃、湿度为80%环境中进行冷藏。姬越等研究了黑水虻发育的适宜温度，认为黑水虻孵化的最佳温度为32℃，此温度下孵化历期最短、初孵幼虫最多[8]。参照其研究结论，本实验将冷藏过后的虫卵转置于32 ℃的环境中孵化，以虫卵孵化80%为基准线验证发育阶段对虫卵冷藏后孵化率及幼虫生长发育的影响，以期为黑水虻规模化生产苗种培育环节提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试虫卵 黑水虻虫卵由广州安芮洁环保科技有限公司提供。幼虫取食餐厨垃圾，饲养温度为30（±2） ℃。成虫饲养温度为28 （±3）℃，相对湿度为50%～90%，自然光照。待成虫交配，采集集卵板上的初产卵块，卵块的产卵间期不超过2 h。试验于2018年6月至2019年3月在广州安芮洁环保科技有限公司实验室进行。
1.1.2 幼虫饲料 初孵幼虫取食含水量70%的麸皮，5～15日龄幼虫取食含水量75%的餐厨浆料。幼虫饲料及试养方法由广州安芮洁环保科技有限公司提供。
1.2 试验方法
1.2.1 黑水虻虫卵胚胎发育期 参照莫文艳等的方法，单克初产虫卵采用41 000个卵粒进行养殖参数计算。黑水虻虫卵在32 ℃气候箱（宁波赛福实验仪器有限公司，PRX-350B）发育8.5 h形成“瓶”状的胚带，发育13 h为原肠形成期，发育30 h体壁开始背合，48 h后为破壳期。
1.2.2 虫卵冷藏与孵化 收集产卵时间相差不超过2 h的虫卵9 g，用分析天平称量18份0.5 g的样品平铺（铺放厚度不高于3 mm）在小培养皿内，试验设冷藏初产虫卵、冷藏胚盘胚带形成期虫卵、冷藏原肠期虫卵、冷藏体壁背合期虫卵、冷藏破壳期虫卵、32℃直接孵化的初产虫卵（对照）6个处理，分别记为A、B、C、D、E、CK，每个处理3次重复。除处理A外，其余处理均置于孵化气候箱（32℃，RH 80%，光周期14L∶10D）保存。随后立即对处理A进行镜检，记录虫卵发育阶段和存活率后放置到冷藏气候箱。隔6 h，从孵化气候箱取出处理B镜检；隔13 h取出处理C镜检；隔30 h取出处理D镜检；隔40 h取出处理E镜检，各自镜检完毕后均放置到12℃冷藏气候箱保存。对照一直置于32℃的孵化气候箱，直至自然孵化。对放进冷藏气候箱冷藏的各处理，每隔24 h，随机取样置于载玻片上，每个载玻片上100个虫卵，3次重复，将载玻片放入孵化气候箱进行孵化，每天镜检发育情况，利用显微镜计数未孵化卵数（D），计算孵化率（S），直至孵化率低于80%。
1.2.3 原肠期卵冷藏处理及初孵幼虫总重测定 在12个直径为10 cm的孔径0.180 mm分级筛上分别称量1 g初产虫卵置于孵化气候箱，发育到原肠期后转移到冷藏气候箱分别冷藏0、5、10、15 d（4个处理，每个处理3次重复），而后转移回到孵化气候箱。将分级筛放在直径为15 cm的培养皿内，培养皿内部四周边缘均匀撒3 g玉米粉。待幼虫孵化后，称量初孵幼虫和玉米粉的总质量，计算初孵幼虫质量。然后将初孵幼虫和玉米粉一起撒到250 g含水量70%的麸皮上方（麸皮厚度约10 cm，置于容器中部，容器为40 cm×60 cm×10 cm的塑料盒），并用勺子轻轻拨开初孵幼虫，避免玉米粉结球发粘导致幼虫死亡。
1.2.4 不同冷藏时间原肠期卵5日龄幼虫存活率 养殖5 d，幼虫取食完开口料后，利用幼虫避光的习性，将堆积在幼虫表面的麸皮残渣轻轻抹去，直至只剩幼虫。然后将麸皮残渣放在孔径0.250 mm筛网上，筛网放在阳光下，让残渣内残留的极少量幼虫掉落到筛网下方的培养皿内。将收集到的幼虫称量总重，随机取样3个，用分析天平称量并记录重量（每个样品重量约0.1 g），计数幼虫数量，计算5日龄幼虫存活率：
1.2.5 冷藏5、10、15 d原肠期卵15日龄幼虫存活率和幼虫重量 初孵幼虫在麸皮中取食5 d将幼虫轻轻筛出并转移到1 kg含水量70%的餐厨浆料（浆料厚度约3 cm，置于容器中部，容器为50 cm×50 cm×15 cm的面包框内装着0.180 mm孔径的纱网网兜）上饲养。浆料视取食情况进行补料，当新鲜浆料都变成灰褐色时再补1 kg，养殖过程中，各处理合计投喂浆料16 kg。幼虫13日龄时停止补料进行饥饿处理，幼虫15日龄时用孔径0.425 mm筛将幼虫与残渣分离，称量总重后，随机取 100 头进行称重，计算单头幼虫平均体重（称量后放回饲养盒）。计算幼虫养殖存活率：
试验数据采用LSD多重比较进行方差分析，采用Excel绘图。
2 结果与分析
2.1 冷藏时间对不同发育阶段黑水虻虫卵孵化率的影响
从图1可以看出，冷藏时间对不同发育阶段黑水虻虫卵孵化率具有显著影响，初产虫卵（处理A）不能直接冷藏，冷藏1 d死亡率达100%。破壳期卵（处理E）不适于冷藏，冷藏3 d后幼虫无法破壳。原肠期卵（处理C）孵化率＞80%的冷藏周期为15 d，显著大于体壁背合期卵（处理D）的6 d和胚盘胚带形成期卵（处理B）的13 d，故原肠期卵是较适合的冷藏阶段。
图1 冷藏时间对不同发育阶段黑水虻虫卵孵化率的影响
Fig.1 Effects of cold storage time on hatching rate of Hermetia illucens at different developmental stages
2.2 原肠期虫卵不同冷藏时间对黑水虻生长发育的影响
2.2.1 原肠期不同冷藏时间对黑水虻不同时期幼虫生长发育的影响 随着冷藏时间拉长，部分初孵幼虫由于活力不足，无法顺利从纱网掉落到盆内。称量初孵幼虫质量可以从侧面反映虫卵的有效孵化率。冷藏15 d卵的初孵幼虫质量显著低于对照（P=2.82e-6），详见表1。
2.2.2 原肠期不同冷藏时间对黑水虻5日龄幼虫生长发育的影响 各处理初孵幼虫养殖5 d后，筛分称量总重、百头重，计算冷藏0、5、10、15 d卵的5日龄幼虫存活率。结果（表1）显示各处理5日龄幼虫百头重无显著差异（P=0.434），冷藏15 d的5日龄幼虫存活率显著低于对照（P=6.1e-7）。
2.2.3 原肠期不同冷藏时间对黑水虻15日龄幼虫生长发育的影响 将各处理收获的5日龄幼虫继续养殖10 d后，筛分称量总重、百头重，计算15日龄幼虫养殖存活率（此处的养殖存活率以5日龄幼虫数为基数而非虫卵数），结果（表1）显示各处理15日龄幼虫百头重无显著差异（P=0.187），冷藏15 d的15日龄幼虫存活率显著低于对照（P=0.024）。
表1 冷藏时间对黑水虻不同阶段幼虫生长发育的影响
Table 1 Effects of cold storage time on growth and development of Hermetia illucens larvae at different developmental stages
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
15日龄幼虫存活率Survival rate of 15-day-old larvae（%）冷藏0 d（CK）Cold storage for 0 day处理Treatment初孵幼虫质量Weight of newlyhatched larvae（g）5日龄幼虫总质量Total weight of 5-day-old larvae（g）百头5日龄幼虫质量Weight of 100 heads 5-day-old larvae（g）5日龄幼虫存活率Survival rate of 5-day-old larvae（%）15日龄幼虫总质量Total weight of 15-day-old larvae（g）百头15日龄幼虫质量Weight of 100 heads 15-day-old larvae（g）0.4222±0.0012a 57.66±1.46 0.1938±0.0051a 72.58±0.43a 3818.89±88.27 12.92±0.31a 99.35±0.55a冷藏5 d Cold storage for 5 days 0.4186±0.0035a 56.97±1.96 0.1936±0.0053b 71.78±0.58ab 3700.30±151.34 12.65±0.55a 99.36±0.25a冷藏10d Cold storage for 10 days 0.4034±0.0087b 55.88±1.03 0.1896±0.0026b 72.57±0.79b 3583.56±282.60 12.62±0.75a 98.90±0.60a冷藏15d Cold storage for 15 days 0.3360±0.0126c 48.56±0.55 0.2112±0.0140b 57.95±1.72c 2582.81±383.87 11.39±1.34a 97.74±0.91b
3 讨论
黑水虻卵冷藏过程中，初产虫卵无法发育直接死亡，可能是因为初产虫卵的发育起始温度高于12 ℃。Holmes等研究认为黑水虻卵发育的起始温度在12～16 ℃[9]，然而其研究报道中未说明虫卵进入冷藏阶段时的发育情况，故我们推测初产虫卵的发育起始温度高于12 ℃。
黑水虻其他几个发育阶段的虫卵经12 ℃冷藏后，均能在32 ℃发育成幼虫。但随着冷藏时间推移，幼虫无法正常破壳，死于卵壳内。我们在研究黑水虻卵胚胎发育时发现，未经冷藏的虫卵表面有一层粘液，正常发育的胚胎出壳前尾部会分泌一种疑似具有溶解卵壳功能的液体，幼虫通过蠕动身体把部分液体挤到头顶，利用口器持续顶头顶卵壳，直到出现裂缝，幼虫从卵壳中爬出。而冷藏过后的虫卵，表面粘液消失，在孵化时，未见尾部分泌液体，可能是黑水虻卵冷藏过程中失水所致。
黑水虻卵是一个大细胞，最外层为卵壳，卵壳下方为卵黄膜。卵壳或卵壳与卵黄膜间形成蜡质层，卵壳与蜡质层起到保护卵、防止卵内水分过量蒸发和阻止水溶性物质自由进出的卵的作用[12]。我们曾在空气湿度约50%，通风优良的环境中孵化虫卵，发现孵化率极低，虫卵死亡状态与虫卵冷藏时的死亡状态类似，怀疑虫卵冷藏过程中，卵壳或蜡质层受损，卵内水分大量蒸发，导致幼虫无法正常破壳。我们后续加大冷藏湿度（90%）进行试验，冷藏效果不理想，虫卵表面易着落凝结的水珠，卵孵化率低。推想如果要进一步增加虫卵冷藏间期，需要从虫卵保湿以及种虫养殖繁育时补充营养等方面着手。
虫卵冷藏对幼虫的发育造成一定的影响，随着冷藏时间增长，孵化历期加长，初孵幼虫活力变差甚至无法破壳，这使得后期养殖过程中，经冷藏处理的幼虫发育相对对照不整齐，这个现象在冷藏15 d时非常明显。发育不整齐的幼虫不适宜养殖为蛹用于繁育，故本实验未继续作成虫繁育方面的研究，如果冷藏技术有新进展，不再影响幼虫发育的整齐度，有待进行冷藏卵的成虫繁育方面研究。
从原肠期卵分别冷藏0、5、10、15 d对黑水虻生长发育的影响结果中可以看出，各处理均存在虫卵孵化率高、初孵幼虫（1～5日龄）存活率低和幼虫（5～15日龄）养殖存活率高的规律，与姬越等的报道相似[8]。在试验过程中发现，孵化环境温湿度、虫卵铺放厚度、饲料表面明水量、饲料透气性等因素都对初孵幼虫存活率具有较大影响，更全面的了解初孵幼虫存活率的影响因素，提升初孵幼虫存活率是黑水虻规模化养殖关键技术的研究重点之一。
4 结论
在温度为12 ℃、湿度为80 %的冷藏环境，经冷藏后的初产虫卵、体壁背合期和破壳期虫卵发育受阻，孵化率降低；胚盘胚带形成期虫卵冷藏13 d内孵化率＞80%；原肠期的黑水虻卵冷藏15 d内能保持＞80%的孵化率，孵化出来的幼虫生长发育正常，冷藏超过15 d，孵化率显著降低，无法正常破壳。所以不同发育阶段的虫卵对低温的耐受性不同，低温对卵的伤害会随卵的发育而减轻，冷藏即将发育完全或已经发育完全的胚胎，胚胎无法正常破壳。
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