【研究意义】青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum hook.f.）是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，富含β-葡聚糖、多酚类化合物、黄酮和γ-氨基丁酸（GABA）等重要生物活性成分[1]，具有抗氧化、调节免疫系统、抗糖尿病等重大生理作用[2-5]，且萌动后的青稞抗氧化活性及抑癌防癌作用均明显高于未经萌动处理的青稞[6-7]。此外，青稞还含有能清除体内自由基、延缓衰老的超氧化物歧化酶（SOD）[8]，有激活脑内葡萄糖代谢、促进乙酰胆碱合成、降血氮、降血压等生理功能[9-11]。目前青稞的应用仍然停留在较基础的层次上，如青稞粉、青稞面和青稞烘焙等产品，对于青稞的深加工利用和经济发展造成了一定的局限性[12]。
【前人研究进展】杨希娟等[13]研究发现青稞酚类化合物含量与粒色有关，黑色粒色酚类化合物含量最高，且自由基清除能力的强弱与酚类物质的形态结构相关；张帅等[14]研究了不同粒色青稞营养品质与抗氧化活性的差异，结果表明彩色青稞的营养物质和抗氧化活性物质含量均优于白色青稞，证明抗氧化活性与青稞的粒色相关；邢玉晓[15]研究了不同品种青稞的抗氧化活性及其作用，表明青稞的抗氧化活性非单一，而是多种有效物质综合发挥作用的结果。青稞抗氧化成分的研究主要集中在多糖、酚类、花青素、紫色素等方面[16-19]，而有关青稞经萌动处理后抗氧化活性的研究较少。【本研究切入点】近年来，通过萌动改善青稞食用品质和营养价值成为研究热点[20-22]。谷物萌动后蛋白酶等水解酶系活性被激活，导致α-淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、β-葡聚糖酶等酶活力提高，促进了谷物中营养和功能性组分含量的改变[23]。谷物在萌动过程中胚乳细胞壁破裂导致胚乳内储存的物质降解，为胚轴生长提供营养和供能，这种变化一定程度上降解和消除了抗营养物质，并增加了对人体有益的物质如GABA和生育酚等，同时使得营养物质更有利于人体吸收[24]。目前关于青稞萌动后在抗氧化活性方面的研究较少，主要集中在品种间青稞酚类化合物种类、含量及抗氧化活性差异等方面。【拟解决的关键问题】基于青稞的抗氧化活性，研究青稞浸麦和萌芽过程中总酚、黄酮、GABA和β-葡聚糖含量的变化规律，探究其与抗氧化活性的相关性，为青稞功能性产品的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
青稞（藏青2000）产于西藏林芝地区工布江达县巴河镇甲热村，干麦芽、干谷芽、干稻芽购于安徽毫州。
GABA标准品，HPLC≥99%，购于上海金穗生物科技有限公司；2,4-二硝基氟苯（FDNB），纯度≥98%，购于上海麦克林科技有限公司；芦丁标准品，纯度≥98%，购于上海源叶生物科技有限公司；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、FoLin酚试剂等，均为分析纯，购于广东光华科技股份有限公司。
1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，购于安捷伦科技（中国）有限公司；LHS-150/250HC-Ⅱ恒温恒湿培养箱，购于上海一恒科学仪器有限公司；752紫外可见分光光度计，购于上海现科分光仪器有限公司；Dura pro 12超纯水系统，购于泽拉布仪器科技（上海）有限公司。
1.2 试验方法
将青稞种子用0.85 mm筛网筛选，去除杂物和石子，挑选生理状态良好、没有破损、颗粒饱满的青稞籽粒，用清水反复冲洗干净，再用2%的次氯酸钠在室温下浸泡15 min后用无菌水洗涤4～5次。（1）浸麦时间的影响：将处理好的青稞在15℃下按照浸4断2方式（浸麦4 h-空气休止2 h，蒸馏水）设5个萌动处理，分别浸麦0、6、12、18、24 h，然后在25 ℃、湿度90%、光照强度7 500 lx下萌动48 h。（2）萌芽时间的影响：将处理好的青稞在15 ℃下按照浸4断2方式浸麦处理24 h后，在25 ℃、湿度90%、光照强度7 500 lx下，设 7个处理分别萌动0、8、16、24、32、40、48 h。萌动后将青稞芽经真空冷冻干燥，分别测定浸麦、萌芽过程中4种功能性成分含量的变化，重复3次。
将青稞芽（15 ℃浸麦24 h，25 ℃、湿度90%、光照强度7 500 lx下萌芽48 h制备）、麦芽、谷芽和稻芽经真空冷冻干燥，然后粉碎过0.180 mm筛，以料液比1∶10、50 ℃蒸馏水稀释，搅拌均匀，超声波提取10 min，再经50 ℃水浴锅中提取5 min，6 000 r/min离心10 min，取上清液备用。按照0.025、0.033、0.050、0.010 mg/L浓度梯度分别配制4种芽提取液，待测。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 GABA 采用高效液相色谱法测定，结合段智红等[25]的方法稍作改动。衍生剂为1% 2,4-二硝基氟苯（FDNB）乙腈溶液；流动相由A、B双组分组成，A流动相为pH 7.0的磷酸盐缓冲液，B流动相为V（CH3CN）∶V（H2O）=1∶1；柱温35 ℃，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，检测波长360 nm，梯度洗脱方法见表1。所得标曲为Y=211.29X-0.3446（R2=0.9992）。
表1 GABA流动相洗脱梯度
Table 1 GABA mobile phase elution gradient
时间Time（min） 流速Flow rate（mL/min） A（%） B（%）0 0.8 16 84 20 0.8 80 20 30 0.8 16 84
1.3.2 总酚含量 采用Folin-Ciocalteu法[26]测定。
1.3.3 黄酮含量 采用硝酸铝显色法[27]测定。
1.3.4 β-葡聚糖含量 采用刚果红法[28]测定。
1.3.5 羟自由基清除率 参考杜道坤等[29]的方法稍作改进。于试管中加入样品0.5 mL、9.1 mmol/L水杨酸乙醇溶液0.5 mL、9 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，最后再加入8.8 mmol/L H2O2 5 mL启动反应；37 ℃水浴反应0.5 h，以蒸馏水作对照，在510 nm处测吸光度，重复3次。计算清除率：
式中，D0（510 nm）为空白管吸光度，D1（510 nm）为反应溶液吸光度，D2（510 nm）为只含H2O2和样品液对照管的吸光度。
1.3.6 金属离子还原能力测定 参考袁博等[30]的方法稍作改进。在试管中依次加入pH 6.6磷酸缓冲液2.5 mL、待测样品1 mL、1%铁氰化钾溶液1 mL，混匀，于50 ℃恒温条件反应20 min，冷却；加入10%三氯乙酸2.5 mL反应0.5 h，4 000 r/min离心10 min。取上清液5 mL，加入水5 mL、0.1%三氯化铁溶液1 mL，混匀静置10 min。以蒸馏水作对照于700 nm下测定吸光度，重复3次。吸光度越大，表明样品还原力越强。
1.4 数据分析处理
试验数据采用Origin 2017SP2和Microsoft Excel 2016进行整理和作图，采用SPSS19.0进行方差分析和多重比较，相关性分析使用Pearson双侧检验。
2 结果与分析
2.1 青稞浸麦过程中活性成分和抗氧化活性的变化
图1 浸麦时间对青稞黄酮及总酚含量的影响
Fig.1 Effect of soaking time on the contents of flavonoids and total phenols in highland barley
图2 浸麦时间对青稞GABA及β-葡聚糖含量的影响
Fig.2 Effect of soaking time on the contents of GABA and β-Glucan in highland barley
图3 浸麦时间对青稞羟自由基清除率和金属离子还原能力的影响
Fig.3 Effects of soaking time on the hydroxyl free radical clearance rate and reduction capacity of metal ions of highland barley
由图1、图2可知，在本试验条件下，青稞经浸麦萌动后总酚和黄酮含量随着浸麦时间的延长不断提高，以黄酮含量增长速率较快；GABA含量随着浸麦时间的延长呈先上升后平稳的趋势；β-葡聚糖含量随浸麦时间延长则缓慢下降。由图3可知，青稞经浸麦萌动处理后对羟自由基的清除率在浸麦6 h达到最大值（64.88%），在浸麦18 h逐渐趋于稳定；青稞对金属离子还原能力在浸麦6 h达到最大（0.91），之后开始出现明显下降趋势。
2.2 青稞萌芽过程中活性成分和抗氧化活性的变化
图4 萌芽时间对青稞黄酮及总酚含量的影响
Fig.4 Effect of germination time on the contents of flavonoids and total phenols in highland barley
图5 萌芽时间对青稞GABA及β-葡聚糖含量的影响
Fig.5 Effect of germination time on the contents of GABA and β-Glucan in highland barley
图6 萌芽时间对青稞羟自由基清除率和金属离子还原能力的影响
Fig.6 Effects of germination time on the hydroxyl free radical clearance rate and reduction capacity of metal ions of highland barley
由图4可知，青稞萌动后总酚和黄酮含量均随萌芽时间的延长呈现先上升后下降的趋势。与浸麦萌动相比，总酚和黄酮含量在萌芽初始阶段上升速率较快，总酚含量在萌芽40 h达到最高为2.584 mg/g，黄酮含量在萌芽32 h达到最大为2.306 mg/g。由图5可知，与浸麦阶段相比，GABA含量在萌芽过程中上升速率显著提高，β-葡聚糖含量进一步下降。由图6可知，随着萌芽时间的延长，萌动青稞对羟自由基的清除率和金属离子还原能力均呈先升高后降低的趋势，其中羟自由基的清除率在萌芽8 h达到最高值71.23%，对金属离子还原能力也在萌芽8 h达到最大值。
2.3 功能性成分与抗氧化活性的相关性分析
由表2的相关性分析可知，与萌芽阶段相比，总酚在浸麦阶段与抗氧化活性相关性较强，但不显著。原因可能是由于青稞体外抗氧化活性与总酚含量相关，但同时也存在其他成分对抗氧化活性的贡献，且各功能性成分之间可能存在相互影响。本研究结果表明，青稞浸麦和萌芽过程中黄酮含量与抗氧化活性均无显著相关性，但萌芽阶段的相关性比浸麦阶段高，这可能受到其他未测定的抗氧化成分的影响，也可能与物质之间的协同作用机制有关。与萌芽阶段相比，GABA在浸麦阶段与抗氧化活性的相关性较高，且显著相关，说明浸麦时间对提高青稞抗氧化活性具有显著影响。β-葡聚糖在浸麦及萌芽过程中均呈负相关，但不显著。
表2 青稞功能性成分与抗氧化活性的相关性分析
Table 2 Correlation analysis of functional components and antioxidant activity of highland barley
金属离子的还原能力Reduction capacity of metal ions黄酮Flavonoids项目Item浸麦时间Soaking time 萌芽时间Germination time清除率Clearance rate金属离子的还原能力Reduction capacity of metal ions清除率Clearance rate 0.15982 0.09723 0.63584 0.55425总酚Total phenols 0.40912 0.45017 0.35776 0.21352 γ-氨基丁酸GABA 0.54323* 0.58289* 0.3341 0.1645 β-葡聚糖β-glucan-0.47269 -0.48275 -0.4695 -0.33176
2.4 青稞芽、麦芽、谷芽和稻芽之间的抗氧化活性比较
由图7、图8可知，4种谷物芽的抗氧化活性随着样品浓度的升高而增强，在一定浓度范围内，麦芽对羟自由基清除率最强，其次是青稞芽和谷芽，稻芽最差；各谷物芽对金属离子还原能力强弱表现为麦芽＞稻芽＞谷芽＞青稞芽。不同谷物芽在羟自由基清除能力和金属离子还原能力上体现出不同的结果，可能与谷物中所含黄酮、酚类等物质的形态、结构及含量差别有关。不同形态酚类及黄酮类物质对清除自由基及金属离子还原能力的强弱具有选择性，青稞芽的抗氧化活性受游离态及结合态酚类等化合物含量的共同影响[13,31]。
图7 4种谷物芽粉对羟自由基清除率的影响
Fig.7 Effects of four kinds of cereal bud powders on hydroxyl free radical clearance rate
图8 4种谷物芽粉对金属离子还原能力的影响
Fig.8 Effects of four kinds of cereal bud powder on reduction capacity of metal ions
3 讨论
种子萌动改性是一种有效改善谷物食用品质和提高其营养价值的方法[6-7]，通过萌动处理可以提高青稞功能性成分的含量及增加其抗氧化活性。青稞浸麦萌动后抗氧化活性得到提高，可能与籽粒吸水膨胀后各种内源酶被激活导致酚类及黄酮类物质含量上升有关，与本研究结果青稞浸麦萌动后酚类、黄酮及GABA含量增加一致。浸麦时间超过6 h，萌动青稞抗氧化活性开始降低，可能与β-葡聚糖等成分的降解有关，青稞籽粒随浸麦时间延长膨胀度升高，β-葡聚糖酶活性进一步增强，促使β-葡聚糖迅速降解[32]；同时，与多酚氧化酶的活性处于较高水平有关，部分多酚被氧化分解也可能导致青稞抗氧化活性下降。综上，浸麦萌动处理可以提高青稞的抗氧化活性，可通过选择适宜的浸麦时间获得高抗氧化活性青稞芽。
青稞处于萌芽萌动初期，各种酶活不断提高、生化反应激烈，总酚、黄酮和GABA含量随着萌芽时间延长而增加。总酚、黄酮和GABA功能性成分在萌芽前期均存在迅速积累的过程，导致羟自由基清除率不断上升，其后保持较高的稳定水平[24]。同时，随着萌芽时间的延长，青稞芽内的能量和物质被不断消耗，导致抗氧化活性呈现下降趋势[23]，因此要合理调控青稞萌芽时间，以获得高抗氧性青稞原料。
研究表明，酚类物质分子因具有强螯合性，能较好地清除人体内的自由基，起到抗氧化、抗衰老的效果[33]。黄酮是一种强抗氧剂，可有效清除体内自由基，具有抗衰老、防癌抑癌、保护心血管、抗心律失常等作用[34]。但本研究结果表明，青稞浸麦及萌芽过程中抗氧化活性与总酚、黄酮含量相关性均不显著，与韩玲玉等[35]的研究结果相似。原因一方面由于其他活性成分对抗氧化活性的贡献及存在相互影响，还可能与青稞在不同萌动阶段黄酮和多酚的存在形态、组成以及含量差异有关[36]。目前对于GABA的研究主要集中在GABA的富集及生理功能研究方面[37]，未见涉及探讨GABA与抗氧化的相关性研究。本试验结果表明，GABA在青稞浸麦萌动中与抗氧化活性显著相关，可通过调控浸麦工艺来提高青稞原料的抗氧化活性，其相关影响原理目前尚无定论，仍需进一步研究。
4 结论
青稞种子经萌动处理后可增强抗氧化活性和增加功能性成分含量，总酚、黄酮及GABA在萌动处理后含量均得到提高；抗氧化活性最强的浸麦时间为浸麦萌动6 h，最强的萌芽时间为萌芽萌动8 h。本试验结果表明，萌动处理可作为一种有效提高青稞抗氧化活性的方法。
相关性分析表明，不同功能性成分在不同萌动阶段与抗氧化活性呈现不同的相关性P值。在4种成分中，黄酮在萌芽阶段呈现较高的相关性，GABA与浸麦阶段抗氧化活性显著相关。为了更好地评估青稞的抗氧化活性，需进一步采用不同机理的抗氧化评价方法，从不同侧面来反映青稞抗氧化活性的水平。
此外，各谷物芽的抗氧化活性均随样品浓度的升高而增强，青稞芽与其他3种市售谷物芽产品相比抗氧化活性不具有优势。因此，进一步研究青稞萌动工艺，通过控制环境变量或其他萌动处理方式来调节萌动过程中多酚、黄酮、β-葡聚糖及GABA等功能性成分的含量，从而提高萌动青稞的抗氧化活性是进一步研究的方向。
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