【研究意义】三七〔Panax notoginseng（Bruk）F.H.Chen〕又名田七，为五加科人参属植物，具有散瘀止血、消肿定痛的功效，迄今已有400余年的驯化栽培历史。由于对环境要求的特殊性，目前三七种植90%以上面积集中在云南省［1］，连作障碍的大面积发生严重制约着三七种植的可持续发展。土壤理化性质的改变、自毒作用及微生物失衡导致的病害增加是连作障碍发生的主要原因，其中微生物群落失衡是最主要的因子［2-4］。在三七栽培中，随着连作年限的延长，病害发病率明显增加［5］。明确三七栽培种土壤理化性质、酶活及微生物群落结构的改变是解决三七重茬问题的关键。土壤微生物群落结构组成的动态变化越来越多被用来评估微生态系统的响应，在一定程度上具有反映早期生态系统破坏与恢复程度的功能［6］。根际土壤微生物群落能够迅速反映环境条件的变化，特别是在作物连作障碍形成的初期对环境的变化最为敏感。
【前人研究进展】董林林等［7］研究了人参根际1、2、3年的真菌组成变化，与森林土相比，人参根际土壤微生物多样性较高，且随着种植年限的增加，多样性增加趋势下降。谭勇等［8］基于Illumina MiSeq测序平台分析了三七种植前后土壤及种植3年根际土壤中细菌群落结构的变化，发现种植三七前后土壤细菌群落多样性指数和丰富度指数的变化规律基本一致。
【本研究切入点】目前尚未见三七根际土壤中随着种植年限的延长，真菌、细菌结构群落变化的系统报道。【拟解决的关键问题】本研究将明确三七重茬土壤中土壤养分及酶活性的变化，结合高通量测序的技术，分析种植年限的延长对三七根际土壤真菌群落、细菌群落影响的相关性，为克服三七连作障碍提供有效的策略。
1 材料与方法
1.1 土壤样品采集
土样于2018年采自云南省建水县三七种植基地。按照五点取样法采集3年生三七根际土壤，每点采集2株三七的根际土壤混合，周边未种植三七的土壤（对照）也按五点取样法取样混合。土壤取样深度为0～30 cm，土样采集后迅速置于冰盒中储存、备用。
1.2 土壤理化性质测定
土壤全氮的测定采用开氏消煮法，土壤全磷的测定采用碳酸钠熔融法，土壤全钾的测定采用氢氧化钠熔融法，有机质的测定采用油浴加热K2Cr2O7容量法，有效磷的测定采用碳酸氢钠法，有效钾的测定采用乙酸铵提取法，碱解氮的测定采用碱解扩散法，土壤pH值的测定采用pH计。
1.3 土壤酶活性测定
土壤脲酶活性采用苯酚钠比色法测定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水杨酸法测定，碱性磷酸酶采用磷酸苯二钠法测定，多酚氧化酶采用邻苯三酚比色法测定。
1.4 土壤微生物群落分析
采用MOBIO Power-Soil Kit（MOBIO，美国）提取土壤总DNA，利用通用引物扩增真菌NS1-FUNG通用引物、细菌16SrRNA基因V3-V4通用引物标签序列。序列扩增、纯化、均一化参照Jorge等［9］的方法。
采用Miseq测序平台测序平台获取土壤真菌宏基因组序列，利用QIIME 软件进行序列分析。数据预处理采用Flash软件融合双末端序列，通过barcode区分样品序列，去除非靶区域序列及嵌合体［10］。采用Sliva将序列进行物种分类，对每个样本和每个物种单元分类进行序列丰度计算，构建样本和物种分类单元序列丰度矩阵。
2 结果与分析
2.1 种植三七对土壤养分的影响
土壤酶活性是衡量土壤质量的一个重要指标［11］。从表1可以看出，与对照相比，随着三七种植年限的延长，土壤pH值、有机质、全钾、速效磷、速效钾含量均表现出明显上升的趋势，全氮、全磷、碱解氮含量下降。其中全磷、有机质变化最为显著，全磷含量为对照土壤的2.7倍，有机质含量为对照土壤的1.2倍。
2.2 种植三七对土壤酶活性的影响
土壤养分是衡量土壤质量的一个重要指标。由表2可知，三七种植3年后土壤养分变化明显，除碱性磷酸酶活性降幅不大外，脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性均显著下降，其中土壤脲酶活性、蔗糖酶活性分别降低16%、19.6%，多酚氧化酶活性变化最为显著，降低30%。
2.3 高通量测序数据处理分析
样品中真菌及细菌标签测序的原始数据见表3。使用Usearch去除预处理后序列中的非扩增区域序列，而后对序列进行测序错误校正，并调用uchime进行鉴定嵌合体；随后，再将去除嵌合体的序列与数据库代表性序列进行blastn比对，低于阈值的比对结果认为是靶区域外序列，剔除该部分序列后获得目标序列（Filtered num）。为了便于分析，本研究将Filtered num聚类为OUT，相似度低于97%的序列划分为一个OUT，每个OUT可视为一个微生物物种。
2.4 种植三七对土壤真菌群落组成的影响
三七种植前后土壤在科水平上检测分类出占比较高的15类真菌，分别为Tricholomataceae（白蘑科）、Physodermataceae（节壶菌科）、Helotiaceae（柔膜菌科）、Nectriaceae（从赤壳科）、Pneumocystidaceae（肺孢子菌科）、Trichocomaceae（发菌科）、Endogonaceae（内囊霉科）、Mucoraceae（毛霉菌科）、Didymellaceae（黑星菌科）、Botryosphaeriaceae（葡萄座腔菌科）、Hydnodontaceae（齿菌科）、Amphisphaeriaceae（黑盘孢科）、Herpotrichiellaceae（草本菌科）、Alphamycetaceae（粉螨科）、Filobasidiaceae（丝状担子菌科）。如图1所示，两个土壤样品在属水平上检测分布的真菌属为腊伞属、犁头霉属、镰刀菌属、咖啡锈菌属、念珠菌属、褐核盘菌属等25个属真菌。三七种植前后土壤样品中真菌群落结构组成及种群密度具有明显不同：种植前土壤中主要以Hygrocybe为优势菌种（55.17%），而种植三七后明显下降（0.37%）；随着种植年限的延长，Fusarium（镰刀菌属）取代Hygrocybe（潮霉属）成为优势菌种，其占比由0.25%上升到8.31%，增加32倍，该属真菌主要引起三七根腐病。这与Miao等［4］的研究结果相似，镰刀属真菌是种植三七后土壤中分离最多的真菌属，说明随着种植年限的延长，三七根系土壤中镰刀菌的数量会发生较大幅度的增加。其次，我们还检测到犁头霉属、驼孢锈菌属、灰葡萄孢，含量为7.17%、4.85%、3.04%，其中灰葡萄孢可引起三七灰霉病。另外，分析结果也表明随着种植年限的延长，从属水平上检测到的真菌的种类比种植前土壤有所增加，其种群密度也明显上升（图1）。另外，本次样品中共检测到5种引起三七常见病害的病原真菌，分别为：Fusarium（镰刀菌属）、Botrytis（葡萄孢属）、Alternaria（链格孢属）、Rhizoctonia（立枯丝核菌属）、Colletotrichum（炭疽菌属），其种群密度均高于种植前。
表1 三七种植前后土壤理化性质特征
Table 1 Soil physico-chemical properties before and after cropping Panax notoginseng
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
速效钾Available-K（mg/kg）对照 Control 7.78 19.73±0.01b 3.25±0.82a 3.72±0.03b 13.02±0.83a 159.6±0.48b 17.6±0.70a 195.06±1.12b 3年生三七根际土壤Three years successive cropping soil样品Sample pH有机质Organic matter（g/kg）全氮Total N（g/kg）全磷Total P（g/kg）全钾Total K（g/kg）碱解氮Alkeline-N（mg/kg）速效磷Available-P（mg/kg）8.34 23.56±0.13a 1.97±0.08b 1.34±0.06a 14.01±0.09b 153.8±1.05a 21.4±0.32b 212.78±1.82a
表2 三七种植前后土壤酶活性(mg/g.24h)
Table 2 Soil enzyme activities before and after cropping Panax notoginseng
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
多酚氧化酶活性Polyphenol oxidase activity对照 Control 12.06±0.05a 0.682±0.06a 15.09±0.05b 0.632±0.82a 3年生三七根际土壤Three years successive cropping soil 10.13±0.11b 0.639±0.10b 12.13±0.09a 0.445±0.65b样品Sample脲酶活性Urease activity碱性磷酸酶活性Alkaline phosphatase activity蔗糖酶活性Invertase activity
表3 序列与OUT信息
Table 3 Sequence and OUT information
OUT数量OUT number对照-真菌Control-fungus 51700 51651 718 3年生三七根际土壤-真菌Three years successive cropping soil-fungus 42232 42186 903对照-细菌Control-bacteria 83758 80830 10384 3年生三七根际土壤-细菌Three years successive cropping soil-bacteria 90389 87383 11808样品Sample序列数量Sequence number目标序列Filtered num
2.5 种植三七对土壤细菌群落组成的影响
图1 三七种植前后土壤中真菌微生物群落组成结构特征
Fig. 1 Microbial composition of the fungus before and after cropping Panax notoginseng
三七种植前后土壤在科水平上检测分类出占比较高的15类细菌，分别为Gemmatimonadaceae（芽单胞菌科）、Methanomassiliicoccaceae（甲烷菌科）、Xanthomonadaceae（黄单胞菌科）、Bradyrhizobiaceae（慢生根瘤菌科）、Comamonadaceae（丛毛单胞菌科）、Thermoanaerobacteraceae（嗜热厌氧杆菌科）、Rhodocyclaceae（红环菌科）、Gaiellaceae（尚无译名）、Chitinophagaceae（噬几丁质菌科）、Nocardioidaceae（类诺卡氏菌科）、Rhodospirillaceae（红螺菌科）、Xanthobacteraceae（黄色杆菌科）、Pseudonocardiaceae（假诺卡氏菌科）、Oxalobacteraceae（草酸杆菌科）、Cystobacteraceae（孢囊杆菌科）等。如图2所示，三七种植前后土壤样品中主要分布的细菌属为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、嗜酸杆菌属（Aciditerrimonas）、荧光假单胞菌属（Pseudomonas）、寡养单胞菌属（Streptomyces）、红游动菌属（hodoplanes）、苯基杆菌属（Phenylobacterium）、链霉菌属（Streptomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）等。通过分析发现，三七种植前后土壤中的细菌群落组成与结构有明显差异，其中红游动菌属在3年生三七根系土壤中（0.95）明显低于未种植三七土壤（2.28），比值相差2.4倍，这与谭勇等［8］的研究结果相似，一些属如鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、短根瘤菌属（Bradyrhizobium）等随着三七种植年限的延长呈上升趋势，而一些常报道的生防菌如假单胞菌（Pseudomonas）、链霉菌（Streptomyces）却随着三七种植年限的延长呈下降趋势。
图2 三七种植前后土壤中细菌微生物群落组成结构特征
Fig. 2 Microbial composition of the bacteria before and after cropping Panax notoginseng
2.6 种植三七对土壤微生物群落多样性的影响
植物在生长发育过程中，根系作为植物与土壤的接触部分，不仅从土壤中吸收水分和养分，而且通过根分泌的方式向根周围释放一些无机离子和有机化合物，这些物质的积累会导致土壤微生物群落改变［12-14］。常用的表征微生物α多样性的指数有香农指数（Shanon diversity index）、辛普森指数（Simpson index）等，香农指数多样性指数越高说明微生物群落越丰富，辛普森指数越低说明微生物群落越丰富。对三七种植前后土壤样品进行微生物α多样性分析，结果（表4）表明，种植三七后土壤中真菌及细菌的Shannon指数上升，而Simposon指数下降，说明土壤中微生物的多样性随着种植年限的延长而增加。
表4 三七种植前后土壤微生物α多样性丰富度
Table 4 The αdiversity of the soil microbial organism before and after cropping Panax notoginseng
Chao指数Chaoindex对照-真菌Control-fungus 2.58 0.30 10956.18 6867.17对照-细菌Control-bacteria 6.67 0.01 78237.28 41168.79 3年生三七根际土壤-真菌Three years successive cropping soil-fungus 3.96 0.05 7072.33 4197.22 3年生三七根际土壤-细菌Three years successive cropping soil-bacteria 7.04 ＜0.01 78571.48 42226.48样品Sample香农指数Shanon diversity index辛普森指数Simpson index ACE指数ACE index
2.7 种植三七对土壤物种丰度的影响
物种丰度热图（Heatmap）是用颜色变化反映群落分布的丰度信息，可以直观地将群落分布丰度值用定义的颜色深浅表示。同时将样品以及群落分布信息进行聚类并重新排布，将聚类后的结果显示在热图中，从而可以很好地反映各分类水平上群落分布组成异同。如图3所示，每一列代表一个样本，行代表群落结构，颜色块代表相对物种丰度值，颜色越红表示相对丰度越高，颜色越蓝则相对丰度越低，其趋势为蓝色＜绿色＜黄色＜红色。由图3可知，随着三七种植年限的延长，土壤中各真菌的物种丰度会有所增加；而细菌却恰恰相反，随着三七种植年限的延长，物种丰度则有所下降。
图3 真菌、细菌物种丰度热图
Fig. 3 Hertmap of fungus and bacteria
3 讨论
3.1 土壤微生物群落结构和多样性的影响因素
研究表明，土壤真菌群落的丰度与土壤理化指标相关，pH值、有效钾、土壤总氮均与真菌群落的丰度显著相关［15-16］。董林林等［7］研究表明，土壤pH与Dothideomycetes和Alatospora的丰度显著相关，有效钾含量与Dothideomycetes、Alatospora、Mucorales的丰度显著相关，土壤总氮含量与Sordariomycetes、Mucorales的丰度显著相关。本研究中，三七种植前后土壤理化性质也发生了较大变化，主要为pH值上升，全氮、全磷含量明显下降，有机质含量明显升高，碱解氮降低而速效磷和速效钾含量升高，这可能是引起土壤真菌群落变化的因素之一。
另外，根系分泌物也会影响土壤真菌群落变化［17-19］。我们在前期研究中，利用GC-MS从三七重茬土壤中共检测到29种化感物质，其中对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸二异丁酯对三七病原菌（F.oxysporum Schlecht）的生长呈现低促高抑的现象，且当对羟基苯甲酸浓度为5 mmol/L时能促进病菌小孢子的产生［20］。本研究中，3年生三七根系土壤中，Fusarium成为优势菌种，百分比含量为8.31%，比种植前增加32倍，这与前期结果相符。
3.2 土壤微生物群落结构变化与病害的关系
Xiong等［21］曾报道香草根际土壤微生物多样性随着连作年限的延长，真菌群落多样性增加。本研究中，引起三七病害的主要病原菌Fusarium在连作后增加最为明显，其次Botrytis、Alternaria、Rhizoctonia、Colletotrichum的丰度也有所上升，这也可能是三七连作病害高发的主要原因。另外，随着连作年限的延长，已报道的具有生防功能的细菌Pseudomonas、Streptomyces却随着三七种植年限的延长呈下降趋势，根际群落结构失调，这可能也与病害的发生有关。
4 结论
本研究采用土壤酶活性检测及土壤理化性质测定方法结合Illumina MiSeq测序平台采用16S rDNA、18S rDNA分析技术对三七种植前土壤、种植3年根际土壤中的细菌群落多样性进行分析，结果表明，三七种植3年后土壤养分失调，表现为pH值、全钾、有机质、速效磷、速效钾含量上升，而全氮、全磷、碱解氮含量下降；土壤酶活性呈下降趋势，除碱性磷酸酶活性变化不大之外，脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性均明显下降；三七种植前后土壤在科水平上检测分类出占比较高的15类真菌、16类细菌，其中，三七种植前土壤中真菌主要以Hygrocybe为优势菌种，而3年生三七根系土壤中Fusarium成为优势菌种，比种植前增加32倍，且引起三七常见病害的 Fusarium、Botrytis、Alternaria、Rhizoctonia、Colletotrichum的种群密度均高于种植前；α多样性分析及物种丰度热图表明，随着三七种植年限的延长，土壤中各真菌的物种丰度有所增加，而细菌却恰恰相反，随着种植年限的延长，物种丰度呈下降趋势。
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