【研究意义】柑橘黄龙病是一种系统侵染的检疫性细菌病害，已成为威胁世界柑橘产业的头号“杀手”［1-2］。柑橘木虱是黄龙病重要的传播媒介，防治木虱成为控制或延缓黄龙病发病和传播的关键［2-3］。目前，防治柑橘木虱主要依靠化学农药，然而杀虫剂的频繁使用，不仅造成了靶标害虫抗药性的产生，而且引发了农产品质量安全、环境污染和生物多样性等诸多问题［4-6］。随着人们生活水平的提高和农药减量化的要求，在柑橘木虱综合防治中迫切需要筛选出高效、低毒的环境友好型替代农药。【前人研究进展】研究表明，柑橘木虱取食黄龙病病株后可终生带毒，成虫和若虫均具有高效获毒和传毒能力，在感染黄龙病病树上刺吸5周，若虫60%～100%带毒，成虫40%带毒，且成虫通过飞行携带病原进行扩散［7-8］。柑橘木虱的发生与黄龙病的传播、扩散密切相关，加之木虱在柑橘的整个生长期都有发生风险，因此实际生产中柑橘园频繁使用化学农药。有研究报道我国有些柑橘种植区每年喷药防治柑橘木虱的次数少则12次、多达20次［9］。目前，生产上用于柑橘木虱的杀虫剂种类繁多，包含各种不同作用机理的化学农药，如有机磷类、新烟碱类、氨基甲酸酯类、阿维菌素类、拟除虫菊酯类和有机氯类等［4-5,10］。大量多次和不当的使用杀虫剂都会导致柑橘木虱抗药性水平增加，而且化学农药对柑橘木虱的防治已有几十年的应用历史，目前许多国家的田间种群对多数传统化学农药已产生了不同程度的抗性。例如，Vázquez-García等［11］研究发现，墨西哥 Apatzingan和Michoacan地区的柑橘木虱种群对吡虫啉的抗性高达4 265.6倍，对乐果也有106.5倍；Tiwari等［5］报道美国佛罗里达柑橘木虱田间种群对吡虫啉、毒死蜱、噻虫嗪、马拉硫磷和甲氰菊酯均已产生抗药性，其中La Balle地区对吡虫啉和噻虫嗪的抗性倍数分别为35.0倍和13.0倍；2012年，我国学者邓学明等［12-13］也报道广西地区柑橘木虱对毒死蜱产生8.8倍的抗药性，对呋虫胺产生17.1倍的抗药性。近年来，柑橘木虱抗药性不断增加，而且每年用于防治木虱的杀虫剂使用量不断增加。然而，农药减量增效是我国农业可持续发展的重要保障，我国政府2015年中央1号文件也明确指出要显著控制我国农药化肥的使用量，因此，生物农药在柑橘木虱的减量化防控体系中越来越重要。【本研究切入点】近年来，我国实施到2020年农药零增长行动，大量推广使用生物农药，减少化学农药的使用。印楝素是目前世界公认的广谱、低毒、低残留的生物农药，其作用机制独特，不易引起害虫产生抗性，而且对多种害虫有拒食、触杀、胃毒和抑制生长发育作用［14-16］。此外，印楝素具有内吸性，能在植物韧皮部输导［17-18］，因此在防治取食柑橘韧皮部的木虱中具有良好的优势。【拟解决的关键问题】测定并明确印楝素对柑橘木虱幼虫和成虫的毒杀活性和拒食活性，为柑橘木虱的生物防治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试虫源 于华南农业大学校园的九里香上采集柑橘木虱，带回实验室，置于网室中，以九里香幼苗饲养繁殖多代。试验前，将一批成虫（约800头）转接到长出新叶的九里香上，让其产卵1 d后移走；待卵孵化后，饲养至三龄若虫供测试。若虫羽化后，收集5～7 d的成虫用于测试。
1.1.2 供试药剂 印楝素分析标准品（＞90%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品，以无水乙醇配制成浓度为5 000 mg/L的母液，使用时用清水（含0.01%吐温80，下同）稀释；0.3%印楝素乳油：成都绿金生物科技有限责任公司产品；25%噻虫嗪水分散粒剂：安徽省锦江农化有限公司产品。
1.2 试验方法
1.2.1 对若虫的毒力测定 采用浸叶法［19］测定印楝素对柑橘木虱三龄若虫的毒杀活性。将印楝素母液稀释配制成0.375、0.75、1.5、3.0、6.0 mg/L 5个浓度梯度药液。将大小相近的新鲜柑橘叶片，分别浸渍不同浓度药液15 s，取出自然晾干后，叶柄处用湿棉花包裹置于1.5 mL离心管后，放入150 mL一次性塑料杯中，再选取大小一致的柑橘木虱三龄若虫15头饥饿处理2 h后接入塑料杯内，每个浓度处理3次重复。以清水（含等量乙醇溶剂）为对照。于处理后1、2、3、5、7 d分别检查若虫的存活状态，以毛刷轻触若虫体表，无反应判定为死亡，记录死亡数，计算各处理若虫的死亡率和校正死亡率。
1.2.2 对成虫的毒力测定 采用浸叶法［19］测定不同浓度（1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L）印楝素药液对成虫的毒杀活性。以清水（含等量乙醇溶剂）为对照。药后2 d和4 d检查成虫的存活状态，以毛刷轻触虫体，无反应判定为死亡，记录死亡数，计算各处理成虫的死亡率和校正死亡率。
1.2.3 田间防效试验 于2019年8月在广东省饶平县钱东镇朝阳公司贡柑柑橘园进行，选取柑橘木虱为害的植株。试验设0.3%印楝素乳油800倍液、25%噻虫嗪水分散粒剂3 500倍液及空白对照（清水）3个处理，每个处理3次重复，随机排列，每小区2株柑橘树。采用背负式电动喷雾器按试验浓度对柑橘树冠和内膛均匀喷雾，至叶片有少量药液下滴为止。于施药前，在柑橘树的东、南、西、北、中5个方位选定为害嫩梢，标记并记录活若虫数；药后1、3、7 d按照相同方式分别调查各小区柑橘叶片的活若虫数，记录各处理存活若虫总数，计算防治效果。
根据各处理的死亡率和校正死亡率数据，用Excel进行毒力回归计算，得到毒力回归方程、LC50、置限区间值和相关系数；采用GraphPad Prism 8数据处理软件进行差异显著性分析和作图。
2 结果与分析
2.1 印楝素对柑橘木虱若虫的室内毒杀活性
试验发现，印楝素对柑橘木虱若虫的毒杀效果较为缓慢，药液处理的前2 d死亡率较低，但是部分若虫出现活动能力下降、身体僵硬等现象，这可能与印楝素抑制昆虫生长发育而非直接致死的作用方式有关。从图1可以看出，印楝素对柑橘木虱若虫的毒杀活性与药剂浓度以及作用时间有关，在最低处理浓度0.375 mg/L作用下，药后2 d内柑橘木虱三龄若虫死亡率为0，随着时间延长，若虫的死亡率增大，药后3、5、7 d死亡率分别为11.11%、31.11%和44.44%，并且随着印楝素处理浓度的增大，若虫的死亡率明显增高。在最大处理浓度6.0 mg/L作用下，印楝素对柑橘木虱三龄若虫具有良好的毒杀活性，药后1、2、3、5、7 d，三龄若虫死亡率分别为2.22%、13.33%、68.89%、82.22%和91.11%。显著性分析表明，药后7 d各药剂处理与对照死亡率差异显著。由表1可知，印楝素对柑橘木虱三龄若虫的毒杀活性随着作用时间的延长而明显增加，药后3、5 d其LC50值分别为2.77、1.14 mg/L；药后7 d活性最高，其LC50值为0.61 mg/L。
图1 印楝素对柑橘木虱三龄若虫的死亡率测定
Fig.1 Determination of mortality of the 3rd instar nymphs of D. citri treated with azadirachtin
2.2 印楝素对柑橘木虱成虫的室内毒杀活性
从图2可以看出，与若虫相比，尽管印楝素对柑橘木虱成虫的处理浓度提高了，药后2 d各处理成虫死亡率在2.22%～6.67%之间，与对照无显著差异；在最大药液测试浓度（16.0 mg/L）下，印楝素处理药后4 d成虫死亡率也仅为13.33%，与清水对照无显著差异。表明印楝素在低浓度情况下对柑橘木虱成虫无毒杀活性。
表1 印楝素对柑橘木虱三龄若虫的室内毒杀活性
Table 1 Indoor toxicity activity of azadirachtin against the 3rd instar nymphs of D. citri
注： Y为死亡率几率值，X为浓度对数。
Note: Y: Mortality probability, X: Logarithm of concentration.
处理Treatment药后时间Time（d）毒力回归方程Regression equation LC50（mg/L）95%置信区间95% confidence interval相关系数Correlation coefficient（r）Y=1.6377X+4.2744 2.77 2.04～3.77 0.9907 5 Y=1.2509X+4.9269 1.14 0.82～1.59 0.9961 7 Y=1.2799X+5.2782 0.61 0.39～0.95 0.9965 3印楝素Azadirachtin
图2 印楝素对柑橘木虱成虫的死亡率测定
Fig.2 Determination of mortality of the adult of D. citri treated with azadirachtin
2.3 印楝素对柑橘木虱若虫的田间防效
从表2可以看出，0.3%印楝素乳油800倍液药后1、3、7 d对柑橘木虱若虫的防效分别为14.35%、49.56%和86.4%，防效随着时间延长而提高；而对照药剂25%噻虫嗪水分散粒剂表现出速效性，药后1、3 d的防效分别达到99.32%和98.12%，显著高于0.3%印楝素乳油处理。但药后7 d，0.3%印楝素乳油对柑橘木虱具有良好的防治效果，可以将若虫密度控制在较低的水平，与对照药剂25%噻虫嗪水分散粒剂的防效无显著差异。以上结果表明，0.3%印楝素乳油对柑橘木虱若虫的速效性较差，并且试验发现印楝素对柑橘木虱成虫没有防治效果，这与室内活性测定结果一致。
表2 0.3%印楝素乳油对柑橘木虱若虫的田间防效
Table 2 Field control effect of 0.3% azadirachtin EC on the nymphs of D. citri (%)
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
药后7 d 7 days after treatment 0.3%印楝素800倍液0.3% azadirachtin 800 diluent 14.35±0.92b 49.56±3.01b 86.40±5.86a 25%噻虫嗪3500倍液25% thiamethoxam 3500 diluent 99.32±0.08a 98.12±1.73a 93.45±1.07a处理Treatment药后1 d 1 day after treatment药后3 d 3 days after treatment
3 讨论
本试验测定了印楝素对柑橘木虱若虫和成虫的毒杀活性及田间防治效果，评价了印楝素在柑橘木虱防治工作中的应用潜力。试验发现，印楝素对柑橘木虱若虫具有良好的毒力，但对成虫没有毒杀活性。这与印楝素独特的作用机理有关，印楝素主要通过干扰昆虫幼虫的神经内分泌系统，降低蜕皮激素滴度进而抑制昆虫的生长发育［16,20］。值得注意的是，印楝素对柑橘木虱若虫的速效性较差，试验发现一般药后3～5 d才能观察到明显的死亡现象。在其他害虫如大豆蚜Aphis glycines、闹羊花网蝽Stephanitis pyrioides、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda等［21-23］防治中，也发现印楝素的毒杀作用见效均较慢。这些现象与除虫脲、灭幼脲、吡丙醚等其他昆虫生长调节剂作用效果类似，在使用时不直接杀死昆虫，而是在昆虫发育时期阻碍或干扰其正常发育，使其活动能力下降、死亡，进而控制种群的密度［24］。因此，印楝素需要在柑橘木虱若虫低龄期施用，或与低毒的速效杀虫剂复配使用，既有速效作用又能发挥印楝素的特异性。
抗药性是目前柑橘木虱防治中面临的重要问题之一。柑橘木虱作为黄龙病的田间唯一传播媒介昆虫，鉴于黄龙病的破坏性，果农在柑橘园中频繁使用化学农药，长期以来常规的有机磷类、新烟碱类和氨基甲酸酯类农药单一品种和高剂量的使用，进一步加剧了木虱的抗药性。与化学农药相比，生物农药尤其是植物源农药往往具有多重作用机制，不易引起昆虫产生抗药性，已经成为害虫防治中的重要手段之一［15,25］。印楝素是目前世界上公认的最优秀植物源农药，由于其独特的作用机理，对害虫无抗药性，而且低毒、低残留，对人畜和环境安全。印楝素在柑橘木虱防治中具有良好的应用潜力。
4 结论
本试验结果表明，印楝素对柑橘木虱若虫具有良好的毒力，但对成虫没有毒杀活性。6.0 mg/L印楝素对柑橘木虱三龄若虫药后7 d的LC50值为0.61 mg/L，0.3%印楝素乳油800倍液对柑橘木虱若虫药后7 d的田间防效为86.4%。
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