【研究意义】大顶苦瓜（Momordica charantia Linn.）为葫芦科苦瓜属1年生草本蔓生蔬菜，是广东省的著名蔬菜品种，具有个大、肉厚、皮色翠绿、口感脆嫩的特点，并具较高的营养价值和药用功效［1］，长期以来畅销我国华南地区并远销东南亚国家。随着大顶苦瓜被越来越多的消费者接受，其种植面积日益加大，但存在严重的重茬连作问题引发各种蔬菜疫病如苦瓜枯萎病等土传病害的暴发。传统的苦瓜嫁接栽培技术利用砧木良好的抗病性等特点，已大大降低了苦瓜栽培时的死亡率，但依旧存在生产成本过高、生长周期长、费用高等缺点。微嫁接是一种由组织培养的接穗与砧木进行嫁接的技术，它是植物组织培养与嫁接技术的结合［2］。微嫁接已被广泛应用于植物病毒快速检测［3-4］、珍贵育种材料繁殖保存、植物病毒脱除［5］、接口部位生理与组织结构研究以及工厂化苗木快繁等方面［6］。微嫁接通常分试管内嫁接和试管外嫁接两种［7］：试管内微嫁接技术开发于1972年［8］，该技术中不同品种的砧木与接穗均为组培苗，在组织培养条件下进行嫁接；试管外微嫁接技术是将无毒的组培苗作为接穗、种子萌发而成的健壮种苗作为砧木，在自然环境中进行嫁接。与常规的嫁接方法相比，试管外微嫁接具有其自身特有的优越性［9］，如作为组培苗来源的接穗生长周期短、费用低、占地少；接穗不受季节限制和环境影响，可随时从实验室取材；种子发育而来的砧木可为接穗提供充足的营养来源，抵抗病害，促进接穗快速生长。【前人研究进展】虽然微嫁接技术已应用于枣［10］、柑橘［11］、苹果、葡萄、桃、沙田柚和龙眼等多种果树［1］，以及金焰彩栾［12］、麻疯树［13］等木本植物的研究和生产中，但由于蔬菜组培苗的组织幼嫩、操作技术要求高、培养条件严格，目前为止尚无在苦瓜乃至蔬菜类种植中应用的报道。【本研究切入点】前期相关研究已表明，在相同的栽培条件下，苦瓜组培苗长势普遍较对应的种子苗弱，但是其叶色、分枝性、果实形态特征、单瓜重量和单株产量与种子苗无明显差异，且具有提早成熟、整齐度高等优点［14］。【拟解决关键问题】本试验对大顶苦瓜组培苗在试管外微嫁接技术进行了研究，以期提高大顶苦瓜组培苗的栽培水平，为今后蔬菜类试管外微嫁接技术在工厂化育苗的推广及应用提供新途径。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试接穗材料为2017年3月在广州市农业科学研究院南沙展示基地种植的顶培1号苦瓜，是该研究院选育的杂交品种单株组培扩繁苗；砧木选择丝瓜银砧1号、丝瓜银砧2号和南瓜海砧1号，购自福建省农业科学院品种资源研究所。
1.2 试验方法
1.2.1 接穗的获得 取顶培1号苦瓜萌发的顶芽或侧芽为外植体，经消毒灭菌后逐步接种在诱导、继代培养基上，外植体的具体培养方法参照文献［14］进行。培养约20 d后，将生长健壮、茎干直径达0.2～0.25 cm、高5～7 cm的组培苗进行强光炼苗4～9 d，再剪成带2个芽的茎段作为接穗，将接穗下部削成楔形，然后将其置于在一定浓度（0、0.3、0.5、0.7 mol/L）的6-BA中浸蘸5 s，备用。
1.2.2 砧木的培养 南瓜或丝瓜的种子先经过50～60℃温水浸种和31～33℃催芽处理，待种子芽露白后，播种于已浇足浇透水的营养钵中，再盖上一层经多菌灵（稀释200倍）灭菌的细沙土。种子播种后仍保持基质湿润，将约7 d后发芽并长出一定数量真叶的植株作为砧木。
1.2.3 嫁接方法 由于蔬菜组织较为细嫩，本研究采用劈接法。待南瓜或丝瓜长出真叶后，剪去真叶和中心生长点，只留两片子叶，且从两片子叶中间劈开，将底部削成楔形的接穗插入砧木切口，用橡皮套管+嫁接夹、封口膜、保鲜膜缠绕等不同保湿材料进行保湿和固定处理，7 d后去除绑接材料。
1.2.4 嫁接后培养 嫁接后，将嫁接苗置于温室内的全封闭小拱棚内，温度保持在25～30℃，每天对嫁接部位喷洒一定浓度（0%、3%、6%、9%）的蔗糖溶液。前4 d拱棚内保持在一定的高湿度（85%、90%、95%、100%）条件，用黑纱全遮光处理；从第5天开始逐渐通风，降低棚内湿度至80%～85%，逐渐增加光照直至接穗发芽并长出2片新叶，撤去遮光黑纱；1周后及时剪去砧木发出的萌蘖；约20 d后获得嫁接苗的杯苗，再移栽到大田种植。
1.2.5 试验数据统计分析 每组试验取25～30株外植体，3次重复，取平均值。试验数据采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行方差分析和邓肯多重比较。
芽长增加量（cm）=成活嫁接苗接穗长度-嫁接当天接穗长度
株高增加量（cm）=成活嫁接苗总株高-嫁接当天总株高
2 结果与分析
2.1 嫁接口的固定保湿条件对大顶苦瓜嫁接苗成活率的影响
与试管内微嫁接能保持恒温恒湿条件不同，本试验的嫁接操作均在普通大气环境中进行，因此嫁接口的保湿对接口的愈合起着至关重要的作用。但组培芽组织相对于取自种子苗的芽又非常细小幼嫩，稍有不慎就容易干枯，因此对嫁接部位固定和保湿条件的选择需非常谨慎。本试验主要采取橡皮套管+嫁接夹、封口膜和保鲜膜等3种方式对嫁接伤口进行固定、愈合和保湿处理。由于蔬菜作为嫁接材料比较细小，用封口膜和保鲜膜缠绕嫁接口的操作比较费时费力，并且在操作过程中易使接穗脱落，在这两种方式下嫁接成活率仅为12%～14%。而嫁接夹操作要比用封口膜和保鲜膜缠绕简捷，配上橡皮套管会显著提高保湿效果，成活率达到62.7%。约7 d后可取下嫁接夹（图1），统计嫁接成活率。
嫁接后前4 d，小拱棚中湿度的保持对大顶苦瓜嫁接苗的成活率也有很大影响。随着湿度的增加，大顶苦瓜嫁接苗成活率也逐步提高，但湿度太高也容易造成霉菌滋生，从而导致嫁接苗腐烂。当湿度为85%、90%时，嫁接成活率分别为40.9%和52.3%；当湿度保持在95%时，嫁接成活率最高、达到60%以上；但当湿度继续升高为100%时，由于大部分苗腐烂，嫁接成活率反而低于40%。
图1 大顶苦瓜嫁接苗采用嫁接夹（左）及嫁接7 d后长势（右）
Fig. 1 The broad-shoulder bitter gourd micrografted with grafting clip (left) and the growth vigor after 7 days (right)
2.2 接穗炼苗时间对大顶苦瓜嫁接苗成活率和接穗长度增加量的影响
由于作为接穗的顶培1号组培苗不定芽长期生长在恒温恒湿、恒定光照并且完全无菌的环境中，将其移栽至自然条件下需要经过一段适宜的炼苗环节。不同的炼苗时间对嫁接成活率以及嫁接后接穗长度的增加量都有一定影响。由表1可知，炼苗时间低于5 d时，嫁接成活率较低，接穗增长不明显；炼苗时间6～7 d，嫁接成活率超过60%，接穗增加量与其他时期有明显差异；随着炼苗时间的延长，接穗增加量稍有增加，但嫁接成活率又逐渐下降，9 d后下降到不足40%。因此，苦瓜组培苗最适宜的炼苗时间为6～7 d。
表1 接穗炼苗时间对大顶苦瓜嫁接苗成活率和接穗长度增加量的影响
Table 1 Effect of different hardening time on the survival rate and increment in scion length of the micrografted seedlings
注：（1）表中数据均为嫁接后15 d统计结果；（2）同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: (1) All datas are recorded after micrografting for 15 days; (2)The different lowercase letters in the same column represent significant differences .
芽长增加量Increment in scion length （cm）4 42.60±2.12c 0.12±0.05c 5 49.80±2.31b 0.30±0.08b 6 65.30±3.62a 0.52±0.03a 7 60.10±3.15a 0.49±0.04a 8 50.50±2.11b 0.54±0.06b 9 36.70±1.58c 0.55±0.02c炼苗时间Seedling hardening time （d）嫁接成活率Survival rate of micrografting（%）
2.3 砧木种类和苗龄对大顶苦瓜嫁接苗成活率和株高增加量的影响
不同种类的砧木以及砧木的木质化程度会直接影响嫁接成活率。本试验分别以丝瓜银砧1号、丝瓜银砧2号和南瓜海砧1号作为砧木，研究当2片真叶长度0、0.5、1.0、1.5 cm时，嫁接15 d后对大顶苦瓜嫁接苗成活率以及株高增加量的影响。从表2可以看出，当丝瓜银砧1号的2片真叶长度达0.5 cm时，大顶苦瓜嫁接苗的成活率和株高增加量均较高；南瓜海砧1号真叶0.5 cm时，大顶苦瓜嫁接苗的株高增加量最大，但是嫁接成活率明显低于银砧1号，因此首选带有2片约0.5 cm真叶苗龄的银砧1号作为砧木进行微嫁接。
表2 砧木种类和苗龄对大顶苦瓜嫁接苗成活率和株高增加量的影响
Table 2 Effect of species and ages of rootstocks on the survival rate and increment in height of the micrografted seedlings
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: The different lowercase letters in the same column represent significant differences .
砧木真叶长度Length of the rootstock true leaves （cm）株高增加量Increment in height（cm）0 16.10±1.30c 0.61±0.10b 11.2±1.01c 0.53±0.06b 10.5±1.11c 0.67±0.09a 0.5 63.8±2.65a 0.75±0.12a 58.4±2.34a 0.62±0.08a 47.2±2.03a 0.76±0.11a 1.0 52.3±2.11b 0.70±0.09a 47.6±2.10b 0.53±0.05b 36.1±1.86b 0.55±0.06b 1.5 25.6±1.52c 0.42±0.05c 23.1±1.44c 0.26±0.03c 22.4±1.42c 0.30±0.04c银砧1号Yinzhen No.1 银砧2号Yinzhen No.2 海砧1号Haizhen No.1嫁接成活率Survival rate of grafting（%）株高增加量Increment in height（cm）嫁接成活率Survival rate of grafting（%）株高增加量Increment in height（cm）嫁接成活率Survival rate of grafting（%）
2.4 6-BA浓度和蔗糖浓度对大顶苦瓜嫁接苗生长的影响
2.4.1 6-BA浓度 植物生长调节剂特别是生长素在嫁接过程中起着至关重要的作用，能减轻氧化作用，促进形成层活动，产生大量愈伤组织，形成维管束系统，从而促使嫁接口相互愈合，提高嫁接苗的成活率以及株高增加量。因此，本试验将接穗末端置于含有0、0.3、0.5、0.7 mol/L 6-BA溶液中浸蘸3 s，结果（表3）表明，在接穗末端接口部位浸蘸6-BA后，确实能够明显提高嫁接成活率，并且随着6-BA浓度的增加，接穗嫁接成活率也相应提高，当6-BA浓度为0.5 mol/L时成活率最高、达65.3%；浸蘸6-BA对嫁接苗的株高增长有一定的促进作用，但与不浸蘸6-BA相比没有显著差异。
表3 6-BA浓度对大顶苦瓜嫁接苗生长的影响
Table 3 Effect of different concentrations of 6-BA on the growth of the micrografted seedlings
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: The different lowercase letters in the same column represent significant differences.
株高增加量Increment in height（cm）0 30.1±2.11c 0.22±0.05a 0.3 52.6±2.41b 0.25±0.08a 0.5 65.3±3.32a 0.23±0.03a 0.7 56.3±3.25b 0.28±0.04a 6-BA 浓度6-BA concentration（mol/L）嫁接成活率Survival rate of micrografting （%）
2.4.2 蔗糖浓度 有研究认为，蔗糖对果树类植物微嫁接植株的叶片大小、总叶片数、叶片生长量及新根比例等都有一定的促进作用［16］，因此本试验在嫁接操作后采用对嫁接口喷洒一定浓度蔗糖水的方式提高嫁接成活率。从表4可以看出，与喷洒清水相比，对嫁接口喷洒蔗糖水能明显提高嫁接成活率，嫁接成活率都在50%以上，其中当蔗糖质量分数为6%时，嫁接成活率最高达65.9%。但喷洒蔗糖与否对株高增加量没有显著促进作用。
表4 蔗糖浓度对大顶苦瓜嫁接苗生长的影响
Table 4 Effect of different concentrations of sucrose on the growth of the micrografted seedlings
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: The different lowercase letters in the same column represent significant differences.
株高增加量Increment in height（cm）0 32.6±2.09c 0.19±0.02a 3 50.1±2.52b 0.24±0.06a 6 65.9±3.61a 0.22±0.04a 9 52.9±3.01b 0.23±0.05a蔗糖质量分数Sucrosemass fraction（W/V, %）嫁接成活率Survival rate of micrografting （%）
2.5 大顶苦瓜微嫁接苗的大田移植和栽培
本试验采用的接穗组培苗试管外微嫁接技术可以直接获得微嫁接杯苗，嫁接成活后的大顶苦瓜杯苗培养28 d左右可以长到30～35 cm，直接移到大田栽培后成活率可达60%以上（图2）。
图2 大顶苦瓜微嫁接杯苗培养28 d（左）及2个月（右）长势
Fig. 2 The growth vigor of micrografted cup seedlings of the broad-shoulder bitter gourd cultured after 28 days (left) and 2 months (right)
3 讨论
枣类试管外嫁接结果表明，微嫁接口的固定以及保湿方法是影响组培苗试管外嫁接成活率高低的首要关键因素［10］。在本试验中，接穗为蔬菜作物的组培苗，相对于果树而言更加幼嫩、个体更小，因此，选择保湿效果好、操作简便的保湿材料尤为重要。本试验嫁接口选用橡皮套管+嫁接夹的方式，既有良好的保湿作用，又简便易行，显著提高了嫁接成活率；并且在后续试验中，用过的橡皮套管和嫁接夹经过消毒后还能继续使用，降低了生产成本。
影响组培苗试管外嫁接成活率高低的第二个关键因素是接穗质量。接穗应尽量挑选健壮的芽，嫁接前用植物生长调节剂（如6-BA）浸蘸削好的楔形底部，更有利于接穗生长；其次应进行强光炼苗，因为强光炼苗可以诱导幼嫩的组培苗茎叶保护组织的形成和恢复气孔调节功能，使其对水分胁迫和环境因子的抗性明显增强，这与及华等［15］研究结果一致。炼苗时间短于5 d，接穗组培苗木质化程度不足，嫁接时容易干枯，随着炼苗时间延长至8 d后，组培苗茎杆的木质化程度提高，与砧木的伤口不易愈合，嫁接苗的成活率逐渐下降，接穗增长量虽然有所增加却未达到显著差异，这与成密红等［17］、王国平等［18］研究结果一致。
以往研究均表明，砧木的种类和苗龄对嫁接苗成活与否常起着关键作用。在本试验中，砧木第1次出现两片真叶且长度达到0.5 cm时，嫁接效果最佳，随着砧木苗龄增加，嫁接效果变差，且以丝瓜作为砧木的微嫁接成活率高于南瓜为砧木。这可能是由于砧木苗龄越大，维管组织成熟度越高，愈伤形成能力下降，接穗无法及时从砧木获得营养物质而干枯死亡所致。与南瓜相比，丝瓜与苦瓜更易亲和。
组培苗嫁接后的管理也是嫁接成败的关键，除了嫁接口的保湿外，周围环境的湿度也很重要。以往研究表明，湿度通常应该前期高后期低，之后湿度逐渐降低至与周围环境湿度一致。嫁接苗前期遮荫也有利于嫁接口的伤口愈合。我们经过多次试验发现，当环境湿度达到100%时，霉菌滋生严重，造成嫁接苗大多腐烂、成活率较低；而环境湿度过低，接穗容易失水枯萎。有研究表明，一定浓度的蔗糖水对嫁接苗的成活和生长有一定的促进作用，本研究在嫁接后尝试采用喷洒一定浓度蔗糖水的方法，嫁接成活率确有提高，但是嫁接苗株高增长量没有提高，这可能是蔗糖作为碳源促进了组培苗接穗的成活。
本试验采用的组培苗试管外微嫁接技术，可以直接获得微嫁接杯苗，中间减少了组培苗生根及炼苗后移栽等环节，嫁接成活后的杯苗培养28 d左右可以长到30～35 cm，直接移到大田栽培成活率可达60%以上。这种微嫁接营养杯苗可周年生产，不受季节限制，且1株5～7 cm高的组培苗可以获得2～3个接穗，降低了生产成本。苦瓜组培苗试管外微嫁接技术的应用，将有利于提高苦瓜组培苗的栽培成活率、缩短苦瓜的育种年限，并为其他蔬菜类作物试管外微嫁接技术的开发提供借鉴。
4 结论
首次建立了大顶苦瓜组培苗试管外微嫁接技术体系。在该体系中，大顶苦瓜组培苗接穗最适宜的炼苗时间为6～7 d；嫁接口的固定和保湿对嫁接成活与否很重要，采用橡皮套管加嫁接夹包裹嫁接口操作容易，保湿效果显著；选择带两片真叶的丝瓜银砧1号作为砧木嫁接成活率高；嫁接前，接穗末端浸蘸0.5 mol/L 6-BA，并且在嫁接后每天喷洒6%蔗糖溶液可以大大提高嫁接苗的成活率，获得最高嫁接成活率是65.9%。该技术的应用将改善在相同栽培条件下，苦瓜组培苗长势比实生苗弱的特点，提高苦瓜组培苗的成活率。
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