【研究意义】花生是世界上最主要的油料经济作物之一，是大部分非发达国家和地区人们的植物油和蛋白质的主要来源，其营养价值极高。我国花生种植面积占所有油料作物种植总面积的1/4，总产量却占全国油料作物总产量的50%以上，为我国的经济发展及贸易出口等作出了极其重要的贡献［1］。细菌性青枯病是一种具有极大毁灭性的土传病害，其病原为茄青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）［3-4］。青枯病是当前世界发生范围最广、危害最大、引起损失最重的一种病害。由此造成的花生减产一般为10%～20%，严重时可高达70%，甚至绝收。在很多作物中尚未有有效的防治措施，因此该病害也被称为植物的“癌症”［4］。由于青枯菌在寄生范围、致病能力、生化型等特性上存在很大差异，增加了这种病害的防治难度［3］。数十年来大量的研究者以不同的切入点对青枯菌进行全面的研究探索，虽然取得了一定的进展，但是未能解决生产上的问题。筛选花生青枯病的生物防治菌株对于该病原菌的防控有重要意义，尤其目前我国大力提倡农药减量的防控。【前人研究进展】近些年来，青枯雷尔氏菌的生物防治越来越多地引起了国内外专家学者的重视。目前已经分离不同的潜在生防菌株，如青枯假单孢杆菌（Pseudomonas solanacarum Smith）［5］、链霉菌（Streptomyces spp.）［6］、假单胞杆菌（Pseudomonadaceae）［7］、芽孢杆菌（Bacillus）［8］和闸坡链霉菌（Streptomyces zhapoensis）［9］等。筛选到的生物防治菌株包括真菌、细菌和放线菌等。【本研究切入点】虽然前期开发了一些生防制剂，但普遍存在防效不稳定的现象，因此希望开发出更多的生防制剂进行替代和补充［10］。【拟解决的关键问题】筛选到对花生青枯病有较好拮抗作用的生物防治细菌菌株，并进行鉴定，为该病的生物防治打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试花生青枯病致病菌株由仲恺农业工程学院植物病理实验室分离保存。供试培养基为改良的PDA培养基、TTC平板等培养基，其配置参照植物病原细胞研究技术［11］。盆栽试验花生品种为航花3号，由仲恺农业工程学院郑奕雄教授提供。
1.2 试验方法
1.2.1 花生青枯菌拮抗菌株的分离和纯化 将采集自广州市内公园及仲恺农业工程学院校园的土样进行风干处理，将风干的10 g植株根部土壤放入装有90 mL无菌水的三角瓶中, 放入摇床以170 r/min振荡30 min, 制成土壤悬浮液。经过稀释后涂NA平板，再放入28 ℃黑暗的恒温箱中培养,48 h后挑选出其中典型的单菌落, 经平板划线进行纯化, 并放入4°C冰箱保存待用。
1.2.2 花生青枯病拮抗菌的筛选 经纯化的菌株用点接法进行初筛，操作过程如下: 将培养的青枯病菌悬液浓度稀释为1×108 CFU/mL, 从中取0.1 mL均匀地涂抹于NA平板上, 将灭菌后小圆片浸入土壤分离菌中，再放入涂有青枯病菌的平板中央。每个分离物重复3次。于28℃恒温箱中培养48 h后观察拮抗效果。
1.2.3 拮抗菌发酵液对花生青枯病菌的抑制作用 将抑制效果较好的拮抗菌株接种到NB液体培养基中，在30 ℃下于170 r/min的摇床中培养2 d，将发酵液在12 000 r/min下离心20 min, 取上清液，经过滤灭菌，获得无菌发酵液。将浸过无菌发酵液的圆片放入涂有青枯病菌的平板中央。每个拮抗菌株重复3次。于28℃下恒温箱中培养48 h后观察拮抗效果，计算抑制率。
1.2.4 拮抗菌的盆栽防治试验 盆栽防治试验使用4～5片叶子的苗期进行试验。先用灌根法接种生防菌，48 h后再接青枯雷尔氏菌液，每种生防菌发酵液浇灌60株植株。以60株直接接种青枯雷尔氏菌液（1.0×108 CFU/mL）20 mL作为对照，每个处理3次重复。接种青枯雷尔氏菌液3 d后开始记录花生植株的生长和发病情况，持续观察30 d。计算病株率和防治效果。
1.2.5 拮抗菌A38的鉴定 菌株总DNA提取利用东盛生物的细菌基因组DNA快速提取试剂盒进行。PCR扩增引物使用细菌16S rDNA通用引物27F/1492R（White等, 1990）。将扩增产物送交上海英潍捷基贸易有限公司测序，测序得到的结果在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）上进行比对分析。使用软件MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis，Version6.0）进行序列比较，采用Kimura 2-parameter（Kimura-2参数）模型，采用neighbor joining 程序，boot strap 为1 000次。菌株的生理生化性状参照《伯杰氏系统鉴定手册》（第2版）和《常见细菌鉴定手册》。
2 结果与分析
2.1 花生青枯菌拮抗菌发酵液对花生青枯病菌的抑制作用
采用平板稀释法从植物根际土壤中分离出300余株形态和颜色不同的细菌菌株，对这些菌株进行花生青枯菌拮抗试验。结果表明，对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的菌株有7株，约占总菌株数的1.8%左右，抑菌圈直径范围为5.0～16.0 mm，菌株为Aa、Ab、Af、Ai、A9、A27 和A38，其中A38菌株对花生青枯菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为16.0 mm，其次为Ab和A27菌株，抑菌圈直径分别为11.5 mm和13.5 mm（表1）。
表1 拮抗菌株对青枯雷尔氏菌的抑制效果
Table 1 Inhibitory effect of antagonistic bacterial strains on R. solanacearum
注：同列数据后大写英文字母不同者表示经Duncan's新复极差法测验差异极显著。
Note: The different capital letters in the same column represent significant difference obtained by Duncan's new multiple process test.
抑制圈直径Diameter of inhibition zone (mm)Aa 5.0±0.100F Ab 11.5±0.088C Af 5.5±0.058F Ai 6.0±0.120E A9 8.5±0.120D A27 13.5±0.186B A38 16.0±0.145A菌株Strain
2.2 拮抗菌株无菌滤液对青枯雷尔氏菌的抑制作用
选择抑菌圈直径大于10.0 mm的3个菌株Ab、A27和A38的无细胞发酵液进行抑菌测定，结果显示，3个菌株Ab、A27和A38的无细胞发酵液对青枯病菌都有明显的抑制作用，抑制圈直径分别为9.5、10.5、15.0 mm，差异极显著，表明3株细菌的胞外分泌物对青枯雷尔氏菌起拮抗作用。
2.3 生防菌盆栽防治效果
利用前期在平板拮抗试验中对花生青枯菌有较好拮抗作用的3个菌株进行盆栽防治试验，结果（表2）表明，拮抗菌Ab、A27和A38对花生青枯病均具有一定的防治效果，防治效果分别为12.16%、25.66%和52.71%，以A38菌株的防治效果较好，此防效有一定的研究价值，可进一步进行大田试验。
表2 拮抗细菌对花生青枯菌的温室盆栽防治效果
Table 2 Control effects of antagonistic bacteria on bacterial wilt of peanuts in greenhouse
注：同列数据后大写英文字母不同者表示经Duncan's新复极差法测验差异极显著。
Note: The different capital letters in the same column represent significant difference obtained by Duncan's new multiple process test.
防治效果Control effect（%）Ab 43. 33±1.667AB 12.16 A27 36. 67±1.667B 25.66 A38 23.33±1.667 C 52.71清水对照CK 49.33±3.512A处理Treatment病株率Rate of diseased stains（%）
2.4 A38菌株的鉴定
利用通用引物 27F/1492R 对生防菌A38的16S rRNA 基因进行 PCR 扩增，获得大小为1 435 bp 产物，并与 GenBank 上序列进行比对，结果显示，与菌株A38 16S rDN A序列相似性99%的细菌只有Pseudomonas aeruginosa。
菌株A38在NA培养基上的菌落为圆形，其颜色乳白不透明，表面有光泽、粘稠状、微隆起、边缘光滑、整齐、波状，在革兰氏染色中为阴性。
根据上述基因序列分析结果，参照《伯杰氏系统鉴定手册》（第2版）选择19项生理生化性状进行测定，结果(表3）显示，菌株A38不仅能对部分糖或醇如木糖、核糖、半乳糖和葡萄糖等都能进行有效的利用，并且菌株A38能使明胶液化，但不能进行反硝化作用，能在42℃下生长，但却不能在8.5%NaCl下生长。生理生化特征测定结果也表明A38菌株的特性与绿脓假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）的特性相似，相似性达78.95%。
表3 生防菌A38的生理生化特性
Table 3 Physiological and biochemical characteristics of biocontrol bacterium A38
注:“+”为阳性, “-”为阴性。
Note:“+” represents positive,“-” represents negative.
绿脓假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa性状Characteristic A38 菌株Strain A38明胶液化 Gelatin hydrolysis + +淀粉水解 Starch hydrolysis - -42℃生长 Growth at 42℃ + +8.5%NaCl生长 Growth at 8.5%NaCl - -46℃生长 Growth at 46℃ - -麦芽糖 Maltose - -木糖 Xylose - -甘露醇 Mannitol + +乙二醇 Ethylene glycol - -反硝化作用 Denitrification + -甘露糖 Mannoase - +丙氨酸 Alanine + +果糖 Fructose + +半乳糖 Galactose - +葡萄糖 Glucose + +核糖 Ribose + +丙三醇 Glycerin + +革兰氏染色 Gram stain - -
3 讨论
国内外筛选出的生防菌有不少都得到了推广利用，防治效果比较具有优势的如弱毒性青枯假单孢杆菌的使用、荧光假单孢杆菌及芽孢杆菌的利用［12-13］。测定的生防菌的防效还不是很高，希望进一步筛选获得防效更高的生防菌。福建省农科院培育出的青枯病生防菌ANTI-8098A对青枯病的控制效能较好［14］。本试验从作物根际土壤中分离得到300余种菌株，通过多次平板拮抗试验，有3株拮抗菌室内试验筛选中对青枯雷尔氏菌抑制效果较好，分别为Ab、A27、A38菌株。再使用对花生青枯病中抗的花生品种航花3号进行进一步的盆栽试验。拮抗菌株A38的防效显著高于其他两个菌株，防效达到52.71%。该菌株可进一步用于花生青枯病菌的生物防治与利用。
利用16S rRNA基因往往能进行到属水平的鉴定，但却不能鉴定到种，往往还需要借助其他基因进行进一步的鉴定。喻国辉等［15］基于16S rRNA基因的测序结果构建系统发育树无法区分种间关系，而利用gyrB基因构建系统发育树则目的菌与Bacillus subtilis在同一个分支上，但无法区分与哪个变种的亲缘关系比较近。王成义等［16］使用16S rRNA基因和recA基因扩增香鱼鳗利斯顿氏菌并构建系统发育树，认为recA基因比16S rRNA基因更具有种间的分辨力。细菌的鉴定往往除了利用16S rRNA基因进行，还需要辅以其他基因共同进行，或者进行生理生化的测试共同进行。本研究利用16S rRNA和生理生化指标，将对花生青枯病有拮抗效果的A38菌株鉴定为绿脓假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）。
4 结论
本研究筛选到一株对花生青枯病有较好拮抗作用的菌株A38，初步鉴定为绿脓假单胞杆菌。利用盆栽试验验证该菌株的防治效果较好，达到52.72%。
［1］ 郑弈雄. 南方花生产业技术学［M］. 广州：中山大学出版社，2009.
ZHENG Y X. Peanut Industry Technology in South China［M］.Guangzhou: Zhongshan University Press, 2009.
［2］ FRENCH E, KIM B S, RIVERA-Zuluaga K, IYER-Pascuzzi A S.Whole root transcriptomic analysis suggests a role for auxin pathways in resistance to Ralstonia solanacearum in tomato［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions : MPMI, 2018, 31(4): 432-444. doi: 10.1094/MPMI-08-17-0209-R.
［3］ 华丽霞，何炼，蒋秋平，曾华兰，叶鹏盛，韦树谷，黄玲，代顺冬. 不同产区花生青枯病菌遗传多样性的分析［J］. 基因组学与应用生物学，2018，37（3）：1349-1355. doi: 10.13417/j.gab.037.001349.
HUA L, HE L X, JIANG Q X, ZENG H G, YE P S G, WEI S L, HUANG L, DAI S D. Genetics diversity analysis of Ralstonia solanacearum on peanut from different producing areas［J］. Genomics and Applied Biology, 2018, 37(3): 1349-1355.
［4］ 周桂元，梁炫强，李一聪，李少雄. 花生青枯病抗性鉴定及抗源分析, 花生学报，2003，32（3）：25-28. doi：10.14001/j.issn.1002-4093.2003.03.005.
ZHOU GY, LIANG X Q , LI Y C, LI S X. Evaluation of peanut cultivars for resistance to bacterial wilt and analysis of family tree［J］. Journal of Peanut Science, 2003, 32 (3): 25-28.doi：10.14001/j.issn.1002-4093.2003.03.005.
［5］ 罗宽，何昆, 匡传富, 周志成. 三株拮抗细菌对烟青枯病的抑制效果［J］. 2002, 18(4): 185-187. DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2002.04.010.
LUO K, HE K, KUANG C F, ZHOU Z C. Studies on the inhibition of antagonistic bacteria to tobacco bacterial wilt, Ralstonia solanacearum［J］. Chinese Journal of Biological Control. 2002, 18(4): 185-187.
［6］ 何礼远，康耀卫. 利用青枯菌无毒菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病性［J］.植物保护学报，1990，17（2）：113-116. doi:10.13802/j.cnki.zwbhxb.1990.02.005.
HE L Y, KANG Y W. Induced resistance of peanut produced by avirulent strains of Ralstonia solanacearum and fluorescent-Pseudomonad［J］. Acta phytophylacica sinica, 1990,17(2): 113-116.doi: 10.13802/j.cnki.zwbhxb.1990.02.005.
［7］ 郭坚华，王玉菊，李瑾，任欣正. 抑菌圈－定殖力双重测定法筛选青枯病生防细菌［J］. 植物病理学报，1996，26（1）：49-54. DOI:10.13926/j.cnki.apps.1996.01.014.
GUO J H, WANG Y J, LI J, REN X Z. Screen of biocontrol bacteria of plant wilt by inhibiting zones and root-colonizing capacity［J］. Acta Phytophylacica Sinica, 1996, 26(1): 49-54.
［8］ 杨合同，任欣正，王少杰，王建平，高强.蕃茄根土区系中拮抗性细菌的分布与青枯病发生的关系［J］. 生物防治通报，1994，10（4）：162-165. doi: 10.16409/j.cnki.2095-039x.1994.04.004.
YANG H T, REN X Z, WANG S J, WANG J P, GAO Q. Study on distribution of antagonistic bacteria in root-soil system of tomato and ITS relation to occurrence of bacterial wilt［J］. Chinese Journal of Biological Control, 1994, 10(4): 162-165.doi: 10.16409/j.cnki.2095-039x.1994.04.004.
［9］ 蒲小明，林壁润，郑奕雄，沈会芳. 一株抗花生青枯病菌海洋放线菌的分类鉴定及其活性产物研究［J］. 广东农业科学，2011，38（16）：62-65. doi: 10.16768/j.issn.1004-874x.2011.16.039.
PU X M, LIN B R, ZHENG Y X , SHEN H F. Studies on taxonomic identification of a marine actinomycete against Pseudomonas solanacearum and its active product［J］. Guangdong Agricultural Sciences, 2011, 38(16): 62-65.doi:10.16768/j.issn.1004-874x.2011.16.039.
［10］ 樊胜南，喻国辉，陈燕红, 黎永坚, 陈川雁. 枯草芽孢杆菌TR21可湿性粉剂对香蕉根际土壤微生物的影响［J］. 广东农业科学，2018，45(10): 68-73. doi: 10.16768/j.issn.1004-874X.2018.10.011.
FAN S N, YU G H, CHEN Y H, LI Y J, CHEN C Y. Influence of Bacillus subtilis strain TR21 wettable powder on the banana rhizosphere microorganisms［J］. Guangdong Agricultural Sciences, 2018, 45(10):68-73. doi: 10.16768/j.issn.1004-874X.2018.10.011.
［11］ 游春平，刘凤权. 植物病原细胞研究技术［M］. 北京：中国农业出版社，2011.
YOU C P, LIU F Q. Plant Pathogenic Cell Research Technology［M］.Beijing: China Agricultural Press, 2011.
［12］ 张建华，任欣正，方中达. 青枯假单胞杆菌产生细菌素的研究［J］.南京农业大学学报，1987，10（3）：58-63.
ZHANG J H, REN X Z, FANG Z D. Studies on bacteriocin production of Pseudomonas solanacearum［J］. Journal of Nanjing agricultural university, 1987, 10(3): 58-63.
［13］ KOUMOUTSI A, CHEN X H, HENNE A, LIESEGANG H,HITZEROTH G, FRANKE P. VATER J. BORRISS R. Structural and functional characterization of gene-clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cycliclipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strains FZB42［J］. Journal of Bacteriology, 2004, 186(4): 1084-1096.doi: 10.1128/JB.186.4.1084-1096.2004.
［14］ 刘波. 青枯雷尔氏菌的生物学及其生物防治［M］.福州：福建省农科院农业生物资源研究所农业微生物研究中心，2003.
LIU B. Biology of Ralstonia solanacearum and its biological control［M］.Fuzhou:Agricultural Microbiology Research Center, Institute of Agricultural Biological Resources, Fujian Academy of Agricultural Sciences，2003.
［15］ 喻国辉，程萍，王燕鹂，陈远凤，陈燕红，黎永坚. 枯草芽孢杆菌TR21田间防治巴西蕉枯萎病的效果［J］. 中国生物防治学报，2010, 26(4): 497-500. doi: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2010.04.020.
YU G H , CHENG P, WANG Y L, CHEN Y F, CHEN Y H, LI Y J.Control effect of bacillus subtilis Strain TR21 on panama disease of banana brazil (Musa spp.)in fields［J］. Chinese Journal of Biological Control, 2010, 26(4): 497-500.doi: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2010.04.020.
［16］ 王成义，闫茂仓，陈少波，管敏鑫，单乐州，艾为明，谢起浪，蔡延马奔.基于16S rRNA和recA香鱼鳗利斯顿氏菌的分离鉴定［J］. 海洋通报， 2010，29（1）：84-90.
WANG C Y, YAN M C, CHEN S B, GUAN M X, SHAN L Z, AI W M, XIE Q L, CAI Y B. Isolation and identification of Listonella anguillarum from Plecoglossus altivelis based on 16S rRNA and recA［J］.Marine science bulletin, 2010, 29(1): 84-90.