【研究意义】随着我国对淡水资源保护力度加大，淡水水域养殖的空间逐渐被压缩，而内陆的盐碱水资源较为丰富，由于这类盐碱水域中离子组成复杂而且具有高盐、高碱和高pH等特点，不适用于一般的水产养殖。因此，开发培育耐盐碱性较强的罗非鱼品种对维持水产养殖业可持续发展意义重大。【前人研究进展】目前，尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）因其较强的适应性和较快的生长速度，在罗非鱼养殖中占据主导地位［1-2］，同时被认为是耐盐碱养殖品种培育的优良材料［3-8］。有研究表明，未经驯化的尼罗罗非鱼可以耐受的最高盐度为18［9］，经过盐度驯化的尼罗罗非鱼可以生存在盐度为32的咸水中［10］。【本研究切入点】农业农村部淡水水产种质资源重点实验室自2012年开展尼罗罗非鱼耐盐碱驯化与选育试验，对不同品系尼罗罗非鱼基础群体在盐碱水环境下的胁迫和生长进行了初步研究，结果表明，尼罗罗非鱼可以耐受一定范围的盐度、碱度，且能在盐碱水域中进行养殖［11］。在基础群体中筛选出耐盐碱性状优良、生长迅速的个体作进一步的选育工作，2013—2014年分别获得了盐碱选育F1代和F2代，选育F1代和F2代盐碱耐受性比基础选育群体有所提升，且各世代间的盐碱耐受性呈现上升趋势［12-16］。2015年和2017—2018年分别获得耐盐碱选育F3、F4、F5代。【拟解决关键问题】本研究拟通过急性致死实验对选育F3、F4、F5代鱼苗的半致死浓度进行测定与比较分析，为选育各世代盐碱耐受性提供数据，以期为尼罗罗非鱼耐盐碱选育积累资料。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2018年7月，分别选取本实验室保种的选育F2、F3和F4尼罗罗非鱼作为亲本，繁育出F3、F4和F5鱼苗，挑选活力高、规格相似（1 g左右）的个体进行急性盐度试验、急性碱度试验和盐碱混合试验。
急性盐度试验的不同梯度使用养殖场盐卤池内的盐卤水混合地下井水调制；急性碱度试验的不同梯度按比例将碳酸氢钠溶解在地下井水配制；盐碱混合试验用水的配制需要先用盐卤水调好盐度，然后按比例溶入碳酸氢钠。各试验组浓度梯度配制完成后静置2～3 d，取上清备用。试验用水温度在23.6～25.2 ℃之间，参照涂翰卿等［17］的方法调控pH 值约8.5，溶氧在5.5～7.8 g/L之间，这些指标均处于尼罗罗非鱼安全范围内［18］。试验用水盐度用 WYY-I 型光学折射盐度计测量，水温使用精确度为0.1℃的水银温度计测量。
1.2 试验方法
试验在室内400 L塑料桶中进行。对供试的F3、F4和F5代鱼苗单盐急性试验设置6个盐度梯度（21、22、23、24、25、26 g/L，记为 S21、S22、S23、S24、S25和S26）；单碱急性试验设置6个碱度梯度（2、4、6、8、10、12 g/L，记为A2、A4、A6、A8、A10和A12）；盐碱混合试验设置盐度（10、15、20 g/L）、碱度（2、4、6 g/L）之间相互组合产生9个试验组（S10A2、S10A4、S10A6、A15A2、S15A4、S15A6、S20A2、S20A4和S20A6）。每个试验组随机放入150条受试鱼苗，试验开始前2 d停止投喂，试验期间不投喂饵料、不换水，连续充气，保证溶氧充足。
试验期间每天记录受试鱼种死亡数量，以鳃盖停止活动、外来刺激无反应判别为死亡［19］。
式中，LC50为半致死浓度；XK为最大浓度对数；C为相邻浓度比值的对数；Pi 、Pi+1为各试验组的死亡率。
1.3 数据处理
用 SPSS 22.0软件进行数据分析，计算F3、F4和F5代鱼苗在不同盐度、碱度、盐碱混合浓度梯度中96 h的半致死浓度，以P＜0.05作为差异显著性水平。
2 结果与分析
2.1 急性盐度试验
急性盐度试验开始时，受试鱼苗出现应激反应，表现为体色发白，游动缓慢。随着试验的进行，F3代受试鱼苗在各盐度试验组中均有死亡出现，随着盐度的提高死亡率也随之升高，在S25试验组中受试鱼苗在48 h内死亡率达到97%，在S26试验组中受试鱼苗在24 h内死亡率达到94%；F4、F5受试鱼苗在S21和S22试验组中逐渐适应，累计死亡率较低或无死亡；S23、S24、S25盐度试验组受试鱼苗24 h内累计死亡率较高，随后累计死亡率上升趋势逐渐减缓；S26试验组中受试鱼苗几乎在48 h内全部死亡（图1）。选育F3、F4和F5代鱼苗的盐度半致死浓度分别为22.473、24.468、23.833 g/L，F4和F5代鱼苗急性盐度耐受性较F3代有所提高。
图1 盐度胁迫下不同时间尼罗罗非鱼F3、F4和F5代鱼苗死亡率
Fig. 1 Mortality rate of F3, F4 and F5 generations of Nile tilapia at different time under salinity stress
A：21 g/L盐度试验组；B：22 g/L盐度试验组；C：23 g/L盐度试验组；D：24 g/L盐度试验组；E：25 g/L盐度试验组；F：26 g/L盐度试验组A:Test group with a salinity of 21 g/L; B: Test group with a salinity of 22 g/L; C: Test group with a salinity of 23 g/L; D: Test group with a salinity of 24 g/L;E: Test group with a salinity of 25 g/L; F: Test group with a salinity of 26 g/L
2.2 急性碱度试验
急性碱度试验中，A2、A4和A6碱度试验组受试鱼苗影响较小并很快适应，A10、A12碱度试验组受试鱼苗应激反应较大，表现为活动能力下降，对外界刺激感知缓慢。在A2、A4和A6碱度试验组中，F3、F4和F5代受试鱼苗96 h内无死亡出现，A12碱度试验组的受试鱼苗96 h内全部死亡，F3、F4和F5代受试鱼苗在A8碱度试验组中48 h内累计死亡率较高，但随着试验进行，适应后累计死亡率上升趋势趋于平缓（图2）。选育F3、F4和F5代鱼苗的碱度半致死浓度分别为8.256、8.443、8.453 g/L，F4和F5代鱼苗碱度耐受性差异不大，略高于F3代。
图2 碱度胁迫下不同时间尼罗罗非鱼F3、F4和F5代鱼苗死亡率
Fig. 2 Mortality rate of F3, F4 and F5 generations of Nile tilapia at different time under alkalinity stress
A：8 g/L碱度试验组；B：10 g/L碱度试验组；C：12 g/L碱度试验组
A: Test group with analkalinity of 8 g/L; B: Test group with an alkalinity of 10 g/L; C: Test group with an alkalinity of 12 g/L
2.3 盐碱混合试验
盐碱混合试验S10A2、S10A4和S10A6试验组中，受试鱼苗几乎不受影响，S15A2、S15A4、S15A6、S20A2、S20A4和S20A6试验组中，受试鱼苗受盐碱胁迫影响较大，但S15A2、S15A4逐渐适应。S10A2、S10A4和S10A6试验组中F3、F4和F5代受试鱼苗96 h内无死亡出现；S15A2试验组中F3和F4代受试鱼苗96 h内累计死亡率较低，F5受试鱼苗适应较快，96 h内未见死亡出现；S20A4和S20A6试验组中F3、F4和F5代受试鱼苗在24 h内累计死亡率较高，96 h内受试鱼苗全部死亡；F3、F4和F5代受试鱼苗在相同盐度下都呈现死亡率随碱度上升而升高的趋势（图3）。在中盐度（S15）盐碱混合试验组中，F3、F4和F5代鱼苗的碱度半致死浓度分别为4.612、4.538、4.883 g/L，F5代在同一盐度条件下对碱度的耐受性高于F3和F4代。而在高盐度（S20）盐碱试验组中，F3、F4和F5代鱼苗碱度半致死浓度分别为1.861、1.875、1.782 g/L，各世代间差异不显著。
3 讨论
本研究中，在盐度急性胁迫下，尼罗罗非鱼选育F3、F4和F5代鱼苗的盐度半致死浓度分别为22.473、24.468、23.833 g/L，F5代与F4代间差异不显著，同时显著高于F3代。与前期各选育世代相比，选育F3、F4和F5代鱼苗的盐度半致死浓度高于基础选育群体（17.994 ～19.616 g/L）［12］、选育 F1代（21.625 ～21.628 g/L）［13］、选育 F2代（21.809 g/L）［14］。而李学军等［20］在不同种类罗非鱼耐盐性研究结果中得出，尼罗罗非鱼的96 h半致死盐度为14.9 g/L，说明经过盐碱选育后的尼罗罗非鱼对盐度的耐受能力得到了提高。通过各世代急性盐度试验结果比较，盐碱选育群体的盐碱耐受性逐代均得到了提高，但随着世代增加，盐度耐受性表现趋于稳定。
急性碱度胁迫下，尼罗罗非鱼选育F3、F4和F5代鱼苗的碱度半致死浓度分别为8.256、8.443、8.453 g/L，F3、F4和F5代鱼苗间差异不显著。除了与基础选育群体（7.648 ～7.777 g/L）［12］差异显著外，选育F3、F4和F5代鱼苗的碱度半致死浓度与选育 F1代（7.903 ～8.407 g/L）［13］ 和选育 F2代（8.514 g/L）［14］间差异不显著。说明盐碱选育对提升尼罗罗非鱼各世代的碱度急性胁迫耐受能力作用不明显。
一般认为，盐碱对鱼类的胁迫并不是单一因子作用，而是综合作用的结果［21-22］。研究表明，高盐度下彭泽鲫幼鱼的碱度耐受性低于低盐度下的碱度耐受性，这也表明盐碱混合条件下，盐度与碱度间存在联合毒性作用，其毒性比单盐、单碱更大［23］。本研究中，选育F3、F4和F5代鱼苗在低盐碱混合S10A2、S10A4和S10A6试验组中活动正常，未出现明显不良反应；当盐度升高到15、20 g/L时，随着碱度的增加，F4、F5代鱼苗体色加深，游动、反应缓慢，死亡增加，也说明盐、碱之间存在一定的协同作用。在低盐度（S10）盐碱混合试验中，S10A2、S10A4和S10A6组内均未鱼苗死亡情况，而基础群体（10 g/L盐度下碱度半致死浓度为 3.108 ～4.377 g/L）［12］、选育F1代（5.577 ～6.096 g/L）［13］和选育 F2代（5.925 g/L）［14］中都有死亡出现，表明在低盐度下盐碱选育对罗非鱼碱度耐受性效果明显提高；在中盐度（S15）盐碱混合试验组中，F3、F4和F5代鱼苗的碱度半致死浓度分别为4.612、4.538、4.883 g/L，明显高于基础群体（15 g/L盐度下碱度半致死浓度为2.144 ～2.183 g/L）［12］，但与选育F1代（3.940 ～4.794 g/L）［13］、 选 育 F2代（4.583 g/L）［14］间无明显差异；而在高盐度（S20）盐碱试验组中，F3、F4和F5代鱼苗碱度半致死浓度分别为1.861、1.875、1.782 g/L，与选育F1代（20 g/L盐度下碱度半致死浓度为1.778 g ～1.943 g/L）［13］和选育 F2代（1.897 g/L）［14］相比，差异均不明显。
图3 盐碱混合胁迫下不同时间尼罗罗非鱼F3、F4和F5代鱼苗死亡率
Fig. 3 Mortality rate of F3, F4 and F5 generations of Nile tilapia at different time under salinity-alkalinity stress
A：S15A2试验组；B：为S15A4试验组；C：S15A6试验组；D：S20A2试验组；E：S20A4试验组；F：S20A6试验组
A: Test group with salinity of 15 g/L and alkalinity of 2 g/L; B: Test group with salinity of 15 g/L and alkalinity of 4 g/L;
C: Test group with salinity of 15 g/L and alkalinity of 6 g/L; D: Test group with salinity of 20 g/L and alkalinity of 2 g/L;
E: Test group with salinity of 20 g/L and alkalinity of 4 g/L; F: Test group with salinity of 20 g/L and alkalinity of 6 g/L
4 结论
综合尼罗罗非鱼耐盐碱选育各世代的盐碱耐受性表现，我们初步认为，相对碱度而言，盐碱选育对盐度耐受性提高更为明显；在混合盐碱条件下，低盐度下的盐碱选育效果明显优于中、高盐度；随选育世代增加，尼罗罗非鱼盐碱耐受性能表现趋于稳定。
［1］ Fridman S, Bron J, Rana K. Influence of salinity on embryogenesis,survival, growth and oxygen consumption in embryos and yolksaclarvae of the Nile tilapia［J］. Aquaculture, 2012, 334-337(1):182-190.doi: 10.1016/j.aquaculture.2004.07.014.
［2］ 李家乐，李思发. 中国大陆尼罗罗非鱼引进及其研究进展［J］. 水产学报，2001，25（1）：90-95.doi: 10.3321/j.issn:1000-0615.2001.01.018.
LI J L, LI S F. Introduction and research progress of Oreochromis niloticus in China mainland［J］. Journal of Fisheries of China,2001,25(1):90-95.doi: 10.3321/j.issn:1000-0615.2001.01.018.
［3］ 史为良. 我国某些鱼类对达里湖碳酸盐型半咸水的适应能力［J］.水生生物学集刊，2005，7（3）：359-369.
SHI W L. The adaptability of some fishes in China to carbonate brackish water in Lake Darry［J］.Acta Hydrobiologica Sinica, 2005,7(3):359-369.
［4］ Lemarié G, Baroiller J F, Clota F, Lazard J, Dosdat A. A simple test to estimate the salinity resistance of fish with specific application to O.niloticus and S. melanotheron［J］. Aquaculture,2004, 240(1-4):575-587.doi: 10.1016/j.aquaculture.2004.07.014.
［5］ Al-amoundi M M. Acclimation of commercially cultured Oreochromis species to sea water: an experimental study［J］. Aquaculture, 1987,65(3):333-342.doi: 10.1016/0044-8486(87)90245-6.
［6］ 赵岩，吴俊伟，孟森，王燕，吴昊，赵金良. 碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼血清pH、游离氨浓度及相关基因表达的影响［J］.南方农业学报，2016，47（6）：1032-1038.doi: 10.3969/j:issn.2095-1191.2016.06.1032.
ZHAO Y, WU J W, MENG S, WANG Y, WU H, ZAHO J L. Effects of carbonate alkalinity on serum pH, ammonia concentration and related gene expression in Oreochromis niloticus［J］.Journal of Southern Agriculture, 2016, 47(6):1032-1038.doi: 10.3969/j:issn.2095-1191.2016.06.1032.
［7］ 么宗利，王慧. 罗非鱼咸水养殖研究进展［J］. 海洋渔业，2006，28（3）：251-256.doi: 10.3969/j.issn.1004-2490.2006.03.014.
YAO Z L, WANG H. Advances on the studies of tilapia cultured in saline water［J］. Marine Fisheries, 2006, 28(3):251-256.doi: 10.3969/j.issn.1004-2490.2006.03.014.
［8］ Alfredo M H, Hector S L. Blood gasometric trends in hybrid-red tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus) × O. mossambicus(Peters) while adapting to increasing salinity［J］. Journal of Aquaculture in the Tropics, 2002, 2:101-112.
［9］ 叶畹初，陈大刚，马琳. 尼罗罗非鱼（Oreochromis nilotica Linn）幼鱼渗透压调节的初步研究［J］. 中国海洋大学学报: 自然科学版,1989，19（2）：88-98.doi: 10.16441/j.cnki.hdxb.1989.s2.012.
YE W C, CHEN D G, MA L. Preliminary studies on osmotic regulation in the juvenile Oreochromis nilotica (Linn)［J］. Periodical of Ocean University of China, 1989, 19(2):88-98.doi: 10.16441/j.cnki.hdxb.1989.s2.012.
［10］ 么宗利，李思发，李学军，冯金海，筴金华，张艳红. 尼罗罗非鱼和以色列红罗非鱼耐盐驯化初步报告［J］. 上海海洋大学学报，2003，12（2）：97-101.doi: 10.3969/j.issn.1004-7271.2003.02.001.
YAO Z L, LI S F, LI X J, FENG J H, JIA J H, ZHANG Y H. A primary study on the acclimation to salt-water of Nile tilapia and Israel strain red tilapia［J］. Journal of Shanghai Ocean University, 2003, 12(2):97-101.doi: 10.3969/j.issn.1004-7271.2003.02.001.
［11］ 赵丽慧，筴金华，张艳红，任炳琛，王飞，梁从飞，庄青青，颜标，赵金良. 不同盐、碱度下3品系尼罗罗非鱼幼鱼网箱养殖的生长比较［J］. 南方水产科学，2013，9（4）：1-7. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2013.04.001.
ZHAO L H, JIA J H, ZHANG Y H, REN B C, WANG F, LING C F,ZHUANG Q Q, YAN B, ZHAO J L. Comparison of growth of 3 strains of juvenile Oreochromis niloticus in cage culture under different salinity and alkalinity［J］. South China Fisheries Science, 2013, 9(4):1-7. doi:10.3969/j.issn.2095-0780.2013.04.001.
［12］ 赵丽慧，筴金华，张艳红，任炳琛，梁从飞，赵金良. 3种品系尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）盐碱耐受性和生长比较［J］.渔业科学进展，2014，35（5）：26-32.doi: 10.11758/yykxjz.20140504.
ZHAO L H, JIA J H, ZHANG Y H, REN B C, LIANG C F, ZHAO J L. The tolerance and growth of three strains of Oreochromis niloticus in salinity-alkalinity water［J］. Progress in Fishery Sciences, 2014,35(5):26-32.doi: 10.11758/yykxjz.20140504.
［13］ 梁从飞，赵丽慧，筴金华，张艳红，任炳琛，王飞，吴俊伟，赵金良. 尼罗罗非鱼基础群体与选育一代幼鱼盐碱度耐受性比较［J］.江苏农业科学，2014，42（8）：227-231.doi: 10.15889/j.issn.1002-1302.2014.08.256.
LIANG C F, ZHAO L H, JIA J H, ZHANG Y H, REN B C, WANG F, WU J W, ZHAO J L. Comparison of salinity-alkalinity tolerance between basic population of Oreochromis niloticus and the first selected generation juvenile［J］. Jiangsu Agricutural Sciences, 2014, 42(8):227-231.doi: 10.15889/j.issn.1002-1302.2014.08.256.
［14］ 吴俊伟，梁从飞，筴金华，张艳红，任炳琛，王燕，王映，赵金良. 尼罗罗非鱼盐碱选育二代幼鱼耐受性研究［J］. 河北渔业，2015，7（7）：11-13.doi: 10.3969/j.issn.1004-6755.2015.07.004.
WU J W, LIANG C F, JIA J H, ZHANG Y H, REN B C,WANG Y, WANG Y, ZHAO J L. Study onsalinity-alkalinity tolerance of second selected generation of juvenile Oreochromis niloticus［J］.Hebei Fisheries, 2015, 7(7):11-13.doi: 10.3969/j.issn.1004-6755.2015.07.004.
［15］ 梁从飞，筴金华，张艳红，任炳琛，吴俊伟，王燕，王映，赵金良. 尼罗罗非鱼选育一代耐盐碱和生长性能评估［J］. 广东农业科学，2015，42（9）：115-119. doi: 10.16768/j.issn.1004-874x.2015.09.029.
LIANG C F, JIA J H, ZHANG Y H REN B C, WU J W, WANG Y,WANG Y, ZHAO J L. Evaluation on salinity-alkalinity tolerance and growth of the first selection generation of Oreochromis niloticus［J］.Guangdong Agricultural Sciences, 2015, 42(9): 115-119. doi: 10.16768/j.issn.1004-874x.2015.09.029.
［16］ 吴俊伟，涂翰卿，筴金华，张艳红，任炳琛，赵岩，赵金良. 尼罗罗非鱼选育二代盐碱耐受性和生长研究［J］. 水产学杂志，2016, 29（3）：30-34.doi: 10.3969/j.issn.1005-3832.2016.03.006.
WU J W, TU H Q, JIA J H, ZHANG Y H, REN B C, ZHAO Y, ZHAO J L.Salinity-alkalinity tolerance and growth of second selected generation of Oreochromis niloticus［J］. Chinese Journal of Fisheries, 2016, 29(3):30-34.doi: 10.3969/j.issn.1005-3832.2016.03.006.
［17］ 涂翰卿，筴金华，张艳红，任炳琛，赵金良. 尼罗罗非鱼盐碱选育三代盐碱耐受及生长性能研究［J］. 广东农业科学，2017，44（2）：154-159.doi: 10.16768/j.issn.1004-874X.2017.02.024.
TU H Q, JIA J H, ZHANG Y H, REN B C, ZHAO J L. Salinityalkalinity tolerance and growth performance of the 3rd selected generation of Oreochromis niloticus［J］.Guangdong Agricultural Sciences, 2017, 44(2):154-159.doi: 10.16768/j.issn.1004-874X.2017.02.024.
［18］ Alabaster J S, Lloyd R. Water quality criteria for freshwater fish［S］.Butterworth, London: Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1982:361.
［19］ 范武江，李思发，孟庆辉，刘于信. 4种遗传型罗非鱼的耐盐慢性驯化表现［J］. 中国水产科学，2012，19（3）：430-435.doi: 10.3724/SP.J.1118.2012.00430.
FAN W J, LI S F, MENG Q H, LIU Y X. Saltwater tolerance of Oreochromis niloticus (NEWGIFTS),Sarotherodon melanotheron, and their F1 and F2 hybrids［J］. Journal of Fishery Sciences of China, 2012,19(3):430-435.doi: 10.3724/SP.J.1118.2012.00430.
［20］ 李学军，李爱景，李思发，蔡完其. 新引进萨罗罗非鱼与其它8种罗非鱼耐盐差异［J］. 水产学报，2010，34（7）：1072-1079.doi:10.3724/SP.J.1231.2010.06782.
LI X J, LI A J, LI S F, CAI W Q. Differences of salt-tolerance between Sarotherodon melanotheron and the other 8 tilapias［J］.Journal of Fisheries of China, 2010, 34(7):1072-1079.doi: 10.3724/SP.J.1231.2010.06782.
［21］ Lee C L, Fielder D R. The effect of salinity and temperature on the larval development of the freshwater prawn, Macrobrachium australiense, Holthuis, 1950 from south eastern Queensland, Australia［J］. Aquaculture, 1981, 26(1-2):167-172.doi: 10.1016/0044-8486(81)90120-4.
［22］ De Silva C D. Premawansa S, Keembiyahetty C N. Oxygen consumption in Oreochromis niloticus (L.) in relation to development, salinity,temperature and time of day［J］. Journal of Fish Biology, 1986,29(2):267-277.doi: 10.1111/j.1095-8649.1986.tb04944.x.
［23］ 郑伟刚，张兆琪，张美昭. 澎泽鲫幼鱼对盐度和碱度耐受性的研究［J］. 集美大学学报（自然科学版），2004，9（2）：127-130.doi:10.3969/j.issn.1007-7405.2004.02.007.
ZHENG W G, ZHANG Z Q, ZHANG M Z. Study ontolerance of Carassius auratusPengze fingerlings to salinity and alkalinity［J］.Journal of Jimei University(Natural Science), 2004, 9(2): 127-130.doi:10.3969/j.issn.1007-7405.2004.02.007.