【研究意义】微绿球藻（Nannochloropsis oculata），也称眼点拟微球藻，属于绿藻门绿藻纲四孢藻目胶球藻科微绿球藻属，是一种海洋单细胞饵料微藻［1］。微绿球藻细胞营养丰富，繁殖迅速，容易培养，常作为水产动物人工育苗的优质饵料。目前微绿球藻已经应用于刺参（Stichopus japonicus）［2］、合浦珠母贝（Pinctada fucata）［3］、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）［4-5］、 中华绒螯蟹（Spirulina platensis）等水产动物的育苗［6］及轮虫培养［7-9］，应用效果均较好。优化微绿球藻的培养基，可以提高其生长速率，降低生产成本。【前人研究进展】已有学者进行了提高微绿球藻生长速率的研究，如陈洁等［10］对眼点拟微绿球藻生长的生态因子进行分析；季祥等［11］对拟微绿球藻生长条件进行优化；张海琪等［12］研究了光照、温度、碳源及接种密度对微绿球藻生长的影响；黄翔鹄等［13］研究了微绿球藻对氮和磷营养盐的需求。【本研究切入点】如何提高人工培养微绿球藻的生物质产量和促进其资源化高效利用是目前急需解决的问题。基于每株微藻所需营养成分及含量各不同，同一种微藻在不同的营养液中生长的效果也不一样，可推知藻类对营养的需求有适宜及最适的种类和浓度，越是符合该藻营养需求的配方，越能获得较理想的培养效果［14］。【拟解决的关键问题】目前与微绿球藻生长繁殖密切相关的碳源、氮源、磷源、铁源、维生素B1及B12等营养元素最佳种类及浓度的系统研究尚未见报道。鉴于此，本研究分析了不同质量浓度的碳源，不同种类及质量浓度的氮源、磷源、铁源、VB1及VB12等主要营养元素对微绿球藻的生长效应，选出最适宜的微绿球藻培养基，提高其生长速率，以期为微绿球藻的大规模培养提供基础性资料。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试微绿球藻由海南大学海洋学院微藻保种室提供。微绿球藻藻体形状为细胞球形，直径2～4 μm，单细胞；眼点圆形，淡橘红色；色素体1个，淡绿色，卵圆形或杯状。试验前把微绿球藻藻种接种到2 000 mL三角烧瓶中进行活化纯培养，不充气，每天摇动2～4次，取指数生长期的微绿球藻用于本试验。
试验使用的培养液为宁波大学 3#微藻培养液［1］ 。供试海水取自海南省海口市西海岸海区，pH为8.07，盐度为31.5，经过滤、煮沸消毒、封口，备用。
1.2 试验方法
微绿球藻培养温度为26（±1）℃，光强为70（±6） μmol/（m2s），每天随机交换培养瓶的位置并摇瓶3 次。试验均设3次重复。
1.2.1 有机碳源浓度的筛选 以宁波大学3#培养基为基础培养液，经预备试验，选用乙酸钠作为微绿球藻碳源。设置乙酸钠质量浓度梯度为0、3、6、9、12、15 g/L。培养4 d后计数微绿球藻的细胞密度。
1.2.2 氮、磷、铁源种类及浓度的筛选 根据1.2.1的试验结果选用最佳的碳源，进行氮、磷、铁的筛选试验。根据宁波大学3#配方分别配制出缺氮、缺磷、缺铁培养液，以KNO3、NH4Cl、CO(NH2)2作为试验氮源，设置氮浓度梯度为0、20、35、50、70 mg/L，进行氮源种类及质量浓度的筛选；以KH2PO4、NaH2PO4作为试验磷源，设置磷质量浓度梯度为0、1、2、3、4、5、6 mg/L，进行磷源种类及质量浓度的筛选；以FeSO4、C6H5O7Fe作为试验铁源，设置铁质量浓度梯度为0、0.5、1、2、3、4、5、6 mg/L，进行铁源种类及质量浓度的筛选。培养4 d后计数微绿球藻的细胞密度。
1.2.3 VB1和VB12的正交试验 根据1.2.1的试验结果选用最佳的碳源，设计2因素4水平的VB1和VB12正交试验（表1）。培养4 d后计数微绿球藻的细胞密度。
表1 VB1和VB12正交试验因素水平（mg/L）
Table 1 Factors and levels of VB1 and VB12 orthogonal experiments（mg/L）
水平Level因素值 Factor Value VB1 VB12 1 0 0 2 0.005 0.0005 3 0.05 0.005 4 0.5 0.05
1.2.4 培养基的比较 采用上述试验筛选出的微绿球藻优化培养基与宁波大学3#培养基进行对比培养试验，培养时间为6 d。每天上午9：00计数微绿球藻的细胞密度。
1.3 指标测定
1.3.1 微绿球藻细胞密度的测定 先用血球计数板及分光光度计确定微绿球藻细胞密度与对应藻液OD720 值的线性关系 ［15］，然后测定试验藻液的 OD720 值，根据藻细胞密度与藻液 OD720 的线性关系换算出微绿球藻的细胞密度。
1.3.2 微绿球藻生长速率（K）的计算 藻细胞的生长速率（K）计算公式为：
K=(lnLt-lnL0)/T
式中，Lt表示培养T时间后的微绿球藻细胞密度，L0表示初始培养时的微绿球藻细胞密度，T为培养时间（d）
试验数据采用Excel 2003软件进行处理，并采用SPSS19.0及DPS 14.5软件进行方差分析及多重比较。
2 结果与分析
2.1 乙酸钠浓度对微绿球藻生长的影响
乙酸钠浓度筛选试验中的微绿球藻初始接种密度为9.33×105个/mL。从图1可知，添加不同质量浓度的乙酸钠进行培养均可快速提高微绿球藻的生长速率（P＜0.01），其中以3 g/L乙酸钠促进微绿球藻生长的效果最优。
2.2 氮源种类及浓度对微绿球藻生长的影响
添加3 g/L乙酸钠的兼养模式下，氮源筛选试验初始接种微绿球藻密度为2.20×105个/mL。氮源种类及浓度对微绿球藻生长速率的影响见图2。从图2可以看出，KNO3、NH4Cl和CO(NH2)2能极显著促进微绿球藻生长，适宜作为微绿球藻生长的氮源。3种氮源中NH4Cl的促生长效果好于其他两种氮源，其中以20 mg/L的NH4Cl促生长效果最优。
图1 乙酸钠浓度对微绿球藻生长的影响
Fig. 1 Effects of CH3COONa concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata
图2 氮源种类及浓度对微绿球藻生长的影响
Fig. 2 Effects of nitrogen sources and concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata
2.3 磷源种类及其浓度对微绿球藻生长的影响
添加3 g/L乙酸钠的兼养模式下，磷源筛选试验初始接种微绿球藻密度为9.21×105个/mL。磷源种类及质量浓度对微绿球藻生长速率的影响见图3。由图3可知，KH2PO4和NaH2PO4对微绿球藻的生长具有极显著性影响，均适宜作为微绿球藻生长的磷源，其中以2 mg/L的KH2PO4对微绿球藻的促生长效果最优。
图3 磷源种类及浓度对微绿球藻生长的影响
Fig. 3 Effects of phosphorus sources and concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata
2.4 铁源种类及浓度对微绿球藻生长的影响
添加3 g/L乙酸钠的兼养模式下，铁源筛选试验初始接种微绿球藻密度为5.12×105个/mL。铁源种类及浓度对微绿球藻生长速率的影响见图4。由图4可知，FeSO4和C6H5O7Fe对微绿球藻的生长具有极显著影响，均适宜作为微绿球藻生长的铁源，其中以3 mg/L FeSO4对微绿球藻的促生长效果最优，Fe质量浓度在3～6 mg/L范围时，随着Fe质量浓度的增加，K值越来越小。
图4 铁源种类及浓度对微绿球藻生长的影响
Fig. 4 Effects of iron sources and concentrations on the growth of Nannochloropsis oculata
2.5 VB1、VB12的正交试验
添加3 g/L乙酸钠的兼养模式下，维生素试验初始接种藻密度为5.67×105个/mL。从VB1和VB12的正交试验结果（表2）可知， VB1和VB12对微绿球藻的生长具有极显著影响，并且VB1和VB12 存在交互作用。 综合分析，采用试验号 11混合维生素为微绿球藻的培养基配方，K值最大，即最适宜微绿球藻生长的维生素为VB1 0.05 mg/L及VB12 0.005 mg/L。
表2 VB1和VB12正交试验结果
Table 2 Results of VB1 amd VB12 orthogonal experiments
注：括号内数字代表维生素含量（mg/L）；K值数据后小写英文字母相同表示差异不显著 ，小写英文字母相连表示差异显著，小写英文字母相间隔表示差异极显著。
Note: Numbers in parenthesis represent the contents ( mg/L) of vitamins;The same lowercase letters represent that the differences among K values are not significant, the connected lowercase letters represent significant differences and the interval lowercase letters represent extremely significant differences .
试验号Test number VB1 VB12 K值K value 1 1（0） 1（0） 0.548±0.006c 2 1 2（0.0005） 0.570±0.009ab 3 3（0.005） 0.570±0.001ab 4 1 4（0.05） 0.565±0.003bc 1 5 2（0.005） 1 0.572±0.005ab 6 2 2 0.563±0.009bc 7 3 0.574±0.002ab 8 2 4 0.564±0.010bc 2 3（0.05） 1 0.570±0.006ab 10 3 2 0.580±0.004a 11 3 3 0.585±0.002a 12 3 4 0.564±0.002bc 13 4（0.5） 1 0.563±0.009bc 14 4 2 0.557±0.007bc 15 4 3 0.572±0.001ab 16 4 4 0.569±0.004ab 9
2.6 微绿球藻优化培养基的验证
根据上述试验获得微绿球藻的优化培养基，采用优化培养基与宁波大学3#培养基进行对比培养试验，微绿球藻初始接种细胞密度为 2.84×105个/mL。从图5可知，培养2 d后，微绿球藻在优化培养基上的藻细胞密度明显优于宁波大学3#培养基；培养4 d后，微绿球藻在优化培养基中的藻细胞密度达宁波大学3#培养基的2.55倍；培养6 d后，藻细胞密度达到1.74×107个/mL，但这时藻细胞密度仅为宁波大学3#培养基的1.70倍。经方差分析可知，优化培养基的培养效果极显著优于宁波大学3#培养基。
图5 不同培养基中微绿球藻的生长情况
Fig.5 Growth of Nannochloropsis oculata in different culture media
3 讨论
微藻光合作用的过程，也是碳的同化过程。本试验结果表明，在有机碳乙酸钠浓度为3 g/L的兼养模式下，微绿球藻的生长效果良好，达到自养的3.2倍。可见，乙酸钠是微绿球藻的优良碳源 。已有研究表明，有些微藻在得到有机质后，生长更适宜，在有机酸中，最重要的是醋酸钠，可以是良好的碳源［1］。氮是微藻生长必需的大量元素之一， 对微藻的生长、繁殖等生理活动有重要作用［16］。黄翔鹄等［13］ 研究表明，微绿球藻在 NO3-N 浓度为 28.30 mg/L和 PO4-P 浓度为 2.076 mg/L时，比生长速率达最大值。潘庭双等［17］研究显示，在以硝酸钠或尿素作为氮源时，均以氮质量浓度为24.64 mg/L条件下微绿球藻的生长效果最优。本试验结果表明，最适宜微绿球藻生长繁殖的氮源顺序为NH4Cl-N＞ CO(NH2)2-N＞KNO3-N，NH4Cl-N质量浓度为20 mg/L时，微绿球藻的生长速率最大；在NH4Cl-N质量浓度为20～70 mg/L范围时，随着氮质量浓度的升高，微绿球藻的生长速率越来越小，但均大于尿素及硝酸钾处理组。
磷为无机矿物元素，是微藻正常生长繁殖所需要的大量营养元素之一［1］。黄翔鹄等［13］研究表明，最适合微绿球藻生长的PO4-P浓度为2.076 mg/L；王丽卿等［18］认为最适合微绿球藻生长的PO4-P含量为2.3 mg/L。本试验结果表明，两种磷源之间的微绿球藻生长速率差异不显著，其中KH2PO4-P质量浓度为2 mg/L时，微绿球藻的K值最大。
铁源在微藻呼吸作用、光合作用、蛋白质与核酸合成、固氮作用等生理代谢过程中具有重要的作用［19］。铁含量的高低对于微藻的生长有明显影响，适宜的铁浓度会促进其微藻的生长繁殖［20］。陈洁等［10］研究发现，铁源浓度为0.2 μmol/L时对微绿球藻生长最有利。季祥等［11］研究认为，当FeCl3·6H2O浓度为0.0063 g/L时，最适合拟微绿球藻生长。本试验结果表明，FeSO4-Fe质量浓度为3 mg/L时微绿球藻的生长速率最大。
维生素对微藻生长的影响因种类而不同。季祥等［11］研究表明，拟微绿球藻生长繁殖最适的维生素为 0.005 mg/L维生素B1、0.00025 mg/L维生素B12 和 0.00025 mg/L生物素。宋邦兴等［21］研究表明，0.1 mg/L维生素B12与0.05 mg/L 生物素混合使用对翼茧形藻的生长有极显著影响。王永强等［22］研究表明，1.0 mg/L维生素B1和0.05 mg/L 生物素对锤状中鼓藻生长有极显著影响。本试验结果表明，0.05 mg/L维生素B1和0.005 mg/L维生素B12对微绿球藻生长有极显著影响。但本试验结果微绿球藻所需的维生素B1和维生素B12质量浓度均比季祥等［11］的研究结果大，原因是前人的研究在培养基中用了生物素，因此降低了微藻对维生素B1和维生素B12需求量。
在相同的生态因子条件下，用优化培养基与宁波大学3#培养基对比培养微绿球藻，结果表明，培养1 d，微绿球藻在两种培养基中的生长速率差异不大；培养2 d后，微绿球藻在优化兼养培养基中表现出明显的生长优势；培养4 d，微绿球藻在优化培养基中的细胞密度达宁波大学3#培养基的2.55倍；然而培养4 d后，宁波大学3#培养基的藻细胞密度增加幅度大于优化兼养培养基。主要原因：一是光线受阻，即培养4 d后，优化培养基中的藻细胞密度大于宁波大学3#培养基，这时平均藻细胞接受的光强相对较小；二是营养盐水平下降，培养前4 d，由于优化培养基中藻细胞生长速度更快，消耗的营养盐更多，从而造成培养4 d后优化培养基中的营养盐含量低于宁波大学3#培养基。 培养6 d，优化培养基培养的微绿球藻细胞密度达1.74×107 个/mL，生长速率是宁波大学3#培养基的1.70倍。
4 结论
本研究结果表明，微绿球藻对各种营养盐的需求如下：（1）乙酸钠适宜作为微绿球藻培养的补充有机碳源，最佳乙酸钠质量浓度为3 g/L；（2）硝酸钾、尿素和氯化铵均可作为氮盐，最适微绿球藻生长的氮盐为氯化铵，最佳质量浓度为20 mg/L NH4CLl-N；（3）磷酸二氢钾和磷酸二氢钠均适宜作为微绿球藻生长的磷源，以质量浓度为2 mg/L KH2PO4-P促进微绿球藻生长的效果最优；（4）硫酸亚铁和柠檬酸铁均适宜作为微绿球藻生长的铁源，以质量浓度为3 mg/L FeSO4-Fe促进微绿球藻生长的效果最优；（5）VB1、VB12 混合使用对微绿球藻的生长有极显著影响；（6）微绿球藻优化培养基配方为：3 g/L CHCOONa、 20 mg/L NH4Cl-N、2 mg/L KH2PO4-P、3 mg/L FeSO4-Fe、 0.05 mg/L VB1和 0.005 mg/L VB12，优化培养基为微绿球藻的良好培养基。
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