【研究意义】水稻是我国的主要粮食作物，其高产稳产是我国粮食安全的重要基础。随着人们生活水平的提高，人们对食品安全问题日益关注。种子处理技术因其具备环境污染小、对病虫防治效果好的特点，越来越受到政府的重视与市场的欢迎［1-2］。超声波是一种频率超过20 kHz的压力波，它具有很好的方向性与穿透能力，因而在卫生健康、科研与工农业生产领域被广泛应用［2］。种子超声波处理不同于化学处理，其安全性更好，无污染，处理效率更高，更方便易用，因而近年来得到广泛发展。但是超声波处理水稻种子尚处于发展初期，它可促进发芽与培育壮秧［2］，但是否具有杀菌作用或者对水稻芽期和苗期病害的防治作用不得而知。研究超声波对水稻种谷表面微生物的影响有助于促进种子处理技术的发展与应用，为保证国家粮食安全做出贡献。【前人研究进展】超声波处理种子技术已经用于小麦、玉米、油菜、国槐、锁阳及苏铁等多种作物与林木植物，可促进种子萌发、提高植物抗病性，以及提高产量［3-7］。超声波处理水稻种子的研究报告较少，主要考察了超声波对种谷的刺激作用、种谷体内各种生理活性的改变，以及对水稻种子发芽、出苗及产量的影响，发现超声波处理能提高水稻种子活力、打破种子休眠、促进种子萌发及幼苗生长、增强种子的抗逆性以及提高产量［2, 8-9］。可见，超声波处理水稻种子技术应用还很粗放，必须进一步掌握超声波对种谷本身及其表面微生物的影响规律，优化处理方法。【本研究切入点】针对目前水稻种子超声波处理技术发展不足，不了解超声波对水稻种谷表面微生物影响的相关数据的前提下，本试验设置不同的超声波种谷处理方式，包括湿法与干法处理，以及使用不同的超声波频率，比较不同处理方式对种谷表面不同种类真菌与细菌的杀菌效果。【拟解决的关键问题】发现不同超声波处理方式对种谷表面不同种类微生物的影响规律，为种谷超声波处理技术最优化提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试水稻品种为象牙香占，种谷为广州市金稻农业科技有限公司贮藏的生产用种。超声波处理设备为JD-50L植物种子增产处理机（广州市金稻农业科技有限公司）。
1.2 试验方法
试验设超声波湿法（Twet）、50 kHz超声波干法（Tdry1）和25 kHz超声波干法（Tdry2）3个处理。Twet处理取种谷2 kg浸泡在2 L自来水中并用25～50 kHz变频超声波处理30 min，Tdry1处理将正常干燥种谷2 kg用50 kHz固定频率超声波处理30 min，Tdry2处理分别将正常干燥种谷2 kg用25 kHz固定频率超声波处理30 min，分别设湿法对照（CK1）与干法对照（CK2），3次重复。
1.3 种谷表面微生物分离纯化
从上述处理与对照中分别取种谷1 g，置于99 mL 0.05%的吐温-80的溶液中，摇匀，静置15 min，取0.1 mL上清稀释于99.9 mL 0.05%吐温-80溶液中混匀为菌悬液。取0.1 mL上述菌悬液接种于PDA平板上（90 mm×15 mm一次性培养皿，海门市如意实验器材厂），用三角棒均匀涂布，每个处理5个平板，25℃恒温培养箱中培养。48 h后，分离细菌，用接种针挑取细菌菌落于PDA平板上划线继续纯化培养，37℃恒温培养，再用灭菌牙签挑取单菌落于装有5 mL液体LB的离心管里在37℃的恒温振荡培养过夜，离心后分离菌体，可斜面与砂土管保藏。真菌纯化则在上述DPA平板培养4～7 d后，用接种针挑取菌丝于PDA平板上，待菌落纯化后斜面与砂土管保藏菌种，备用。
1.4 菌种鉴定
1.4.1 形态学鉴定 将纯化后的菌种分别接种于PDA平板上，恒温培养，观察菌落颜色、形态与大小变化，显微镜下观察测量细菌菌体及真菌的菌丝、孢子与产孢结构，拍照记录。
1.4.2 分子生物学鉴定 细菌与真菌DNA的提取分别采用 Bacterial DNA Kit与HP Fungal DNA Kit 试剂盒（Omega Bio-tek, Inc., USA）。细菌的16S rDNA序列扩增采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）， PCR 反应 在 T100® Thermal Cycler PCR 仪（Bio-Rad，USA）上完成，反应总体系为50 μL，其中细菌基因组 DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，2×Power taq PCR MasterMix（广州擎科生物技术有限公司）25 μL，引物 27F 2 μL，引物 1492R 2 μL。扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃延伸10 min。真菌rDNA ITS序列扩增采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），所用仪器和PCR反应体系、程序与细菌相似，只是DNA改为真菌基因组DNA 2 μL，引物ITS1 2 μL，引物 ITS4 2 μL。
PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，缓冲液为1×TAE，电压150 V，电流220 mA，Marker DL2000作为分子量标准参照物。电泳结束后，在凝胶成像仪上面检测并拍照记录，所得的特异性PCR产物tvrt生工生物工程（上海）有限公司测序。将所测序列信息上传Genebank数据库，取得登录号，并在NCBI数据库中用BLAST搜索同源性较高的相关序列进行比对，将序列相同度≥98%定为同种菌株。
试验数据分析与绘图采用Excel 2000软件（Microsoft Corporation, USA）。
2 结果与分析
2.1 超声波处理对种谷表面微生物菌落数量的影响
不同方法的超声波处理对种谷表面的细菌与真菌的影响不同，总体上，超声波湿法处理比干法处理对微生物影响更显著，而50 kHz超声波比25 kHz超声波处理影响较大。
由图1A、图2可知，超声波湿法处理（Twet）可显著减少细菌的菌落数量，处理组的细菌菌落数为165个/平板，显著低于CK1的373个/平板，而两种超声波干法处理（Tdry1和Tdry2）均不能减少细菌菌落数量。由图1B、图2可知，超声波湿法处理（Twet）可显著减少真菌菌落数，处理组的真菌菌落数为1个/平板，显著低于CK1的1.3个/平板；50 kHz超声波干法处理（Tdry1）有真菌菌落3个/平板，显著低于CK2，但25 kHz超声波干法处理（Tdry2）与CK2无显著差异。
2.2 超声波处理对种谷表面微生物种类的影响
从种谷表面分离纯化的细菌，经形态学与分子生物学方法鉴定为15种（表1），都不是已经报道过的植物病原菌，检出最多的是肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae，其次为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae，它们在各个处理与对照中都有大量检出，且差异不大（图1A，表1）。在湿法对照（CK1）中检出了12种细菌，湿法处理中（Twet）共检出7种细菌，未检出铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、粘金黄杆菌Chryseobacterium gleum、鼠李糖短杆菌Brachybacterium rhamnosum、变异赖氨酸杆菌Lysinibacillus varians与成团泛菌Pantoea agglomerans等5种在湿法对照（CK1）中出现的细菌（图1A）。从干法处理（Tdry1，Tdry2）与干法对照（CK2）中检出的细菌差异不大，除了甘蔗黄单胞菌Xanthomonas sacchari和嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia只在干法对照中出现的2种外，其他种类在干法处理中都有检出（图1A，表1）。
从稻谷表面检测到11种真菌（表2），以稻叶鞘腐败病菌Sarocladium oryzae的检出率最高，其次为草酸青霉菌Penicillium oxalicum，它们在各个处理与对照中都被检出（图1B）。在湿法对照（CK1）中检出9种真菌菌，湿法处理中（Twet）检出7种真菌，未检出再育镰孢菌Fusarium proliferatum与串珠镰孢菌Gibberella fujikuroi等2种在湿法对照（CK1）中出现的真菌（表2，图1B）。从干法对照（CK2）中检出10种真菌，50 kHz（Tdry1）与25 kHz（Tdry2）2个干法处理中分别检出9种与6种真菌，但50 kHz干法处理（Tdry1）未检出干法对照（CK2）中出现的多变根毛霉菌Rhizomucor variabilis、尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、茎点霉Phoma sp.与串珠镰孢菌Gibberella fujikuroi等4种真菌（表2，图1B）。
图1 种谷表面分离的细菌（A）与真菌（B）菌落数量
Fig.1 The number of bacterial colonies separated from the surface of rice
*表示经t测验差异显著（n = 15）
*represents the significant difference by T-test (n = 15)
图2 PDA平板上的微生物菌落
Fig.2 Microbial colonies in PDA plates
A：湿法对照（CK1）；B：湿法处理（Twet）；C：干法对照（CK2）；D：50kHz超声干法处理（Tdry1）；E：25kHz超声干法处理（Tdry2）
A: Control of wet seeds (CK1); B: Ultrasonic treatment of wet seeds (Twet); C: Control of dry seeds (CK2);D: 50 kHz ultrasonic treatmentin of dry seeds (Tdry1); E: 25kHz ultrasonic treatmentin of dry seeds (Tdry2)
3 讨论
水稻芽期与苗期是比较脆弱的生育期，容易受到不良环境及有害生物的侵袭，种子带菌是传播恶苗病、绵腐病、立枯病、稻瘟病、稻曲病等病害的主要途径，因此，发展种子处理技术是提高种谷发芽率以及培育壮苗壮秧的关键环节［1］。本研究结果表明，超声波处理种谷可以杀灭其表面细菌与真菌，但杀菌效果与处理方式有关，湿法处理比干法处理效果好，这可能是由于在湿法处理时水被超声空化，形成瞬时局部的高温和高压，达到杀菌效果；干法处理时50 kHz超声波比25 kHz超声波杀菌效果好，这是由于25 kHz超声波干法处理的能量不足，导致其杀菌效果不如50 kHz超声波干法处理，这与制糖工艺中的超声波杀菌原理相似，杀菌效果与超声波的频率、强度及处理介质相关。为了进一步提高超声波处理种谷的杀菌效果，应该以湿法处理为基础，进一步优化超声波频率与强度以及水分与温度控制等条件，达到最好的杀菌效果。
表1 种谷表面的细菌种类
Table 1 Bacterial species on the Surfaces of Rice seeds
注: +表示该菌在该处理中的丰度，+++表示含量＞50%，++表示含量为20%～50%，+表示含量＜20%，无表示含量为0。
Note: + represents the abundance of the bacteria in the treatment, +++ represents the content more than 50%, ++ represents the content in 20%-50%, + represents the content less than 20%, and nothing represents that the content is 0.
菌种Bacterial菌株编号Strain No.Gene Bank ID检测结果Test result Twet CK1 Tdry1 Tdry2 CK2甘蔗黄单胞菌Xanthomonas sacchari XS-01 MH767035 无 无 无 无+嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia SM-01 MH767078 无 无 无 无+栖稻假单胞菌Pseudomonas oryzihabitans PO-01 MH767067 +++无++阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae EC-01 EC-02 EC-03 EC-04 EC-05 EC-06 EC-07 EC-08 EC-09 EC-10 EC-11 EC-12 EC-13 EC-14 MH767079 MH767077 MH767072 MH767069 MH767068 MH767066 MH767063 MH767062 MH767057 MH767047 MH767041 MH767029 MH767028 MH767027+ + + + ++肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae KP-01 KP-02 KP-03 KP-04 KP-05 KP-06 KP-07 KP-08 KP-09 KP-10 KP-11 KP-12 KP-13 KP-14 KP-15 KP-16 KP-17 MH767067 MH767065 MH767064 MH767061 MH767059 MH767056 MH767055 MH767054 MH767052 MH767050 MH767049 MH767045 MH767044 MH767043 MH767042 MH767048 MH767032++ ++ ++ +++ ++格氏多列杆菌Pluralibacter gergoviae PG-01 MH767076 ++无 无 无刚毛沙雷氏菌Serratia fonticola SF-01 SF-02 SF-03 MH767073 MH767070 MH767033 + + + + 无小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica YE-01 YE-02 YE-03 YE-04 MH767040 MH767036 MH767026 MH767025+无 无 无 无屎肠球菌Enterococcus faecium EF-01 MH767031 +无 无 无 无铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA-01 MH767074 无 无+无 无粘金黄杆菌Chryseobacterium gleum CG-01 MH767060 无 无+无 无鼠李短杆菌Brachybacterium rhamnosum BR-01 MH767058 无 无+无 无变异赖氨酸杆菌Lysinibacillus varians LV-01 MH767046 无 无 无+无赫氏埃希氏菌Escherichia hermannii EH-01 MH767051 无 无+无 无成团泛菌Pantoea agglomerans PA-01 MH767053 无 无+无 无
表2 种谷表面的真菌种类
Table 2 Fungal species on the Surfaces of Rice seeds
注: +表示该菌在该处理中的丰度，+++表示含量＞50%，++表示含量为20%～50%，+表示含量＜20%，无表示含量为0。
Note: + represents the abundance of the fungi in the treatment, +++ represents the content more than 50%, ++ represents the content in 20%-50%, + represents the content less than 20%, and nothing represents that the content is 0.
菌种Bacterial菌株编号Strain number Genebank ID 检测结果Test result Twet CK1 Tdry1 Tdry2 CK2多变根毛霉菌Rhizomucor variabilisRV-01MH766398无无无无++茎点霉属Phoma sp.PS-01MH766396无无无无+尖孢镰孢菌Fusarium oxysporumFO-01MH766397无无无无+串珠镰孢菌Gibberella fujikuroiGF-01MH766395无无无无+再育镰孢菌Fusarium proliferatum FP-01,FP-02 MH766394,MH766393无无+无++黄曲霉菌Aspergillus flavusAF-01MH766392无无无+无木贼镰孢菌Fusarium equiseti FE-01,FE-02 MH766400,MH766399无+++无无无叶状枝节丛孢Arthrobotrys foliicolaAF-02MH766391无无无+无稻叶鞘腐败病菌Sarocladium oryzae SO-01, SO-02,SO-03, SO-04,SO-05, SO-06 MH766390,MH766389,MH766388,MH766387,MH766386,MH766385++++++无+草酸青霉菌Penicillium oxalicum PO-01, PO-02,PO-03 MH766384,MH766383,MH766382无无++无无镰刀菌Fusarium sp.FS-01,FS-02 MH766381,MH766380无无+无无
本研究鉴定的种谷表面真菌种类与刘西丽等［10］的研究结果大体上一致。许多植物病原真菌如镰刀菌属的一些种类，包括再育镰刀菌Fusarium proliferatum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、串珠镰刀菌Fusarium moniliforme及木贼镰刀菌Fusarium equiseti等，它们都是水稻立枯病的病原菌［11］，还有尚未鉴定种的茎点霉属Phoma sp.和镰刀菌Fusarium sp.也可能是植物致病菌。超声波对上述病菌都有一定杀菌作用，这些种传病原的减少可有效减少水稻芽期与幼苗期病害，促进水稻壮秧壮苗。其中，多变根毛霉菌Rhizomucor variabilis被超声波显著抑制，但该菌多见于机会引起人和动物皮质感染［12］，而它与水稻的互作关系未见研究报导；Sarocladium oryzae是水稻叶鞘腐败病的病原菌，影响水稻结实，降低稻谷产量与米质［13］。另外4种真菌，即木贼镰孢菌Fusarium equiseti、草酸青霉菌Penicillium oxalicum、黄曲霉菌Aspergillus flavus和节菱孢霉菌Arthrobotrys foliicola，超声波杀菌效果不显著，可能是因为其丰度相对较高。
本研究检测到的细菌中，只见植物病原菌甘蔗黄单胞菌Xanthomonas sacchari报道，可引起甘蔗叶片褪绿条纹病（Leaf Chlorotic Streak Disease）［14］，但该菌也可能是一种内生菌，并且从水稻上分离了该菌的一个菌株，对一些病原菌有拮抗作用，具有作为生防菌的潜力［15-16］，超声波处理对该菌具有杀菌效果，但其对水稻生长发育有何效应需要进一步研究。其他被检测到的细菌均非植物病原菌，而多为人的条件性致病菌（当人体免疫力低下时可能被感染），如假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、粘金黄杆菌Chryseobacterium gleum、成团泛菌Pantoea agglomerans、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、栖稻假单胞菌Pseudomonas oryzihabitans（栖稻黄单胞菌Flavimonas oryzihabitans）、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、格氏多列杆菌 Pluralibacter gergoviae及居泉沙雷氏菌Serratia fonticola等都属于此类细菌［17-20］。超声波对前5种有杀菌作用，但对其余的杀菌效果较差，这可能是由于后者的丰度较高，阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、及居泉沙雷氏菌等都有很高的分离率。另外2种菌（鼠李糖短杆菌Brachybacterium rhamnosum和变异赖氨酸杆菌Lysinibacillus varians）目前未见该菌对人有致病性的研究报道，超声波对其杀菌效果也比较好，可能也与其丰度较低有关。
4 结论
超声波处理对种谷有杀菌作用，但杀菌效果与超声波处理方式及微生物种类及其丰度有关。总体上，超声波湿法处理（Twet）优于干法处理，而50 kHz超声波干法处理（Tdry1）优于25 kHz超声波干法处理（Tdry2）。本研究检测到的15种种谷表面细菌中，仅甘蔗黄单胞菌Xanthomonas sacchari是植物病原菌，其他大多为条件性人的致病菌。超声波对甘蔗黄单胞菌Xanthomonas sacchari、假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、粘金黄杆菌Chryseobacterium gleum、成团泛菌Pantoea agglomerans、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia等丰度较低的细菌杀菌效果较好，但对阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae和肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae等丰度较高的细菌杀菌效果较差；检测到的11种真菌中许多是植物病原菌，超声波对层生镰刀菌Fusarium proliferatum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、串珠镰刀菌Fusarium moniliforme，木贼镰刀菌Fusarium equiseti与茎点霉菌Phoma sp.等杀菌效果较好，而对稻叶鞘腐败病菌Sarocladium oryzae及草酸青霉菌Penicillium oxalicum等杀菌效果不显著，可能是由于后者丰度太高所致杀菌效果偏低。超声波处理对种谷表面的植物病原菌杀菌作用可能是是其促进水稻壮秧壮苗增产的原因。本研究结果可指导超声波稻种处理技术的进一步优化研究，促进该技术在种子处理中的发展与应用。
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