【研究意义】水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的一种制约水稻生产的重要真菌病害［1-2］，目前化学药剂防治仍是最重要的防治手段［3-5］。季铵盐是一种广谱性灭菌剂，常应用于医疗卫生事业的消毒灭菌，对微生物有良好的抑菌和杀菌效果。大分子季铵盐不仅具有小分子季铵盐良好的抑菌活性，还可克服小分子季铵盐易挥发、稳定性差和环境毒性强等弱点［6］，将其应用于微生物的抑制是当今研究和开发的一个热点［7］。两亲性大分子季铵盐是一种分子链中同时含有亲水链段和疏水链段的高分子聚合物，能通过亲疏水作用稳定吸附于固体材料表面，并降低水在材料表面的张力，故也被认为是一种广义的表面活性剂。临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）是针对胶束系统而言的，当溶液中存在的聚合物（通常为表面活性剂两亲性分子）开始大量形成胶束时的浓度即为CMC。当聚合物在溶液中的浓度高于CMC时，聚合物就会自发聚集形成胶束，而当浓度低于CMC时，自由的聚合物链不易形成稳定的胶束。其中两亲性聚合物的胶束CMC一般在10-6 mol/L，而小分子的表面活性剂的CMC则大约为10-3 mol/L［8］。因此，两亲性聚合物在水溶液中的溶解性不如两亲性小分子化合物，前者更易在溶液中形成胶束，而这类在溶液中易形成胶束的两亲性大分子季铵盐对病原真菌抑菌活性的表征方法及效果，目前还鲜有报道。【前人研究进展】研究化合物对病原微生物抑菌活性的方法有多种。对病原细菌的表征方法有抑菌圈法［9］、管碟法［10］、滤纸片法［11］等。对病原真菌的表征方法有生长速率法［12-16］、菌丝称重法［17］、孢子萌发法［18-19］等，其中生长速率法因其操作简单，结果直观而应用广泛，但其只适用于在培养基中溶解性好且分布均匀的化合物表征；菌丝称重法适用于能在培养基中溶解的化合物表征；而孢子萌发法只适用于能产生孢子的病原真菌。【本研究切入点】分别利用生长速率法和菌丝称重法对3种不同结构的季铵盐，即一种新型两亲性大分子季铵盐〔聚二甲基硅氧烷-b-聚丙烯酸酯季铵盐嵌段共聚物，PDMS-b-(PDMAEMA-BCA)，简称Six-Q5〕、亲水性大分子季铵盐（PQD-BC）和小分子季铵盐（BC）对水稻纹枯病菌（R. solani）抑菌活性进行系统表征，比较了两种方法的优缺点。【拟解决的关键问题】探索出适用于两亲性大分子季铵盐对植物病原真菌的抑菌活性表征方法，为高分子季铵盐作为植物病原真菌杀菌剂开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn AG-1(IA)），由华南农业大学农学院植物病理学系真菌实验室惠赠。
苯扎氯铵（十二烷基二甲基苄基氯化铵，BC），99%，上海麦克林公司提供；聚二甲氨基丙基甲基丙烯酰胺-苄基氯化铵（PQD-BC），按文献［1］采用自由基聚合方法合成，平均相对分子量为1.5×105；PDMS-b-(PDMAEMA-BC)的化学名称为聚二甲基硅氧烷-b-聚(二甲氨基丙基甲基丙烯酸酯-苄基氯化铵)嵌段共聚物，是一类新型两亲性大分子季铵盐（Six-Q5，x = 0、2、3、4、5、8、10），按文献［20］采用原子转移自由基聚合方法（ATRP）合成，其结构参数见表1。
PD培养基和PDA培养基按文献［21］的方法配置。
表1 Six-Q5的结构参数
Table1 Structural parameters of Six-Q5
Six-Q5代号Six-Q5 Mark PDMS嵌段长度Length of PDMS Block(ku)PDMAEMA-BC嵌段长度Length of PDMAEMA-BC Block(ku)Si0-Q5 0 5 Si2-Q5 2 5 Si3-Q5 3 5 Si4-Q5 4 5 Si5-Q5 5 5 Si8-Q5 8 5 Si10-Q5 10 5
1.2 试验方法
1.2.1 生长速率法测试季铵盐对R. solani的抑菌活性 将保留的R. solani菌丝接种于PDA平板中，倒置，在28 ℃恒温培养箱中培养2 d后，在菌落边缘打取6 mm菌碟，移至新的PDA平板，在相同温度下培养2 d。在超净工作台中，配制不同浓度的季铵盐（Six-Q5、PQD-BC和BC）溶液5 mL，倒入已融化的PDA培养基中，使其终浓度范围在0.1～1 mg/mL，待培养基凝固后，向含药PDA平板中央移接入从活化菌种边缘打取的菌碟，28 ℃培养30 h，每个处理3次重复。用十字交叉法测量菌落直径，计算相对抑制率：
1.2.2 菌丝称重法测试季铵盐对R. solani的抑菌活性 按照1.2.1实验方法活化R. solani，在菌落边缘打取菌碟移至45 mL PD培养基中，每瓶移接2个菌碟，28 ℃、120 r/min摇床中培养3 d，即可得到菌液。
在超净工作台中，称取适量季铵盐，紫外灭菌20 min后，用PD稀释成一系列不同浓度，定容至8 mL，以相同体积的PD作为对照。于活化好的菌液中挑取适量菌丝，匀浆制成菌悬液（3×106～ 3×107 CFU/mL），分别加入2 mL混匀的菌悬液于上述配制好的不同浓度的季铵盐溶液中，混匀，置于28℃、150 r/min下培养48 h。
通过减重法，先将标记好的称量瓶（含两张定量滤纸）置于80℃下烘干3 h后，风干至室温，称得称量瓶（含滤纸）质量（M1）；然后将对应标记的称量瓶中的滤纸置于布氏漏斗中抽滤培养48 h菌药混合液，并用PBS冲洗菌丝2次，洗去菌丝表面附着的季铵盐，放回容量瓶中，再置于80℃下烘干3 h，风干至室温，称得称量瓶（含滤纸）及菌丝的质量（M2），用减重法测量菌丝质量，计算相对抑制率：
式中，菌丝质量（g）= M2 - M1。
1.2.3 毒力方程 以浓度对数作为横坐标，根据《生物统计机率值换算表》，把抑制百分率换算成生物几率值作为纵坐标，绘制毒力回归方程。利用方程求得几率值为5时的质量浓度即为IC50，几率值为6.28155时的质量浓度为IC90。
2 结果与分析
2.1 生长速率法测试季铵盐对R. solani的抑菌活性
半数抑制浓度（IC50）是指能抑制50 %病原微生物生长的药物浓度，90 %抑制浓度（IC90）则是指抑制90% 病原微生物生长的药物浓度［22］。IC50和IC90通常是用来评价化合物对病原微生物的抑菌活性。
图1 Six-Q5季铵盐对R. solani抑菌活性的菌落状况
Fig.1 Typical mycelial growth of R. solani in PDA medium treated with Six-Q5 quaternary ammonium salts
图1是经过Six-Q5季铵盐在不同浓度处理下生长2 d的R. solani菌落，由图1可见，对比空白对照，各处理的R. solani菌落直径明显减小，说明经过季铵盐处理，R. solani的生长受到了抑制。然而不同类型的季铵盐对R. solani生长的抑制效果不同。本课题组在前期研究中发现，PQDBC和BC处理的菌落直径随着处理浓度的增加而减小［23］，但采用同样的实验方法用于Six-Q5对R. solani抑菌活性的表征时，其结果则出现了显著的偏差：Six-Q5处理的样品处理浓度对数值与计算所得的生物几率值不呈线性关系，其结果见图2。
通过采用生长速率法测量3类季铵盐对R.solani抑菌活性的相关参数，发现PQD-BC和BC处理的拟合曲线拟合效果较好（r2 ＞ 0.95），分别为：y= 3.08 x + 9.04（r2 = 0.960，IC50 = 730 μg/mL，IC90 = 1640 μg/mL）和 y= 3.63 x + 5.50（r2 = 0.964，IC50 = 48.0 μg/mL，IC90 = 127 μg/mL）。然而，Six-Q5处理的数据拟合效果不好（r2介于0.52～0.92之间，如图2所示），说明通过拟合方程计算得到的IC50和IC90可信度不高，不适宜评价Six-Q5对R. solani的相对抑菌活性。
图2 生长速率法测Six-Q5系列 (A～G)、PQD-BC (H)和BC (I)对R. solani抑菌活性拟合曲线
Fig.2 Fitting curves of antibacterial activity of Six-Q5 series (A-G), PQD-BC (H) and BC (I) to R. solani by growth rate method
2.2 菌丝称重法测试季铵盐对R. solani的抑菌活性
由于生长速率法不能较好地表征两亲性大分子季铵盐的抑菌活性，试验尝试了另一种方法，即菌丝称重法［17］。
图3为利用菌丝称重法测量的菌丝干重计算得到的样品处理浓度对数-生物几率值的拟合曲线，由图3可见，3类不同结构的季铵盐处理的浓度-生物几率值拟合曲线的拟合效果较好（r2 ＞ 0.96）,说明可以通过拟合曲线方程计算得到IC50和IC90（表2），且其可信度较高，可以用来评价3类不同结构季铵盐对R. solani抑菌活性的大小。由表2可见，PDMS嵌段长度较长的Si8-Q5和Si10-Q5对R. solani的抑菌活性明显弱于其余PDMS嵌段长度较短的Six-Q5（x = 0～5）和PQD-BC及BC，可能是因为当聚合物的亲水段长度不变时，疏水段长度越长，聚合物的CMC越小，其在培养液中的溶解度降低，影响测试的IC50及IC90的准确性。
图3 菌丝称重法测Six-Q5 (A～G)、PQD-BC (H)和BC (I)对R. solani抑菌活性拟合曲线
Fig.3 Fitting curves of antibacterial activity of Six-Q5 series (A-G), PQD-BC (H) and BC (I) to R. solani by mycelium weighing method
表2 基于菌丝称重法测得3类季铵盐对R. solani抑菌活性的相关参数
Table2 Parameters of the antimicrobial activity of three kinds of quaternary ammonium salts against R. solani measured by mycelial weighing method
images/BZ_96_213_2089_2264_2140.pngSix-Q5 Si0-Q5 Si2-Q5 Si3-Q5 Si4-Q5 Si5-Q5 Si8-Q5 Si10-Q5 PQD-BC BC y = 2.13 x + 9.08 0.982 12 49 y = 0.94 x + 6.49 0.963 25 600 y = 1.33 x + 7.26 0.971 20 180 y = 1.21 x + 6.78 0.968 33 384 y = 1.90 x + 8.61 0.996 12 59 y = 2.18 x + 7.93 0.984 45 175 y = 1.41 x + 6.90 0.970 45 366 y = 1.26 x + 7.34 0.987 14 146 y = 2.19 x + 9.18 0.977 12 49
3 讨论
3.1 生长速率法测试季铵盐对R. solani的抑菌活性
用电导率法测得Six-Q5的临界胶束浓度（CMC）的结果介于0.06～0.09 mg/mL之间，说明Six-Q5在水溶液中易于形成胶束，且胶束的尺寸较大，用透射电镜测试的结果为50～500 nm。当在固体培养基中Six-Q5终浓度为0.1～1 mg/mL时，大于CMC，则形成胶束［8］，在固体培养基甚至静置液体培养基中难以均匀分布，影响实验结果，导致同一处理不同重复的结果波动较大；而亲水性大分子季铵盐（PQD-BC）和小分子季铵盐（BC）在液体和固体中均能分布均匀，容易实现较为稳定的重复结果。这应该是生长速率法不适合两亲性大分子季铵盐的抑菌活性表征的主要原因。
3.2 两种方法测得季铵盐对R. solani的抑菌活性比较
菌丝称重法测试的PQD-BC及BC的IC50和IC90明显小于生长速率法测得的结果，这可能和菌丝与样品有效接触面积有关。生长速率法中，菌碟只有一面紧挨毒平板，则只有贴着毒平板生长的菌丝会受到抑制，毒平板中的药物难以抑制气生菌丝的生长；而菌丝称重法中，菌碟和菌丝是完全浸润于药物溶液中，且振荡培养增加了药物与菌丝的有效接触频率，从而增强了抑制效果，致使菌丝称重法测试得到的IC50和IC90会比生长速率法的测试值小。
前期关于聚丙烯酸酯季铵盐均聚物（PDMAEMA-BC）的研究发现，只有当聚合物的分子质量适当时（约为5 000 u，相当于本试验中的Si0-Q5）才能获得较佳的抑菌活性。但在本试验中，虽然发现两亲性大分子季铵盐（Six-Q5）分子结构中亲疏水嵌段的比例对其抑菌活性有较大影响，通过调整疏水的PDMS嵌段长度（约为5 000 u）可以获得与小分子季铵盐相当抑菌活性的两亲性大分子季铵盐，但PDMS嵌段长度与抑菌活性之间的规律性不甚明显，相关机理仍有待进一步研究。
4 结论
生长速率法适用于在培养基中溶解性好、且分布均匀的化合物抑菌活性的表征。而像Six-Q5这类在水溶液中易于形成胶束，且胶束的尺寸较大的大分子化合物的抑菌活性表征则更适宜采用菌丝称重法。
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