【研究意义】植物根癌病又称冠瘿病，是由根癌土壤杆菌属（Agrobacterium spp.）中的致病菌所引起的一种世界性病害。病原菌侵染后，感病植株会在根、茎甚至枝条上形成大小不一的瘿瘤，不但影响植株对水分和矿质营养的吸收和运输，同时还使其他病原微生物更易侵染，导致树势衰弱，易感病，果实品质及产量下降，甚至造成植株死亡。【前人研究进展】早期人们根据寄主范围和病害症状将土壤杆菌属分为根癌土壤杆菌、发根土壤杆菌、悬钩子土壤杆菌及放射形土壤杆菌，认为除放射形土壤杆菌无致病性外其余3种菌都能引起发病。进一步研究认为，土壤杆菌的病害症状是由质粒类型决定的，而非细菌的种类，因而这种以可转移的质粒引发的致病性作为分类依据并不科学。后来，人们又以生理生化特征和致病性特征，将土壤杆菌属直接划分为生物Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3个生物型［1-2］。
带有染色体外的、环状闭合的Ti（tumor-inducing plasmid）质粒是致病的土壤杆菌的共同特征，其上有T-DNA (transfer-DNA)区、Vir区及冠瘿碱分解代谢区与致病过程有关。根癌土壤杆菌可侵染双子叶植物、单子叶植物、裸子植物等多种植物，包括重要的经济作物，尤其以果树中的核果类、浆果类、仁果类和坚果类易感病［3-4］。桃根癌病是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的土壤病害，在我国桃栽培区的发病率最高达到90%［3］。【本研究切入点】根癌病菌是土壤习居菌，具有潜伏侵染和系统侵染性，再加之苗木生产和调运中缺乏检疫措施，更加剧了该病害的传播和蔓延［3,5］。
前人对桃根癌病病原菌的研究认为，不同根癌病病原菌对同一寄主的致病性是不同的［6-7］。【拟解决的关键问题】本试验对从不同地区桃根瘤组织中分离，经初步鉴定的根癌病病原菌进行进一步的鉴定，了解病原菌的类型及其致病力，为今后桃根癌病的抗病育种工作及生物防治打下基础。
1 材料与方法
1.1 桃根癌病病原菌及其来源
从我国不同桃产区包括北京平谷、河北昌黎、河北石家庄、山东泰安、江苏南京、甘肃兰州等采集桃树根癌病组织，分离根癌病病原菌，并经初步形态学和致病性分子检测。
1.2 植物材料
指示植物：向日葵（市售）种子浸泡10 h后，置26 ℃培养箱中保湿催芽，萌发后播种于腐叶土∶蛭石∶园土=1∶1∶2的混合基质中培养。
中桃抗砧1号、报春、红根甘肃桃×贝蕾F1、毛桃等4个品种/单株6～10年生植株。中桃抗砧1号自花授粉实生苗（3年生）。
1.3 病原菌的分离、纯化与保存
将完整瘿瘤组织冲洗干净，去除老化表皮，从不同方位选取幼嫩白色的瘤组织2～3块（约2.0 g），75%酒精处理1 min，无菌水冲洗3次；切成2 mm×2 mm的小块，加入1～2 mL蒸馏水，用灭菌玻棒捣碎，在2 mL无菌离心管中浸泡30 min，取100 μL浸泡液涂布于D1M培养基上，28 ℃培养2～4 d。挑取具有根癌土壤杆菌特征的单菌落，划线纯化培养，然后挑取单菌落于液体YEB培养基中，28 ℃、200 r/min 摇床培养约 16 h［8］。
YEB培养基培养的菌液直接放4℃可保存2个月。将菌液与30%的灭菌甘油1∶1混匀，液氮速冻后于-80℃长期保存。
1.4 桃根癌病病原菌鉴定
1.4.1 病原菌致病性的分子鉴定 参照Haas等［9］的方法，对根癌土壤杆菌与T-DNA转移和瘿瘤形成相关的virD2和ipt基因分别进行检测。virD2基因的引物virD2A：5′-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3′；virD2C：5′-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3′，目的条带203 bp。ipt基因引物CYT：5′-GATCG(G/C)GTCCAATG(C/T)TGT-3′；CYT：5′-GATATCCATC GATC(T/C)CTT-3′，目的片段427 bp。
PCR反应体系：50 ng模板DNA（新鲜菌液），1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，0.5 U Ex Taq DNA酶，上下游引物各0.5 μmol/L，以重蒸水补足20 μL。扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性40 s、55℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经EB染色，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4.2 病原菌致病性的生物学鉴定 （1）3-酮苷试验：将分离纯化后的菌株接种于YEB液体培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养约16 h。培养好的菌液在5 000 r/min条件下离心10 min，用灭菌蒸馏水重悬，并调整浓度为1×109 CFU/mL。在含有1%乳糖、0.1%酵母浸膏和2%琼脂的培养基上，接种待测菌，28 ℃培养1～2 d。经培养后在平板上倒一薄层Benedict试剂，静置于室温下。如果产生3-酮基乳糖，在菌落的周围出现Cu2O的黄圈，约1 h后黄圈达最大，出现该现象则为生物Ⅰ型。
（2）向日葵接种鉴定：待苗高至5～10 cm时，选取生长健壮、整齐一致的向日葵苗接种。在苗子下胚轴接近子叶的部位，用解剖刀划1 cm长的伤口，在伤口处涂抹一滴菌液（约20 μL），然后用封口膜包裹保湿。每个菌株接种10棵苗。同时接种无菌水作对照。接种后的幼苗放置于28 ℃温室培养。从接种后5 d开始，每天定时观察发病情况。
（3）桃枝条接种鉴定：接种参照Bliss等［10］的方法。在中桃抗砧1号、报春、红根甘肃桃×贝蕾F1等3个品种/单株上，选生长较直立，健壮的新梢，从距枝条顶端10 cm的位置，用解剖刀划1 cm长的伤口，深及木质部，在伤口处涂抹一滴菌液（约20 μL），然后用封口膜包裹保湿，每株菌每个植株上接种3个枝条，每个枝条接种5个位点，位点间间隔约5 cm，同时接种无菌水作对照。单株区组试验设计，设置4个区组。接种后40 d调查，以瘤直径衡量病原菌的致病力。
1.4.3 病原菌16S rDNA序列测定 对经致病性表现最强的3个菌株进一步进行16S rDNA序列测定，以确保试验材料的准确性。引物采用细菌16S rDNA通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′［11］。
细菌基因组DNA提取：取菌液1.5 mL，12 000 r/min离心3 min，弃上清液，加入0.5 mL蒸馏水，混匀，煮沸10 min，然后用CTAB法提取DNA。
PCR反应体系：80 ng模板DNA，1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 U Ex Taq DNA 酶，上下游引物各0.5 μmol/L，以无菌重蒸水补足20 μL。扩增条件：95℃预变性4 min；95 ℃变性40 s、54 ℃退火40 s、72℃延伸40 s，4个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经EB染色，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
将1 500 bp的目的片段用PCR产物纯化回收试剂盒（Biomed）回收目的片断，连接至pMD 19-T载体（TaKaRa），并转化导入DH5α感受态细胞中，在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选。阳性克隆送往上海生工测序，测序结果与GenBank中序列进行同源性比对分析。
2 结果与分析
2.1 病原菌致病性分子检测
virD2基因参与病原菌侵染寄主的过程，ipt基因是造成寄主植物病症的关键基因之一［9,12-13］，而virD2与ipt基因结合能从不同角度反映病原菌的致病性。两对特异引物在21株病原菌中均出现203 bp和427 bp的目的片段（图1）。说明从不同桃产区分离的根癌农杆菌菌株基本都有致病性，这也是桃树会有大面积发病的原因。
图1 5株病原菌致病性PCR检测
Fig.1 Detection of the virulence of 5 strains from peach crown galls by PCR
1～5：virD2特异引物在不同菌株的条带；6～10：ipt特异引物在不同菌株的条带；M：DL2000
1-5：the PCR products of virD2 gene in different strains; 6-10：the PCR products of ipt gene in different strains; M：Marks DL2000
2.2 病原菌的生理生化鉴定
尽管所分离的菌株都有致病性，但分清楚致病菌的生物型，对深入研究其发病机制有重要作用。对21个经初步鉴定具有致病性的菌株进行生理生化鉴定，结果表明，致病菌中主要是生物Ⅱ型，有18株，其余3株菌为生物Ⅰ型（图2）。
2.3 病原菌对指示植物向日葵幼苗的致病性
指示植物接种与分子鉴定相比，需时较长，但能更客观地反映病原菌的致病性。为了验证不同菌株的致病能力，将鉴定为生物Ⅱ型的菌株接种在指示植物向日葵上，结果（图3）表明，21株病原菌均能使向日葵幼苗长瘤，但瘤的大小有差异，即不同菌株对向日葵幼苗的致病能力存在差异。
图2 3-酮苷反应鉴定12株病原菌的生物型
Fig.2 Biotypes of 12 strains from peach crown galls identified by 3-Ketolactose test
数字为菌株编号，其中出现黄色（4、5）的为生物Ⅰ型，其余均为生物Ⅱ型
The numbers represent the codes of 12 strains.The yellow strains(4,5)belong to Biotype Ⅰ and the remaining strains were Biotype Ⅱ
图3 不同菌株对向日葵幼苗的致病性
Fig.3 Virulence of several isolated strains on sunflower seedlings
A：无菌水对照；B、C：生物生物Ⅱ型菌株致病瘤；D：生物Ⅰ型菌株致病瘤
A：Control; B and C：Biotype Ⅱ strains; D：Biotype I strains
2.4 病原菌对桃树枝条的致病性
由于指示植物和目标植物在抗病性及对病原菌的应答机制有所不同，在指示植物上有强致病力的菌株还需要在桃树进行最终验证。选择对向日葵幼苗致病力强的10株菌，接种在不同种桃树枝条上，比较其对桃树的致病力。结果（图4）表明，不同植株形成的瘤大小有差异，即不同菌株之间的致病力强弱存在差异，其中菌株AT4-3（生物Ⅱ型）的致病力最强。
图4 AT4-3菌株在桃树及近缘种上的致病情况
Fig.4 Pathogenic status of strain AT4-3 on peach trees and other relative species
2.5 病原菌16S rDNA测序鉴定
将包括AT4-3在内的3个菌株的16S rDNA测序结果在GenBank中进行BLAST同源性比对，与根癌土壤杆菌相似性均在99%以上（表1），由此可确定这3个菌株均为根癌土壤杆菌。
表1 AT4-3菌株16S rDNA测序结果同源性比对
Table 1 Homologous alignment of strain AT4-3 16S rDNA sequencing results
登录号Accession NO.Agrobacterium tumefaciens strain TA-AT-5 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence 2479 2479 100 0.0 99 KF673153.1 Rhizobium sp.C2C 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence详情Description最高分Max score总分Total score查询范围Query cover（%）E值E-value一致性Ident（%）2479 2479 100 0.0 99 KF170820.1 A.sp.SAUBS3-4 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence 2479 2479 100 0.0 99 KC243285.1 A.tumefaciens strain DSR11 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence 2479 2479 100 0.0 99 JQ342861.1 Bacterium PK 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence 2479 2479 100 0.0 99 EF462386.1 A.tumefaciens genes for 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence AF114 2477 2477 99 0.0 99 LC015594.1 A.tumefaciens strain LM6-1 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence 2477 2477 99 0.0 99 KM884893.1 A.tumefaciens strain LM-1 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence 2477 2477 99 0.0 99 KM884891.1 A.tumefaciens strain SQ3-38-1 16S ribosomal RNA gene patrtial sequence 2477 2477 99 0.0 99 KM252932.1
3 讨论
根癌土壤杆菌中的生物Ⅰ型和生物Ⅱ型是桃及其他核果类的致病菌［2,7-8］。LI等［14］从采自我国5个地区的桃根瘤组织分离的19株根癌土壤杆菌中，鉴定出生物Ⅱ型14株，说明生物Ⅱ型为优势菌群。在同一条件下的桃抗根癌病评价中，生物Ⅱ型致病力强于生物Ⅰ型［15-17］。本试验筛选出的强致病力菌为生物Ⅱ型，这与前人的研究结果一致。
在根癌土壤杆菌致病性鉴定时，分子检测因其快速、简便，得到广泛的研究及应用［9,14,18-19］。分子检测方法大多根据根癌土壤杆菌Ti质粒的Vir区和T-DNA区保守序列设计特异引物，其中Vir区与病原菌附着、T-DNA加工和转移相关，T-DNA区为致瘤区，二者在决定病原菌的致病性时缺一不可。因此，在致病性鉴定时，至少需要Vir区与T-DNA区各一对引物相结合才能确定病原菌的致病性。即使这样，分子检测方法还是有其局限性，比如Vir区，存在大约35个vir基因［12-13］，而一对引物也只能反映出某一个vir基因的存在与否（根据基因区间序列设计的引物除外），因此可能出现假阳性结果。另外，在经向日葵接种鉴定表现为致病性的菌株，在桃上却仍没有表现出病状。这可能是因为指示植物不是该病原菌的自然寄主，不能完全可靠地反映该病原菌对桃的致病能力［20］。
4 结论
本研究对来源于其他实验室（中国农业科学院植物保护研究所）的21株病原菌进行鉴定，为后继的试验提供可靠的材料。生理生化鉴定认为，其中的3株菌为生物Ⅰ型，18株菌为生物Ⅱ型；分子生物学和生物学方法（接种指示植物向日葵）鉴定表明21株菌均具有致病性，但存在致病能力的差异。选择对向日葵致病力最强的10株菌接种桃枝条，发现致病力也有差异。最后，对在桃上致病力表现最强的3株菌进行16S rDNA测序，确定其为根癌土壤杆菌，以其中致病性最强的AT4-3作为后继试验的致病菌。
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