【研究意义】由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病（rice sheath blight）是我国水稻三大病害之一［1］。近年来，由于矮秆品种的推广和栽培水平的提高，水稻纹枯病的发生呈加重趋势［2］。目前，水稻纹枯病的防治主要以使用井冈霉素为主，但从多年使用情况来看，对水稻纹枯病的防效仅50%～60%，且持效期短，需要频繁施药，由此带来大量的劳力用工成本及抗药性问题［3-4］。因此，研究开发新的防治药剂对于水稻的安全生产具有重要意义。【前人研究进展】季铵盐是一类广谱杀菌剂，因其制备方法简单、生产成本较低、物理化学性质较好，并且抗菌效果较好，被广泛应用于医学、食品、化妆品以及工业污水处理等方面［5］。季铵盐的抑菌机理主要表现在以下两方面：一方面季铵盐本身的阳离子通过静电作用吸附在菌体表面，穿过细胞壁到达细胞膜［6］，当聚集的季铵盐达到一定浓度，其疏水链会嵌入细胞膜中形成胶束体，破坏细胞结构，进而造成细胞内容物流出，导致细胞死亡［7］；另一方面，季铵盐通过与细胞膜上的蛋白结合或者破坏细胞膜上的酶，进而破坏细胞膜，从而达到杀死细胞的作用［5］。小分子季铵盐是指一类R基链较短的，且分子量小于500 g/mol，具有季铵盐结构的有机物。虽然小分子季铵盐对于微生物具有良好的抑菌效果，但是小分子季铵盐具有易挥发、稳定性差及环境毒性大的缺点［8］。大分子季铵盐是指分子量大于200 g/mol的具有季铵盐结构的聚合物，也有一些天然高分子材料的改性聚合物［6］。相较于小分子季铵盐，聚硅氧烷季铵盐具有稳定性好、环境毒性小、刺激性小、两亲性强及吸附性能更好等优点［9-10］。本课题前期研究表明大分子季铵盐的分子结构对其抑菌活性有较大影响，前期合成的聚二甲基硅氧烷接枝季铵盐（PDMS-g-BC）和聚丙烯酰胺季铵盐（PQD-BC）两种大分子季铵盐具有引起菌体细胞膜发生脂质过氧化的功能，这是小分子季铵盐不具备的［11］。聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季铵盐嵌段共聚物具有不同于PDMS-g-BC和PQD-BC的结构，有必要深入探究其对R.solani细胞膜的影响。【本研究切入点】通过对细胞膜的完整性、渗透性以及细胞膜的脂质过氧化反应来表征聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季铵盐嵌段共聚物对水稻纹枯病菌细胞膜的影响，旨在为揭示两亲性大分子季铵盐防治水稻纹枯病菌的作用机制提供科学依据。【拟解决的关键问题】聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季铵盐嵌段共聚物不仅具有小分子季铵盐的良好抑菌效果，还具有区别于小分子季铵盐对于菌体细胞膜的抑菌机理。因此，可以通过研究其对菌体细胞膜的完整性、渗透性与功能性的影响，探索聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季铵盐嵌段共聚物在水稻纹枯病菌的作用机理及其在防治水稻纹枯病中的实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料
立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn AG-1(IA)，由华南农业大学农学院植物病理学系真菌实验室惠赠。
PDMS-b-(PDMAEMA-BC)的化学名为聚二甲基硅氧烷-b-聚(二甲氨基丙基甲基丙烯酸酯-苄基氯化铵)嵌段共聚物，是一类新型两亲性大分子季铵盐（Six-Q5，x = 0、2、5），按文献［12］采用原子转移自由基聚合方法（ATRP）合成。Si0-Q5、Si2-Q5与Si5-Q5的PDMS嵌段长度分别为0、2 × 103、5 × 103 ku，PDMAEMA-BC 嵌段的长度为 5 × 103 ku。
培养基与主要试剂：PD培养基和PDA培养基按文献［13］的方法配置。牛血清白蛋白（BSA）：生工生物工程有限公司；碘化丙啶（PI染液）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考马斯亮蓝G-250：广州威佳科技有限公司；蒽酮：分析纯，上海润捷化学试剂有限公司；硫酸：分析纯，广州化学试剂厂；三氯乙酸（TCA）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
主要仪器：荧光显微镜：型号Eclipse 80i，日本Nikon公司；紫外可见分光光度计：型号UV2300，上海天美科学仪器有限公司；电导率仪：型号DDS-11A，上海虹益仪器仪表有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 Six-Q5对R.solani细胞膜完整性的影响表征 （1）菌种活化：从斜面保存的试管中挑取R.solani菌丝，接种于PDA，于28℃培养箱培育48 h；用7 mm打孔器从培育2 d后的R.solani菌落边缘打取菌碟，接种于新的PDA平板培育48 h。
（2）菌液培养：从活化后的R.solani菌落边缘打取菌碟，将3块打取好的菌碟投入到45 mL PD培养基中，在28℃下以120 r/min摇床中孵育48 h，可得菌液。
（3）菌种培养：在超净工作台中配制不同浓度季铵盐溶液5 mL，之后加入45 mL菌液中，使其终浓度为0.5×IC50、IC50、IC90，在28℃培养箱孵育2 d。
挑取适量孵育后的菌丝于匀浆器，加入1 mL PBS缓冲液匀浆，取适量于血球计数板计数，制成菌悬液。取1 mL菌悬液于1.5 mL离心管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS重悬，10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复2次，洗去培养液备用。加入100 μL PI染液（10 μg/mL），于28℃培养箱中遮光培养1 h，10 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS重悬，10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复2次，洗去PI染液备用。取5 μL试样于载玻片，盖上盖玻片制成临时玻片，于荧光显微镜下观察。
1.2.2 Six-Q5对R.solani细胞膜渗透性的影响表征 根据1.2.1试验方法获得菌液，孵育48 h后抽滤得到菌丝备用，称取季铵盐，用蒸馏水定容至50 mL，使其终浓度为0.5×IC50、IC50、IC90。
（1）蛋白质含量测定：称取10 mg牛血清白蛋白标准品（BSA）定容于20 mL蒸馏水，得0.5 mg/mL对照品溶液，分别取0.00、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21 mL，分别加入1 mL蒸馏水混匀；以1 mL蒸馏水为空白对照，加入5 mL考马斯亮蓝染色，静置5 min后，在波长595 nm处测定蛋白质对照品的吸光度A595。用吸光度对浓度进行线性回归，求取标准曲线［14］。称取0.2 g菌丝置于配置好的各浓度季铵盐溶液，设定两组空白对照：用等量灭菌水代替季铵盐以及不含菌丝的各浓度季铵盐。每个处理3次重复，于28℃、120 r/min孵育，在0、2、4、6、8、24 h分别测定溶液中蛋白质含量，根据标准曲线计算含量，并且按照式（1）换算成单位质量菌丝的渗透量。
（2）碳水化合物含量测定：称取10 mg葡萄糖标准品定容于10 mL得到1 mg/mL对照品溶液，分别取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mL 加水至1 mL，加入5 mL蒽酮-硫酸溶液，沸水浴15 min，冷水浴10 min，在620 nm处测定吸光度A620。用吸光度对浓度进行线性回归，求标准曲线［15］。称取0.2 g菌丝于各浓度季铵盐溶液，对照组设定同蛋白质含量测定实验。每个处理3次重复，于28℃、120 r/min孵育，在0、2、4、6、8、24 h分别测定溶液中葡萄糖含量变化，根据标准曲线计算含量，并且按照式（1）换算成单位质量菌丝的渗透量。
（3）电解质含量测定：称取0.2 g菌丝于各浓度季铵盐溶液，对照组设定同蛋白质含量测定实验。每个处理3次重复，于28℃、120 r/min孵育，使用DDS-11A型电导率仪在0、0.5、1、2、3、6、9、24 h分别测定溶液中电导率的变化［11］。
1.2.3 Six-Q5对R.solani细胞膜脂质过氧化的影响表征 根据1.2.1试验方法获得菌液，孵育48 h后抽滤得到菌丝备用，称取季铵盐，用蒸馏水定容至50 mL，使其终浓度为0.5×IC50、IC50、IC90。称取0.2 g菌丝于不同浓度季铵盐溶液，对照组设定同蛋白质含量测定，每个处理3次重复，于28℃、120 r/min孵育24 h后抽滤，分别收集菌丝和培养液。
称取0.2 g菌丝，加入10%三氯乙酸（TCA）2 mL和少量石英砂，冰浴下研磨充分，加10 %三氯乙酸6 mL进一步研磨，取匀浆于高速冷冻离心机10 000 r/min、4℃下离心10 min得到上清液为样品提取液。用丙二醛（MDA）试剂盒测定菌丝（样品提取液）和培养液MDA含量，采用式（2）求MDA含量。
2 结果与分析
2.1 Six-Q5对R.solani细胞膜完整性的影响
为了研究3种不同结构的Six-Q5对R.solani细胞膜完整性的影响，本试验运用PI荧光染料，分别对经过3种具有不同嵌段结构的Six-Q5处理的水稻纹枯病菌菌丝染色，随后在535 nm绿色激发光下观察菌丝发射荧光的情况，并与其在自然光（白光）照射下的明场图片对比。由于PI染料分子无法通过完整的细胞膜，却可通过受损的细胞膜进入细胞与遗传物质结合［16］。因此，可用PI染色法来检测Six-Q5系列两亲性大分子季铵盐在3种浓度下对水稻纹枯病菌菌丝细胞膜完整性的影响。
图1 Six-Q5对R.solani菌丝细胞膜完整性的影响
Fig.1 Effect of Six-Q5 on cell membrane integrity of R.solani mycelium
图1 为3种Six-Q5对R.solani菌丝细胞膜完整性影响情况，图中白光为亮场下观察到的菌丝形态，荧光为在绿色激发光下观察到的菌丝形态，其中菌丝内部若能观察到红点，表示菌丝细胞膜完整性被破坏，PI染料与细胞膜内核酸结合。从图1可以看出，随着Six-Q5处理浓度的增大，R.solani菌丝内荧光从无到有，且荧光强度逐渐增强。其中，不含PDMS嵌段的Six-Q5（即Si0-Q5）对R.solani菌丝细胞膜完整性的影响不大，图中不能看到明显红色荧光亮点；而含较短PDMS嵌段的Six-Q5（即Si2-Q5）在高浓度（IC90）处理下，能看到明显红色荧光亮斑，说明在高浓度（IC90）处理下，R.solani菌丝细胞膜完整性被破坏，PI染料进入菌丝内部，与菌丝内部核酸结合；含较长PDMS嵌段的Six-Q5（即Si5-Q5）处理后，低浓度（0.5×IC50）处理下就可观察到红色荧光亮斑。表明随着Six-Q5中PDMS嵌段长度的增加，吸附性较强的两亲性大分子季铵盐更易吸附于菌丝表面，对菌丝细胞膜完整性的破坏作用更强。
2.2 Six-Q5对R.solani细胞膜渗透性的影响
本试验通过考马斯亮蓝染色检测蛋白质含量变化，蒽酮-硫酸比色法检测碳水化合物的含量变化，以及采用电导率仪检测电解质含量的变化；由于细胞膜破裂后胞内外渗透液压失衡会导致细胞内容物漏出到培养液中［13］。因此，可通过检测培养液中的蛋白质、碳水化合物及电解质含量变化判断细胞膜渗透性是否被破坏［17］，以及Six-Q5对R.solani细胞膜的破坏程度。
蛋白质测定标准曲线的回归方程为y = 6.53x+ 0.0114，r2 = 0.999，表明在 0.00～0.15 mg/mL 范围内，蛋白质浓度（x）与吸光度（y）呈良好的线性关系。碳水化合物测定标准曲线的回归方程为y = 2.61x - 0.00684，r2 = 0.999，表明在0.0～0.6 mg/mL范围内，碳水化合物浓度（x）与吸光度（y）呈良好的线性关系。
经过3种Six-Q5处理的R.solani培养液中蛋白质、碳水化合物及电解质含量变化分别见图2、图3和图4。由图2、图3、图4可知，3种Six-Q5都能对R.solani细胞膜渗透性产生影响，导致细胞内容物发生外泄，对照组及处理组的蛋白质、碳水化合物和电解质含量均随着时间的延长而逐渐上升，表明即使在没有季铵盐处理的情况下，正常的菌丝细胞由于渗透压平衡也会释放蛋白质、碳水化合物和电解质。但经过3种Six-Q5处理后，蛋白质、碳水化合物和电解质的含量随着时间增加得更多，表明经过Six-Q5处理后，菌丝细胞膜结构被破坏，细胞内蛋白质、碳水化合物和电解质渗漏速度更快。
图2 Six-Q5处理对R.solani培养液中蛋白质含量的影响
Fig.2 Effect of Six-Q5 treatment on protein content in R.solani culture solution
小写英文字母不同者表示处理间差异显著
Different lowercase letters among treaments represent significant difference
图3 Six-Q5处理对R.solani培养液中碳水化合物含量的影响
Fig.3 Effect of Six-Q5 treatment on carbohydrate content in R.solani culture solution
小写英文字母不同者表示处理间差异显著
Different lowercase letters among treaments represent significant difference
图4 Six-Q5处理对R.solani培养液中电解质含量的影响
Fig.4 Effect of Six-Q5 treatment on electrolyte content in R.solani culture solution
小写英文字母不同者表示处理间差异显著
Different lowercase letters among treaments represent significant difference
由图2可知，经过3种Six-Q5处理的培养液中的蛋白质含量各不相同。实验结果表明，随着PDMS嵌段的增长，培养液中蛋白质含量越高；并且经过Si0-Q5与Si2-Q5处理在8～24 h之间的增幅较小，而经过Si5-Q5处理在8 ～24 h这段时间内蛋白质的含量还有较明显提高。由图3可知，在低浓度处理下，碳水化合物含量在3种Six-Q5之间无显著差异；而随着浓度的提高与PDMS嵌段的增长，其培养液中碳水化合物含量有了一定差异，且嵌段较长的含量更高。如图2和图3所示，各处理在8 h后的蛋白质含量与碳水化合物含量与前6 h出现较显著差异，表明在8 h蛋白质及碳水化合物的渗透已经达到最大值，并且随着浓度的增加释放量逐渐增加。在处理8 h后对比各浓度的不同药物，发现在较高浓度（IC50和IC90）下随着嵌段长度的增加，外泄的蛋白质含量也有所增加，而碳水化合物之间则无明显差异。表著随着PDMS嵌段的增长、浓度的增加以及在一定时间范围内，Six-Q5对菌丝细胞膜的破坏程度增大，且Si5-Q5的破坏效果更持久、更有效。
如图4所示，随着处理时间逐渐增加，各处理菌丝培养液的电导率均有一定程度的增加，而对照变化不大。Six-Q5处理前期（0～1 h）电导率变化不明显，此后电导率随着处理时间逐渐增加而增加，中、高浓度处理电导率差别不大，但显著区别于低浓度处理，直到9 h后各处理的电导率值均出现微弱的减小趋势。在低浓度下，Si5-Q5处理的电导率明显大于Si0-Q5与Si2-Q5处理；而在较高浓度，发现Si2-Q5与Si5-Q5处理的电导率相当且均大于Si0-Q5处理。推测季铵盐作用9 h后菌体已裂解到最大程度，此时大部分胞内物质已释放至胞外，并有微量被菌体吸收或被其他微生物分解。表明随着PDMS嵌段的增长、浓度的增加以及在一定时间范围内，在较低浓度下Six-Q5对菌丝细胞膜都具有较明显的破坏效果，随着浓度的增加，嵌段长度的增效作用逐渐减弱。
2.3 Six-Q5对R.solani细胞膜脂质过氧化的影响
生物体中，自由基与脂质发生脂质过氧化作用的最终产物为MDA。由于MDA是一种水溶性分子，在细胞膜受到破坏会外泄，故可通过测定MDA含量来确定其细胞膜过氧化程度，从而确定细胞膜的损坏程度［18-19］。在正常细胞中，脂质过氧化反应与氧自由基反应处于动态平衡，当受到外界刺激（紫外线、高温、严寒、高盐等）时，氧自由基逐渐增加，即发生氧化应激。在氧化应激条件下，产生脂质过氧化产物（如MDA），从而改变细胞膜的流动性等，导致细胞膜的结构与功能发生变化［20］。因此，可能是由于大分子季铵盐的阳离子密度高，使得脂质过氧化反应与氧自由基反应的动态平衡被打破，产生氧化应激，从而发生了脂质过氧化作用。
图5 Six-Q5处理对R.solani菌丝细胞膜脂质过氧化的影响
Fig.5 Effect of Six-Q5 treatment on lipid peroxidation on R.solani mycelial cell membrane
小写英文字母不同者表示处理间差异显著
Different lowercase letters among treaments represent significant difference
利用MDA试剂盒，检测R.solani菌丝与培养液的MDA含量，结果见图5。由图5可知，对照组菌丝与培养液MDA含量均趋于0，处理组菌丝与培养液MDA含量则随着药物的浓度升高而增加。在培养液中，经过Si0-Q5与Si2-Q5处理的MDA含量稍大于经过Si5-Q5处理的MDA含量；而在菌丝提取液中，经过Si0-Q5与Si5-Q5处理的MDA含量随浓度的增加有较小幅度的增加，而在经过Si2-Q5处理后，随着浓度的增加MDA含量增加较多。表明经过Six-Q5处理后，菌丝细胞膜发生了脂质过氧化反应，由于菌丝细胞膜破裂，脂质过氧化的最终产物MDA渗漏于培养液中。且随着PDMS嵌段的不同，Six-Q5对于细胞膜的脂质过氧化影响也不同，其影响与Six-Q5的嵌段结构有关。
3 讨论
位于细胞壁内侧的细胞膜主要由类脂物质和蛋白质构成，是富有弹性的半透性薄膜，是菌体细胞的选择性渗透屏障。当细胞膜损伤时，通透性增强，细胞质中的重要物质向外泄露，导致菌体死亡。前人研究发现，一些抗真菌剂（如新农抗702、新型农抗N2提取物、纳他霉素等）就是通过损伤菌体细胞膜，造成细胞内含物外泄，从而起到杀菌作用［21-22］。
本试验结果表明，Six-Q5处理R.solani菌丝后，菌丝细胞膜完整性受到损害，胞内蛋白质、碳水化合物以及电解质发生外泄，尤其是随着药物浓度的提高，菌丝以及培养液中的MDA含量升高。表明大分子季铵盐打破了氧化自由基反应与脂质过氧化反应的平衡，发生了脂质过氧化作用，产生的MDA改变了细胞膜的结构和功能。细胞的脂质过氧化反应以及氧自由基反应对生物有机体新陈代谢具有重要作用，细胞经过高盐刺激后，打破了脂质过氧化反应与氧自由基反应的平衡，产生氧化应激，造成脂质过氧化，产生脂质过氧化产物MDA［18］。我们在前期研究中发现，小分子季铵盐不会引起水稻纹枯病菌细胞膜发生脂质过氧化，是否引起细胞膜发生脂质过氧化反应是Six-Q5与小分子季铵盐抑制水稻纹枯病菌在细胞膜这个作用靶点的重要区别。未来将通过研究两亲性大分子季铵盐Six-Q5对R.solani菌丝细胞膜麦角甾醇生物合成、活性氧（ROS）以及谷胱甘肽等的影响，来进一步揭示Six-Q5对水稻纹枯病菌的抑菌机理。
4 结论
3种具有不同聚硅氧烷嵌段长度的Six-Q5（即Si0-Q5、Si2-Q5和Si5-Q5）对水稻纹枯病菌菌丝细胞膜的完整性、渗透性以及脂质过氧化反应均产生了一定的影响，破坏了菌丝细胞膜的完整性，改变了细胞膜的渗透性以及促进了细胞膜的脂质过氧化反应，从而使得细胞膜的结构和功能发生变化；并且在一定时间范围内，随着PDMS嵌段的增长、处理时间的增加以及季铵盐浓度的提高，其对菌丝细胞膜的影响也更加显著。通过以上研究，初步确定了细胞膜是Six-Q5抑制水稻纹枯病菌一个作用靶点，为Six-Q5类大分子季铵盐的结构优化及其在水稻纹枯病防治中的应用提供一定的理论指导。
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