【研究意义】棉花是我国重要的经济作物，植棉业一直是我国农业的支柱产业之一，总产量居世界前列[1]。据记载，我国棉花病害有50多种，主要包括苗期、成株期、铃期病害等[2]，常见病害有枯萎病、黄萎病、立枯病、红腐病、炭疽病，其中立枯病、红腐病、炭疽病是苗期常发性病害，易造成枯苗、死苗。目前，化学农药防治仍是控制棉花病害的主要手段，但化学农药长期大量的使用易产生抗药性、农药残留、环境污染等问题。近年来，随着人们环保意识的提高，减少农药的使用、研制和开发生防菌剂已成为植保界和农药界共同关注的热点[3]。【前人研究进展】枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是防治植物病害的一种有效生防菌，抑菌范围较广泛[4-5]，其突出特征为生长速度快、营养简单，耐热抗逆性强且有利于生防菌的加工生产[6-7]。国外已有多个菌株获得商品化生产许可，如GBO3、MBI600、QST713[8]和解淀粉枯草芽孢杆菌变种FZB24[9]，我国成功开发的制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、萎菌净、亚宝等[10-11]。目前，市场上的枯草芽孢杆菌品种以可湿性粉剂、悬浮剂为主，使用方式为喷雾[7]。关于防治棉花病害的枯草芽孢杆菌丸化种衣剂以及配方筛选还未见相关报道。种衣剂以种子为载体，借助于成膜剂粘附在种子上，固化成为均匀的一层药膜，不易脱落。种衣剂具有保护种子、提高出苗率、促进幼苗生长、防治病虫害、增强抗逆性等作用[12-15]。以生物种衣剂和生物复合种衣剂为代表的新型种衣剂，能减少农药用量，降低病原菌、害虫产生抗药性的风险，具有广阔的发展前景[16]。【本研究切入点】本研究在前期研究工作中，已从土壤中分离筛选到一株对棉花苗期病害有抑制活性的枯草芽孢杆菌Yz菌株。通过室内生物活性测定，研究枯草芽孢杆菌Yz菌株对棉花苗期病害的抑制作用；并通过不同助剂的筛选，研制丸化种衣剂配方。【拟解决的关键问题】筛选对Yz菌株活性及对棉花种子发芽率影响较小的助剂，并确定各助剂的比例，为防治棉花苗期病害的生物型丸化种衣剂的研制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试棉花品种为鄂棉23号（裸种），由武汉市农业科学院提供。
供试菌株：棉花立枯病原菌（Rhizoctonia solani kuhn）、棉花炭疽病原菌 (Colletotricnum gossypii)、棉花红腐病原菌 (Fusarium moniliforme和 F.graminearum)均由武汉天惠生物工程有限公司提供，于2004年保存于华中农业大学农药研究室。枯草芽孢杆菌Yz菌剂发酵原粉（Bacillus subtilis）由武汉天惠生物工程有限公司提供，于2004年保存于华中农业大学农药研究室。
供试助剂：分散剂：十二烷基苯磺酸、NNO、拉开粉、木质素磺酸钠、XA-B，961。填料：糊精、膨润土、硅藻土、高岭土。粘结剂：羧甲基纤维素钠、明胶、果胶、黄原酸胶、海藻酸钠、阿拉伯树胶粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇。
1.2 试验方法
1.2.1 枯草芽孢杆菌Yz菌剂原粉对棉花苗期3种病害的抑菌活性试验 采用对峙培养法，在马铃薯蔗糖琼脂培养基平板上的4个角点接上已经培养好的指示菌菌块，在28 ℃培养1～2 d后（根据病原菌的生长情况），将活菌数为990×108 CFU/g Yz原粉用浓度梯度稀释法依次稀释50、102、103、104、105、106、107、108 倍，取 5 μL稀释菌悬液接于平板中央的双层滤纸片上，每个浓度接4个培养皿，28 ℃继续培养至对照刚长满整个培养皿后检查结果，测量Yz菌株的菌落大小和抑菌圈大小，记录拮抗活性和竞争作用的结果，以此判断Yz原粉对指示菌的生物活性。
1.2.2 枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂不同类型助剂的筛选 将各种助剂分别与Yz原粉按照1∶1（W/W）的比例混合均匀，密封储藏于54（±2）℃恒温箱中14 d，以未加助剂的Yz原粉为对照药剂，无菌水为空白对照，通过稀释平板计数法测定其菌数的数量，通过测定菌数的下降率判断各个助剂对Yz原粉生物活性的影响，进一步筛选出对Yz原粉活性影响较小的助剂。
1.2.3 枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂配方的筛选 根据1.2.2试验结果，选择几种不影响Yz原粉生物活性的助剂，按照种衣剂用途分成填充料、粘结剂和分散剂3类。通过棉花盆栽试验，以种子发芽率为种衣剂配方筛选的主要评价指标。进行第一轮L9（33）正交试验，确定不同类型助剂的最佳成分。再经过第二轮L9（33）正交试验，确定各个助剂的最佳用量，最终确定种衣剂的最优配方。
1.2.4 棉花盆栽试验 将种衣剂粗产品进行棉花种子包衣处理。棉种经过硫酸脱绒后加稀碱溶液水洗至pH=7左右后，精选饱满的种子，用枯草芽孢杆菌Yz菌剂原粉包衣后播于接入棉花立枯病菌的无菌沙（一根试管斜面病菌菌种接500 g无菌沙）中。无菌沙以塑料小碗分装，每碗装土300 g，每碗播15粒种子，置于华中农业大学农药研究室网室中。每个处理4次重复。并设为空白对照鄂棉23号（裸种），出苗后5～7 d调查出苗率和棉苗发病情况。
采用Excel（2007版）软件对试验数据进行分析和正交数据的处理。
2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌Yz菌剂原粉对棉花苗期3种病原菌的抑菌活性
试验结果（表1）表明，Yz原粉50倍稀释液对棉花立枯病原菌、棉花炭疽病原菌、棉花红腐病原菌的校正抑菌圈直径分别为10.07、15.54、8.96 mm。且随着浓度的降低，Yz原粉对3种病原菌的抑菌圈也逐渐变小，不同浓度处理的抑菌圈直径差异显著。
表1 Yz原粉对棉花立枯病原菌、炭疽病原菌、红腐病原菌的抑菌活性试验结果
Table 1 Result of antimicrobial activity experiments of Yz fermentation powder against cotton damping-off, cotton anthracnose, and cotton red rot
注：校正抑菌圈直径=抑菌圈直径-菌落直径。同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note：Calibration of inhibition zone diameter = Inhibition zone diameter- colony diameter.Different lowercase letters in the same column represent significant difference.
棉花立枯病菌Cotton damping-off棉花炭疽病菌Cotton anthracnose棉花红腐病菌Cotton red rot菌落直径Colony diameter（mm）50 10.07a 10.48 15.54a 9.29 8.96 a 8.17 102 10.21a 10.02 14.21b 9.07 7.66 b 8.61 103 9.14b 10.09 13.94c 9.36 8.31 a 8.45 104 10.07a 8.37 13.65c 8.39 7.94 b 7.48 105 7.39c 9.62 12.13d 6.66 7.06 cd 5.83 106 6.01d 9.06 13.64c 6.92 7.3 bc 6.24 107 5.40e 8.33 10.87e 10.87 6.57 d 5.86 108 5.16e 7.80 10.21e 10.21 6.98 d 6.89 Yz原粉稀释倍数Dilution ratio 校正抑菌圈直径Calibration of inhibition zone diameter（mm）菌落直径Colony diameter（mm）校正抑菌圈直径Calibration of inhibition zone diameter（mm）菌落直径Colony diameter（mm）校正抑菌圈直径Calibration of inhibition zone diameter（mm）
2.2 枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂不同类型助剂的筛选
试验结果（表2）表明，经54℃恒温处理后，未添加任何助剂的Yz原粉活芽孢下降率为68.5%。添加分散剂十二烷基苯磺酸钠、NNO、拉开粉、XA-B、961、木质素磺酸钠后，Yz原粉活芽孢下降率分别为70.80%、67.65%、67.60%、55.60%、60.50%、43.00%，各处理间差异显著；添加填料糊精、膨润土、硅藻土、高岭土后，Yz原粉活芽孢下降率分别为40.00%、57.50%、45.80%、63.00%，各处理间差异显著；添加粘结剂羧甲基纤维素钠、明胶、果胶、黄原酸胶、海藻酸钠、阿拉伯树胶粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇后，Yz原粉活芽孢下降率分别为23.80%、61.40%、69.00%、54.30%、56.18%、71.86%、39.50%、22.50%，各处理间差异显著。在实际操作过程中，糊精、聚乙烯醇因物理性状过于粘结，在粉剂加工中较困难。
综合上述试验结果以及各助剂的理化性质，选择以下助剂进行正交试验，分别为：填料（膨润土、硅藻土、高岭土），粘结剂（羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠），分散剂（木质素磺酸钠、XA-B、NNO）。
2.3 枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂助剂成分的优化
各种助剂和Yz原粉混合好后进行丸化种子包衣（填料：粘结剂：分散剂：YZ=3∶0.25∶0.3∶1），完成包衣后分别测定棉花种子发芽率。试验结果（表3）表明，粘结剂对棉花种子的发芽率影响较大，当组分为羧甲基纤维素钠时，棉花种子的发芽率较高，极差为19.17；其次是分散剂，当组分为木质素磺酸钠时，棉花种子的发芽率较高，极差为10.00；填料对棉花种子的发芽率影响相对较小，当组分为硅藻土时，棉花种子的发芽率较高，极差为4.16。结合正交试验结果，最终分别选择硅藻土、羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠为助剂，进入下一轮正交试验。
表2 各个助剂因子对Yz原粉生物活性的影响
Table 2 Effects of various additives factors on the biological activity of Yz fermentation powder
注：各个助剂与Yz原粉的比例为1∶1。同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note：The ratio of additives factor to YZ fermentation powder is 1 ∶ 1.Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
编号Number活芽孢下降率Reduction rate of living spores（%）1十二烷基苯磺酸钠 70.80a 11 羧甲基纤维素钠 23.80g 2 NNO 67.65b 12 明胶 61.40c 3拉开粉 67.60b 13 果胶 69.00ab 4 XA-B 55.60d 14 黄原酸胶 54.30d 5 961 60.50c 15 海藻酸钠 56.18d 6木质素磺酸钠 43.00e 16 阿拉伯树胶粉 71.86a 7糊精 40.00ef 17 聚乙烯吡咯烷酮 39.50f 8膨润土 57.50cd 18 聚乙烯醇 22.50g 9硅藻土 45.80e 19 热贮藏Yz干粉 68.50ab 10 高岭土 63.00c 20 未热储Yz干粉 0助剂因子Additives factors活芽孢下降率Reduction rate of living spores（%）编号Number助剂因子Additives factors
表3 助剂种类正交试验L9(33)设计与结果
Table 3 Orthogonal test design of additives L9(33) and the results
注：A列中1、2、3分别为膨润土、硅藻土、高岭土，B列中1、2、3分别为羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸钠，C列中1、2、3分别为木质素磺酸钠、XA-B、NNO。k1、k2、k3分别代表填料、粘结剂、分散剂的3种因子与其他因素组合时棉花种子的发芽率。
Note：In column A, 1, 2 and 3 are bentonite, diatomite and kaolin, respectively.In column B, 1, 2 and 3 are sodium carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone and sodium alginate, respectively.In column C, 1, 2, and 3 are sodium lignosulfonate, XA-B, and NNO.k1, k2 and k3 represent the germination rates of cotton seeds when the three factors of filler, binder and dispersant are combined with other factors.
试验号Number 因子Factor 发芽率Seeds germination rate（%）A填料Filler B粘结剂Binder C分散剂Dispersant 1 1 1 1 87.5 2 57.5 3 1 3 3 77.5 1 2 2 4 92.5 5 2 2 3 62.5 2 1 2 6 80.0 7 3 1 3 72.5 2 3 1 8 75.0 9 3 3 2 80.0 3 2 1 k1 74.17 84.17 80.83 k2 78.33 65.00 76.67 k3 75.83 79.17 70.83 R 4.16 19.17 10.00
2.4 枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂助剂含量优化
正交试验各个因子与水平的设置见表4。各种助剂和Yz原粉按表4设置的配比混合好后进行丸化包衣，完成包衣后分别测定发芽率。试验结果（表4）表明，从极差R值可以看出，3个因素对棉花种子发芽率影响的大小依次为B＞C＞A，即羧甲基纤维素钠对棉花种子发芽率的影响最大，其次分别为木质素磺酸钠、硅藻土。从各因素的不同水平看，A因素的第2个水平最好，B因素和C因素第1个水平最好。所以助剂最优配方组合为A2B1C1，即Yz种衣剂的最优配方为：A（硅藻土）∶B（羧甲基纤维素钠）∶C（木质素磺酸钠）∶YZ=3.0∶0.8∶0.1∶1（W/W）。
表4 助剂配比优化L9(33)正交试验设计与结果
Table 4 Orthogonal test design of optimization of the additives proportion L9 (33) and the results
注：A列中1、2、3分别为膨润土、硅藻土、高岭土，B列中1、2、3分别为羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸钠，C列中1、2、3分别为木质素磺酸钠、XA-B、NNO。K1、K2、K3分别代表填料、粘结剂、分散剂的3种因子与其他因素组合时棉花种子的发芽率。
Note：In column A, 1, 2 and 3 are bentonite, diatomite and kaolin, respectively.In column B, 1, 2 and 3 are sodium carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone and sodium alginate, respectively.In column C, 1, 2, and 3 are sodium lignosulfonate, XA-B, and NNO.k1, k2 and k3 represent the germination rates of cotton seeds when the three factors of filler, binder and dispersant are combined with other factors.
试验号Number因子Factor B羧甲基纤维素钠Sodium carboxymethyl cellulose A硅藻土Diatomite发芽率Seeds germination rate（%）1（2.5） 1（0.8） 1（0.1） 90.0 2 1（2.5） 2（1.0） 2（0.15） 81.7 3 1（2.5） 3（1.5） 3（0.2） 73.3 4 2（3.0） 1（0.8） 2（0.15） 86.7 5 2（3.0） 2（1.0） 3（0.2） 83.3 6 2（3.0） 3（1.5） 1（0.1） 96.7 7 3（3.5） 1（0.8） 3（0.2） 93.3 8 3（3.5） 2（1.0） 1（0.1） 83.3 9 3（3.5） 3（1.5） 2（0.15） 88.3 k1 81.67 90.00 90.00 k2 88.89 82.78 85.56 k3 88.33 86.11 83.33 R 6.66 7.22 6.67 C木质素磺酸钠Sodium lignosulfonate 1
3 讨论
枯草芽孢杆菌是一类嗜温性好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，其很多菌株都能产生丰富的抗菌物质。众多研究表明，枯草芽孢杆菌具有较好的抑菌作用，对苹果轮纹菌、苹果霉心病菌、炭疽病菌、红霉病菌、尖孢镰孢菌、水稻白叶枯病菌等均有明显的抑菌活性［17-21］。本研究测定了枯草芽孢杆菌Yz菌株对棉花苗期3种病害的抑菌活性，结果表明Yz菌株对棉花立枯病、棉花炭疽病和棉花红腐病均有较好的抑制活性，且Yz菌株原粉浓度越大，抑菌作用越明显。本试验结果与前人研究结果类似。枯草芽孢杆菌Yz菌株是从土壤中分离得到的，其发酵原粉与土壤的兼容性较好，可以在土壤中长期成活，持效性较好，将其开发成生物型种衣剂既能保护环境又能保护害虫天敌，对维持生态平衡具有重要作用。
活体微生物较易受加工条件和环境因素的影响而失活，通常在微生物制剂加工过程中需要添加助剂以保护活性成分的有效性，延长商品制剂的货架期［22］。但是，微生物制剂中的助剂可能对制剂的理化性质以及微生物本身活性有较大影响，因此必须考虑助剂与活体微生物两者的相容性［23］。本研究通过稀释平板计数法研究了助剂与枯草芽孢杆菌的生物相容性，并通过正交试验对枯草芽孢杆菌Yz菌株丸化种衣剂的助剂进行筛选和优化，发现当粘结剂、分散剂、填料分别为羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠、硅藻土时，棉花种子的发芽率较高；枯草芽孢杆菌Yz菌株种衣剂的最佳组合配方为：硅藻土∶羧甲基纤维素钠∶木质素磺酸钠∶YZ=3.0∶0.8∶0.1∶1。魏娇洋等［24］在制备解淀粉芽孢杆菌 X-278 片剂的过程中发现硅藻土为最佳载体，本研究结果与之类似。然而，孙朝华等［25］在对解淀粉芽孢杆菌TS-1203生防制剂研究发现，有机膨润土为最佳载体。这种现象可能与不同生防菌生物学及其生物化学特性有关，不同微生物与载体的相容性不同。本研究仅对枯草芽孢杆菌Yz菌株的丸化种衣剂助剂进行了筛选和优化，其在田间应用效果还有待进一步验证和研究。
4 结论
本研究通过抑菌圈试验，探讨了枯草芽孢杆菌Yz菌株对3种棉花苗期病害的抑菌活性；并通过正交设计试验，对助剂种类进行了筛选，研制了其丸化种衣剂配方。Yz菌株对棉花立枯病、棉花炭疽病和棉花红腐病均有较好的抑制活性，Yz菌株原粉浓度越大，抑菌作用越明显。通过正交设计试验，筛选到3种最佳助剂，分别为羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠、硅藻土，与枯草芽孢杆菌Yz菌株的最佳配比为：硅藻土：羧甲基纤维素钠：木质素磺酸钠：YZ=3.0：0.8：0.1：1。筛选到的丸化种衣剂配方在田间的应用效果有待进一步研究。
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