【研究意义】 随着工矿业及城市工业的快速发展，大量的重金属镉（Cd）进入农田土壤并持续累积，污染面积逐年增加。而土壤中镉不能被生物降解，其有效态易被作物富集吸收、进入食物链，对人体健康具有潜在风险[1-3]。土壤镉累积量越高其生物可利用性越高，可显著影响植株叶绿素合成并抑制光合作用，进而降低植物根系对养分和水分的吸收，最终导致作物品质下降[4-6]。【前人研究进展】 尽管前人应用各种方法尝试治理土壤重金属污染，但在实际运用中成效甚微[7-8]。近年来，利用土壤钝化剂使镉在土壤中的有效性和移动性降低从而降低植株对镉吸收风险的研究日益增多，其中生物炭的应用已逐渐成为重要的研究方向，在华南红壤区尤为突出。生物炭是生物质通过热裂解的方法在缺氧或者低氧条件下制备的一种富含孔隙结构、含碳量高的碳化物质[9]，其在土壤酸碱度改良、作物增产提质等方面的作用与应用已被广泛研究[10-11]，如生物质炭可直接或间接地降低土壤中重金属的生物有效性 [5,12]，还可直接吸附或固持土壤中重金属离子，甚至可以通过影响土壤持水性能、pH、CEC等理化性质来降低重金属的移动性和有效性，减少其向植物体内迁移，降低对植物的毒性风险[13-14]。【本研究切入点】 尽管生物炭的应用能够产生良好的农用和环境效益，但对于最优施用条件、最佳施用量及相关机理没有明确定论，其发挥作用的用量范围仍不稳定[15]；不同作物、不同地域、不同基质、不同管理条件等可能表现出不一样的结果；生物炭对重金属等污染物的作用是络合、螯合、吸附还是沉淀等皆不明确。本研究利用广东韶关地区镉污染严重的蔬菜土壤为基质，以小白菜为研究材料，通过添加不同量的生物炭，探讨生物炭对土壤镉有效性及对小白菜镉吸收、品质、代谢酶活性的影响。【拟解决的关键问题】 明确镉胁迫条件下抑制蔬菜镉吸收的生物炭最佳施用量，以期为华南镉污染农田土壤修复利用与保障农产品安全提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于2014年3月28日至5月25日在植物营养温室进行。供试小白菜为黑叶葵扇小白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino）。供试生物炭（以稻壳为原材料，在300～800℃、厌氧条件下制备所得，制备过程中加入2%硫酸亚铁，形成铁改性生物质炭材料）来自广东省生态环境与土壤研究所，其理化性质如下：pH值6.89，有机碳457 g/kg，全氮5.30 g/kg，全磷3.40 g/kg，全镉0.02 mg/kg，全铅2.70 mg/kg。供试土壤采自广东韶关矿区附近受镉污染的蔬菜农田土壤，质地为粘壤土，pH值5.60，有机质40.52 g/kg，速效钾67.54 mg/kg、水解氮250.01 mg/kg，有效磷9.03 mg/kg，总镉含量14.31 mg/kg。
1.2 试验方法
试验设5个耕层土壤生物炭施用量（W/W）处理：（1）0（CK），生物炭施用量为 0 kg/hm2；（2）0.1%（FeB1），生物炭施用量为1 725 kg/hm2；（3）0.3%（FeB2），生物炭施用量 5 175 kg/hm2；（4）0.5%（FeB3），生物炭施用量8 625 kg/hm2；（5）1%（FeB4），生物炭施用量17 250 kg/hm2。每个处理8次重复。基肥施用尿素0.15 g/kg、过磷酸钙0.13 g/kg、氯化钾0.06 g/kg。土壤自然风干，过2 mm筛，每盆土壤用量3 kg，将风干土壤、生物炭、基肥混合均匀，装入盆中。小白菜种子经消毒后，于营养土中育苗，经15 d后选取大小一致、生长良好的幼苗移栽，每盆移栽4株。
1.3 测定项目及方法
土壤pH采用pH计测定，有机碳采用重铬酸钾容量法，全氮采用半微量开氏法，全磷采用硫酸-高氯酸消煮法，速效钾采用醋酸铵-火焰光度计法，水解氮采用碱解扩散法，有效磷采用Olsen法[16]，水溶态镉、交换态镉和总镉含量参照GB/T 5009-2003中石墨炉原子吸收光谱法检测[17]。
小白菜植株培养42 d后，利用抖土法收集根际土壤与非根际土壤，附着根系的土壤为根际土壤，阴干后以木锤研磨并过0.25 mm筛淘去须根；用去离子水清洗根系后，用剪刀将小白菜茎叶与根分开，称取30 g茎叶样品测定硝酸盐、Vc及可溶性糖含量，取叶片去叶脉样品10 g测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性。剩余样品称鲜重后用去离子水清洗，80 ℃恒温杀青30 min，60℃烘干至恒重，称重，粉碎，过0.5 mm筛后，放入封口样品袋，干燥处保存，测定镉含量。植株茎叶样品的维生素C（Vc）含量测定采用2,6-二氯靛酚滴定法[18]，可溶性糖含量测定采用氰化盐-碘量法[18]，硝酸还原酶（NR）活性测定采用磺胺显色法测定[19]，POD活性测定采用愈创木酚氧化比色法[20]，SOD活性测定采用氮蓝四唑光还原比色法[21]，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法[22]，硝酸盐含量采用分光光度法[23]，Cd含量测定采用石墨炉原子吸收光谱法[24]。
试验数据采用Excel 2004进行前期处理，用SPSS 17.0统计软件方差分析，用LSD法进行多重比较分析和差异性检验。
2 结果与分析
2.1 生物炭对根际与非根际土壤水溶态镉、交换态镉含量的影响
从表1可以看出，与CK相比，添加生物炭显著降低了根际土壤水溶态镉含量，所有生物炭处理与CK根际土壤水溶态镉含量差异均达极显著，且生物炭添加量为0.5%时水溶态镉含量最低，此时根际土壤水溶态镉含量为CK的58.55%。但是，无论在根际土壤还是非根际土壤中，水溶态镉和交换态镉的含量并未随生物炭施用量的增加而呈现特定的规律性。
表1 生物炭对根际与非根际土壤水溶态镉、交换态镉含量的影响
Table 1 Effect of biochar on the contents of soluble cadmium and exchangeable cadmium in rhizosphere and non-rhizosphere soil
注：同一类型土壤同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著，大写英文字母不同者表示差异极显著。
Note: Different lowercase letters in the same column within the same soil represent significant differences,different capital letters represent extremely significant differences.
交换态镉含量Exchangeable Cd content（mg/kg）根际土壤Rhizosphere土壤Soil生物炭添加量Biochar addition（%）水溶态镉含量Soluble Cd content（μg/kg）0（CK） 29.93±1.03aA 5.33±0.22aA 0.1 29.77±2.42abA 5.23±0.07aA 0.3 27.48±2.16abA 5.69±0.63aA 0.5 25.10±1.22bA 5.31±0.16aA 1 27.11±5.74abA 5.50±1.03aA 0（CK） 29.51±0.41aA 5.46±0.17aA 0.1 24.12±2.30bB 5.44±0.17aA 0.3 22.93±2.62bcB 5.47±0.06aA 0.5 17.28±2.60dB 5.49±0.18aA 1 21.22±2.63cB 5.51±0.18aA非根际土壤Non-rhizosphere
2.2 生物炭对镉污染土壤小白菜生长的影响
从表2可以看出，添加生物炭处理能显著提高小白菜地上部的鲜重，且随着生物炭添加量的增加，小白菜地上部鲜重呈先增加后降低的趋势；同时，添加生物炭也能显著提高小白菜地下部的鲜重，但是在4个生物炭添加水平之间，地下部鲜重无显著性变化；在生物炭添加量为0.5%时，小白菜的总生物量最高，此时地上部、地下部生物量分别为CK的132.91%、138.94%。说明添加生物炭能够显著促进镉污染土壤小白菜的生长。
表2 生物炭对镉污染土壤小白菜生物量的影响
Table 2 Effect of biochar on the biomass of Chinese cabbage in Cd contaminated soil
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
地下部鲜重（g/盆）Biomass of root（g/pot）0（CK） 71.81±2.11c 3.03±0.11b 0.1 77.52±9.03b 3.62±0.51a 0.3 82.20±3.02b 3.80±0.33a 0.5 95.44±8.50a 4.21±0.23a 1.0 84.22±4.24b 3.92±0.30a生物炭添加量Biochar addition（%）地上部鲜重（g/盆）Biomass of shoot（g/pot）
2.3 生物炭对镉污染土壤小白菜品质的影响
由表3可知，Vc、可溶性糖与可溶性蛋白质含量均随生物炭用量的增加呈先增后降的变化趋势，均以生物炭添加量5%时最高；硝酸盐含量随生物炭添加量增加呈先降后增的变化，以生物炭添加量0.5%时最低。与CK相比，各添加生物炭处理的小白菜硝酸盐含量依次降低5.21%、9.50%、17.81%、15.19%，Vc含量依次提高47.05%、70.59%、117.65%、76.47%，可溶性糖含量依次提高8.82%、16.67%、29.41%、21.57%，可溶性蛋白质含量依次提高5.24%、16.19%、31.43%、9.76%。
表3 生物炭对镉污染土壤小白菜品质的影响
Table 3 Effects of biochar on the quality of Chinese cabbage under Cd Stress
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
生物炭添加量Biochar addition（%）可溶性蛋白质含量Soluble protein content（mg/g）0（CK） 2285.00±39.00a 0.17±0.01e 10.20±0.30e 4.20±0.03e 0.1 2166.00±31.00b 0.25±0.01d 11.10±0.20d 4.42±0.03d 0.3 2068.00±25.00c 0.29±0.01c 11.90±0.10c 4.88±0.03b 0.5 1878.00±10.00e 0.37±0.01a 13.20±0.20a 5.52±0.11a 1.0 1938.00±13.00d 0.30±0.01b 12.40±0.10b 4.61±0.06c硝酸盐含量Nitrate content（μg/g）Vc含量Vc content（mg/g）可溶性糖含量Soluble sugar content（mg/g）
2.4 生物炭对镉污染土壤小白菜体内酶活性的影响
由表 4可知，生物炭添加处理显著提高了小白菜体内NR、POD和SOD活性，且均随生物炭用量的增加呈先增后降的变化趋势，在生物炭添加量0.5%时最高。其中，NR活性增幅为14.17%～28.33%，POD活性增幅为5.06%～26.09%，SOD活性提高6.57%～25.76%。
2.5 生物炭对镉污染土壤小白菜体内镉吸收积累的影响
如表5所示，小白菜地上部分、地下部分的镉含量以CK最高，添加生物炭能显著降低小白菜体内的镉含量，但各生物炭添加处理间小白菜地上部的镉含量无显著差异。随着生物炭的添加量增加小白菜地下部镉含量呈先降后增的变化，在生物炭添加量0.5%时最低，此时小白菜地下部镉累积量也最低，仅为CK的88.38%。由此可见，生物炭添加处理能降低小白菜体内的镉含量，抑制小白菜地下部分对土壤中镉的吸收和累积。
表4 生物炭对小白菜体内酶活性的影响
Table 4 Effects of biochar on the enzyme activity of Chinese cabbage under Cd stress
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
生物炭添加量Biochar addition（%）SOD活性Superoxide dismutase activity（U/g）0（CK） 7.20±0.02e 3204.00±9.00e 198.00±4.00e NR活性Nitrate reductase activity（μg/g·h）POD活性Peroxidase activity（U/mg）0.1 8.22±0.03d 3366.00±28.00d 211.00±1.00d 0.3 8.58±0.20c 3792.00±9.00c 236.00±4.00b 0.5 9.24±0.25a 4040.00±20.00a 249.00±2.00a 1.0 8.70±0.18b 3844.00±19.00b 234.00±4.00c
表5 生物炭对小白菜镉吸收积累的影响
Table 5 Effect of biochar on Cd uptake of Chinese cabbage under Cd stress
注:同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
生物炭添加量Biochar addition（%）地下部镉累积量（μg/株）Cd uptake of root（μg/plant）0（CK） 8.78±0.05a 630.40±3.59a 16.30±0.09a 48.90±0.27a地上部镉含量Cd content of shoot（mg/kg）地上部镉累积量（μg/株）Cd uptake of shoot（μg/plant）地下部镉含量Cd content of root（mg/kg）0.1 8.39±0.01b 650.23±0.78b 14.73±0.22b 53.03±0.79b 0.3 8.37±0.01b 688.01±0.82c 13.08±0.05c 49.70±0.19c 0.5 8.34±0.02b 795.64±1.91d 10.29±0.07e 43.22±0.29d 1.0 8.36±0.03b 703.91±2.53c 11.4±0.25d 44.46±0.98c
3 讨论
生物炭孔隙结构发达、比表面积大，表面呈负电荷状态，阳离子交换量高，对增加土壤重金属离子的静电吸附量有显著的作用，从而可影响其在土壤中的迁移转化。而生物炭表丰富的能与重金属形成稳定的金属络合物的含氧官能团，能发挥对重金属持久的专性吸附[25]。本试验研究同样发现，铁改性生物质炭能较大幅度地降低小白菜根际、非根际土壤中水溶态镉含量，但根际土壤交换态镉含量与非根际土壤交换态镉含量差异未达显著水平，这与已有报道[26-28]不一致，可能是由于华南地区酸性土壤镉主要被土壤胶体或有机质吸附且量较大、生物炭添加对交换性镉影响较小所致。
在Cd胁迫下，植物细胞内活性氧转化为H2O和O2的生化反应会受到影响，导致植物细胞内的活性氧大量生成。而SOD和POD则是存在于植物细胞中重要的保护酶，它们的主要功能是减少具有毒性、高活性超氧化物自由基的形成，从而减少对植物细胞的毒害[29]。本试验中，在镉污染土壤中添加铁改性生物质炭能提高SOD和POD的活性，从而提高清除自由基的能力，显著提高小白菜Vc和可溶性蛋白质的含量，缓解Cd胁迫对小白菜的伤害。硝酸还原酶是一类含巯基的酶，Cd与硝酸还原酶的巯基结合，可破坏该酶的活性中心，使酶失活。本试验发现，添加铁改性生物质炭能提高硝酸还原酶的活性，从而降低小白菜体内硝酸盐含量，改善小白菜品质[30]。可溶性糖是参与细胞渗透调节的重要物质之一，其积累能提高植物细胞渗透浓度，对提高植物抗逆性具有重要作用[31]。在本试验中，生物炭的添加能促进小白菜体内可溶性糖含量增加，缓解Cd胁迫对小白菜的伤害。但在分析铁改性生物质炭的使用量、根际镉含量、SOD和POD的活性时，并未发现相互间呈现线性或明显的相关性，推测在根际土样分离时仍不够严格而致使差异不够显著，或取样时间点不足够难以呈现胁迫后响应的全过程动态变化。
由此可见，通过施加生物炭来降低植物对镉的吸收风险是可行的，但施用量不能过高，以生物炭添加量0.5%为最佳，对华南红壤镉胁迫下小白菜产量和品质具有明显促进和改善作用，同时降低小白菜对镉的吸收风险，但依据土壤的酸碱性特点仍须进行系统的施用量研究试验。
4 结论
本研究结果表明，在镉污染土壤中添加0.5%的生物炭既能降低小白菜根际与非根际土壤中水溶态镉含量，提高小白菜植株体内的SOD、POD和NR活性，从而提高小白菜Vc和可溶性蛋白质的含量、降低硝酸盐含量、降低小白菜地上部和地下部镉含量，添加生物炭能明显提高小白菜地上部和地下部生物量，改善小白菜品质，但添加量不宜过大。而且华南酸性土壤中镉因被土壤胶体或有机质吸附，生物炭对交换性镉影响较小，如何使生物炭在大田酸性土壤中发挥更大作用，并为小白菜等蔬菜的安全生产提供决策依据，还有待进一步深入研究。
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