【研究意义】 香蕉穿孔线虫（Radopholus similis Thorne,1949）是一种危害极其严重的迁移性内寄生土传植物病原线虫，被认为是全球最具毁灭性的十种植物病原线虫之一[1-2]，许多国家和地区将其列为危险性检疫线虫[3]，也被我国列为进境检疫性植物有害生物[4]。香蕉穿孔线虫寄主范围广泛，可危害多种植物包括果树、蔬菜、粮食作物和观赏植物等，曾报道该线虫可危害20多个科30多个属的360多种植物[5-8]。【前人研究进展】 目前对香蕉穿孔线虫的防治措施主要是采用化学防治、物理防治和农业防治的综合措施，其中化学防治仍是最主要手段。目前世界上生产使用的杀线剂约有30余种，常用的约有10余种[9]，而且大多是高毒、剧毒或残留持久的化学农药。根据作用方式可将杀线剂分为两大类，即熏蒸性杀线虫剂（fumigant nematicides）和非熏蒸性杀线虫剂（nonfumigant nematicides）。熏蒸性杀线虫剂目前常用的有溴甲烷、必速灭（棉隆）和威百亩，均用于土壤熏蒸处理[10]。熏蒸性杀线剂是灭生性药剂，杀线虫效果彻底，防病增产效果显著，不易诱发线虫抗药性。但使用量大，施用后需立即覆膜盖土，因此成本高、操作复杂；同时此类药剂的大量使用，对人类安全和环境造成极大的不利影响[11]，现面临被淘汰的境地。使用最广泛、效果最好的熏蒸性杀线剂是溴甲烷，它是一种卤代烃类熏蒸剂，在常温下即可蒸发成密度比空气大的气体，通过其强大的扩散性和渗透性可有效杀灭土壤中的线虫[12]。然而由于溴甲烷能够破坏臭氧层[13]，因此根据《蒙特利尔议定书哥本哈根修正案》，其已在全球被禁用[14]。非熏蒸性杀线虫剂目前常用的有丙线磷、苯线磷、克线丹、克线磷、克百威、涕灭威、甲基异柳磷和阿维菌素等，除阿维菌素类属于生物源农药，其它均为高毒或剧毒品种且残留严重，并且不能根除土壤中的植物病原线虫。目前的大多数香蕉品种不抗香蕉穿孔线虫，近年来开始关注利用分子育种技术研究培育抗香蕉穿孔线虫的香蕉品种来防控该病害[15-16]。【本研究切入点】 研发能代替传统杀线剂根除土壤中的香蕉穿孔线虫的有效途径，且建立高效、安全、环保而又能广泛运用的除治方法已成当务之急。植物线虫普遍不耐高温，经60～65 ℃水浴处理2～3 min就能被杀死[17]。香蕉穿孔线虫在48、50、52、55 ℃热水中分别处理25、10、6、5 min时的致死率均为100%[18]。【拟解决的关键问题】 通过研究在土壤中添加肥料并覆盖塑料薄膜，利用肥料分解产生的热能和太阳照射产生的热能共同形成的高温对土壤中香蕉穿孔线虫的杀灭效果。探索其替代熏蒸性杀线剂灭除土壤中香蕉穿孔线虫的可行性和具体处理方法，为香蕉穿孔线虫的防除提供一个可行、有效、便捷和安全的途径和方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试线虫是由华南农业大学植物线虫研究室保存和培养的香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，使用胡萝卜愈伤组织培养方法[19]进行保存和扩繁。
供试肥料为石灰氮和尿素。石灰氮（宁夏大荣化工冶金有限公司产品）：有效成分为氰胺化钙，剂型为10%颗粒剂。尿素（河南骏马集团化工有限公司产品）：有效成分为碳酰二胺，剂型为含氮量46.6%颗粒剂。
1.2 试验方法
将扩繁的香蕉穿孔线虫与灭菌的土壤混合，每公斤病土中虫口密度约8 000条，然后将8 kg病土分别与尿素和石灰氮混匀，尿素和石灰氮施用量分别为1 kg土壤施5 g和10 g，将病土和肥料的混合样品分别装入直径为15 cm、高40 cm的塑料管中，再分别覆盖白色薄膜与黑色薄膜，最后将所有塑料管紧密地堆积在一起围成圈状，外围用铁丝网附衬一层细网纱包围，铁丝网与塑料管围圈间填充约20 cm厚的土层（图1），防止塑胶管中的热量散失，更好地模拟大田环境，每个处理5次重复。试验中，利用温度计记录塑料管围圈正上方30 cm处的大气气温；利用地温计和WATCHDOG地温测定仪分别记录各处理塑料管中15 cm处和30 cm处的土壤温度；大气气温和土壤温度的纪录时间分别为各处理日8:00、10:00、12:00、14:00和18:00。以上试验在广州6～8月和8～10月进行两次，两次试验的处理方法一致。第一次试验在5周后，第二次试验在6周后，分别在塑料管内距离上端管口15 cm处和30 cm处扦插抽取土样50 mL，采用贝曼漏斗法[20]分离线虫，在解剖镜下统计虫数。第一次试验在6周后及第二次试验在7周后重复取样分离统计虫量，方法是将各处理塑胶管的土壤倒入灭菌的塑料袋中混匀后，抽取土样200 mL采用贝曼漏斗法分离线虫，在解剖镜统计线虫数量。
图1 利用化肥和阳光照射防除土壤中香蕉穿孔线虫
Fig.1 Eliminating Radopholus similis in soil by using chemical fertilizer and sunlight
A：装有处理土壤的塑料管（直径15 cm、高40 cm）分别覆盖黑膜和白膜，在距管上端15 cm处和30 cm处土壤中分别设置地温仪；B：装有处理土壤并覆盖薄膜的塑料管围圈，外围设置用于隔热的土层
A：Plastic tubes (diameter 15cm,height 40cm) with treated soil were covered with black films and white films respectively,geothermometers installed in soil 15cm and 30cm away from the top of the tubes respectively;B：Plastic tubes containing treated soil and covered with films were enclosed in a loop and a layer of soil was set on the periphery for insulation
2 结果与分析
2.1 添加石灰氮或尿素并覆膜的方法能促使土壤温度的升高
在自然情况下，土壤温度变化幅度小，比气温稳定，高温季节的土壤温度低于气温。本研究两次试验期间，在8:00各处理15 cm处土壤温度与气温接近，分别相差-1～0.1 ℃和0～1.4 ℃，在14:00各处理15 cm处土壤温度都高于气温，分别相差4.5～13.9 ℃和1.5～8.8 ℃（表1），表明本研究采用的添加石灰氮或尿素并覆膜的方法促使了土壤温度的升高。
对6月下旬至8月上旬试验期间的晴日数以及平均气温测录结果（表1）显示，晴日数为31 d，晴日气温范围为32～41 ℃，日平均气温范围为33～38.8 ℃，14:00的最高平均晴日气温为38.8℃。各处理土壤温度在14:00达最高，除了尿素覆黑膜处理30 cm处土壤温度为38.5 ℃，其他处理土壤温度均超过40 ℃，其中温度最高的为石灰氮覆白膜处理，15 cm处和30 cm处土壤温度分别为52.7、43.4 ℃，而且该处理12:00土壤温度分别为48.8、41.4 ℃，其他处理12:00 15 cm处土壤温度为40.5～44.7 ℃，30 cm处土壤温度末达40 ℃。因此石灰氮覆白膜处理提升土壤温度的效果最好。
对8月下旬至10月上旬试验期间的晴日数以及平均气温测录结果（表1）显示，晴日数为38 d，晴日气温范围为27～39 ℃，日平均气温范围为29.8～37.6 ℃，14:00的最高平均晴日气温为37.6 ℃。各处理土壤温度也在14:00达最高，其中温度最高的为石灰氮覆白膜处理15 cm处为46.4 ℃，而且在8:00、10:00、12:00和18:00各个纪录时间，石灰氮覆白膜处理15 cm处土壤温度与同时间其他处理相比均为最高，分别为31.2、35.8、41.5、40.4 ℃，因此在此期间也是石灰氮覆白膜处理提升土壤温度的效果最佳。
2.2 利用化肥和阳光照射对香蕉穿孔线虫的灭除效果
试验结果显示，采用添加石灰氮或尿素并覆膜的方法处理感染香蕉穿孔线虫的土壤，分别在5周和6周后（7月26日和10月3日），从各处理塑料管的15 cm和30 cm处取样进行分离检测，未发现香蕉穿孔线虫；1周后又重复1次取土样进行分离和检测，仍未分离检测到香蕉穿孔线虫。因此，采用上述方法，在广州6～8月或8～10月期间，利用太阳照射5～6周以上，可有效灭除土壤中的香蕉穿孔线虫。
表1 不同处理晴日平均土壤温度变化 (℃)
Table 1 Change of the average soil temperature under different treatments on sunny days (℃)
注：T1：各测定时间平均晴日气温； T2：尿素10 g覆白膜处理晴日平均土温； T3：尿素10 g覆黑膜处理晴日平均土温； T4：石灰氮10 g覆白膜处理晴日平均土温；T5：石灰氮10 g覆黑膜处理晴日平均土温。
Notes: T1: Average temperature for each measuring time on sunny day.T2:Average soil temperature in the case of adding 10 g carbamide to the soil and covering it with white plastic films on sunny days.T3:Average soil temperature in the case of adding 10 g carbamide to the soil and covering it with black plastic films on sunny days.T4:Average soil temperature in the case of adding 10 g calcium cyanamide to the soil and covering it with white plastic films on sunny days.T5:Average soil temperature in the case of 10 g calcium cyanamide to the soil and covering it with black plastic films on sunny days.
试验时间Test time T1 T2 T3 T4 T5 15 cm处 30 cm处 15 cm处 30 cm处 15 cm处 30 cm处 15 cm处 30 cm处06-22～08-02 8:00 29.8 30.3 29.8 29.8 28.4 31.2 30.1 30.5 30.2 10:00 34.1 33.5 30.7 32.3 29.6 35.8 31.2 33.8 31.7 12:00 36.3 37.8 32.3 36.5 30.8 41.5 32.8 38.2 34.4 14:00 37.6 42.3 34.6 39.1 32.4 46.4 35.7 43.8 37.0 18:00 32.3 38.5 33.7 37.8 31.2 40.4 34.3 39.3 34.8 8:00 33.0 32.9 31.9 32.0 31.7 33.1 32.3 32.8 32.1 10:00 36.5 39.9 35.7 37.6 34.5 44.1 37.6 41.3 36.6 12:00 37.9 43.6 38.6 40.5 36.5 48.8 41.4 44.7 39.3 14:00 38.8 46.5 40.6 43.3 38.5 52.7 43.4 48.1 41.6 18:00 35.9 42.1 38.9 40.3 37.6 43.8 39.1 42.3 38.8 08-16～10-10
3 讨论
据国外报道[21-23]，在气温为24～36 ℃情况下，香蕉穿孔线虫在无寄主植物的田间土壤中可存活6个月。黄春晓等[24]报道了其在广州对香蕉穿孔线虫土壤存活情况的试验结果，其试验从2005年3月到2006年11月，供试香蕉穿孔线虫7个种群在无任何植物的土壤中至少能存活5个月，其中多数种群存活6～9个月，个别种群可存活11个月。即在经历了6月下旬至8月上旬广州年最高气温时期后，供试土壤中仍有香蕉穿孔线虫存活。本研究分别在6月下旬至8月上旬和8月下旬至10月上旬，通过在土壤中添加石灰氮或尿素并覆盖塑料薄膜处理土壤，分别在5周和6周后，即灭除了土壤中的香蕉穿孔线虫。因此，在高温季节，在土壤中添加石灰氮或尿素并覆盖塑料薄膜的方法可以作为根除土壤中香蕉穿孔线虫的可行和有效的土壤处理方法。
在6月下旬至8月上旬的第一次试验中，石灰氮覆白膜处理的土壤温度达到48 ℃以上的高温可持续2 h，香蕉穿孔线虫在48 ℃热水中处理25 min的致死率达100%[18]，所以该处理仅依靠土壤高温就可以完全有效灭除土壤中的香蕉穿孔线虫。第一次试验的其他处理和第二次试验的所有处理的土温虽然都低于48 ℃，但是这些处理土壤中的香蕉穿孔线虫也被灭除，可能是由于石灰氮和尿素分解释放出氰胺和氨气弥漫分布在土壤中与土壤温度一定程度升高的共同作用结果。
石灰氮的有效成分是氰胺化钙又称碳氮化钙，在土壤中与水反应，生成氢氧化钙和氰氨，同时放出热量；氰氨再水解生成尿素，最后分解成氨，其不但对土壤中各类线虫具有杀灭作用，而且还可以杀灭土壤中其他有害生物[25]，但是不会对环境产生危害并且能增加土壤肥力。尿素含氮量高（通常在45%～46%），是固体氮肥中含氮量最高的化合物。其容易吸水，在高温条件下容易分解成氨并放出热量，对土壤中的植物线虫和其他有害生物同样有杀灭作用，而对环境无危害。蔡东纂等[26]将尿素与土壤1∶100的比例混伴并覆膜，6周后可以完全灭除土壤中的根结线虫。但未见施用石灰氮或尿素防除土壤中香蕉穿孔线虫的报道。
4 结论
本研究结果表明，在当地晴日平均气温最高值达到38.8 ℃以上，并保证晴日数在31 d以上，采用施尿素或石灰氮并覆盖白膜或黑膜的处理方法，处理5周以上的时间，可灭除土壤中的香蕉穿孔线虫。在当地晴日平均气温最高值达到37.6 ℃以上，并保证晴日数在38 d以上，采用上述方法处理6周以上的时间，同样可以灭除土壤中的香蕉穿孔线虫。在各处理方法中，石灰氮10 g覆白膜处理的土壤温度提升效果最好。石灰氮和尿素分别施入被香蕉穿孔线虫感染的病土并覆盖薄膜，在高温季节，配合阳光照射的作用均能灭除病土中的香蕉穿孔线虫，为有效防除土壤中香蕉穿孔线虫和减少环境污染提供了替代熏蒸性杀线剂处理土壤的方法。
[1]JONES J T,HAEGEMAN A,DANCHIN E G J,GAUR H S,HELDER J,JONES M G K,KIKUCHI T,MANZANILLA-LÓPEZ R,PALOMARES-RIUS J E,WESEMAEL W M L,PERRY R N.Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology[J].Molecular Plant Pathology,2013,14(9): 946-961.doi : 10.1111/mpp.12057.
[2]UREÑA-SABORIO H,MADRIGAL-CARBALLO S,SANDOVAL J,VEGA-BAUDRIT J R,RODRÍGUEZ-MORALES A.Encapsulation of Bacterial Metabolic Infiltrates Isolated from Different Bacillus Strains in Chitosan Nanoparticles as Potential Green Chemistry-Based Biocontrol Agents against Radopholus similis[J].Journal of Renewable Materials,2017,5(3-4): 290-299.doi : 10.7569/JRM.2017.634119.
[3]谢辉.香蕉穿孔线虫及其检测和防疫控制[J].植物检疫，2006,20(5): 321-324.doi: 10.3969/j.issn.1005-2755.2006.05.025.
XIE H.Detection and management of Radopholus similis[J].Plant quarantine,2006,20(5): 321-324.doi: 10.3969/j.issn.1005-2755.2006.05.025.
[4]中华人民共和国农业部.中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录（第862号公告）[R].北京：农业部公告，2007.
MINISTRY OF AGRICULTURE OF THE PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA.List of Imported Plant Quarantine Pests of the People's Republic of China (Announcement No.862)[R].Beijing: Announcement of the Ministry of Agriculture,2007.
[5]O'BANNON J H.Worldwide dissemination of Radopholus similis and its importance in crop production[J].Journal of Nematology,1977,9(1): 16-25.doi: 10.2307/1380029.
[6]TSANG M M C,KARA A H,SIPES B S.Efficacy of hot water drenches of Anthurium andraeanum plants against the burrowing nematode Radopholus similis and plant thermotolerance[J].Annals of Applied Biology,2004,145(3): 309-316.doi: 10.1111/j.1744-7348.2004.tb00388.x.
[7]李云，秦萌，徐春玲，李俊毅，刘淑婷，吴文佳，谢辉.基于rDNAITS的中国外来香蕉穿孔线虫种群的系统发育分析[J].华中农业大学学报，2017,36(6): 39-46.
LI Y,QIN M,XU C L,LI J Y,LIU S T,WU W J,XIE H.Phylogenetic analysis of exotic Radopholus similis populations in China based on rDNA-ITS[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2017,36(6): 39-46.
[8]符美英，曾向萍，王会芳，严婉荣，吴凤芝.6个相似穿孔线虫种群的形态特征rDNA-I序列分析[J].基因组学与应用生物学，2018，1(1): 268-271.
FU M Y,ZENG X P,WANG H F,YAN W R,WU F Z.Morphological characteristics and rDNA-ITS sequence analysis of six populations of Radopholus similis[J].Genomics and Applied Biology,2018,1(1):268-271.
[9]黄耀师，梁震，李丽.我国植物线虫研究和防治进展[J].农药，2000,39(2): 11-13.doi: 10.3969/j.issn.1006-0413.2000.02.003.
HUANG Y S,LIANG Z,LI L.Advances in research and control of plant nematodes in China[J].Pesticides,2000,39(2): 11-13.doi: 10.3969/j.issn.1006-0413.2000.02.003.
[10]陈品三.杀线虫剂主要类型、特性及其作用机制[J].农药科学与管理，2001,22(2): 33-35.doi: 10.3969/j.issn.1002-5480.2001.02.016.
CHEN P S.Main types,characteristics and mechanisms of Nematocides[J].Pesticide Science and Management,2001,22(2): 33-35.doi:10.3969/j.issn.1002-5480.2001.02.016.
[11]NICO A I,JIMÉNEZ-DIAZ R M,CASTILLO P.Control of rootknot nematodes by composted agro-industrial wastes in potting mixtures[J].Crop Protection,2004,23(7): 581-587.doi: 10.1016/j.cropro.2003.11.005.
[12]ESHEL D,GAMLIEL A,KATAN J,GRINSTEIN A.Evaluation of soil fumigants on soilborne fungal pathogens in a controlled-environment system and in soil[J].Crop Protection,1999,18(7): 437-443.doi:10.1016/S0261-2194(99)00042-3.
[13]SINGH H B,KANAKIDOU M.An investigation of the atmospheric sources and sinks of methyl bromide[J].Geophysical Research Letters,1993,20(2): 133-136.doi: 10.1029/92GL02634.
[14]王跃进.溴甲烷及其替代技术（一）[J].植物检疫，1998，12(2):103-106.
WANG Y J.Methyl bromide and its alternative technologies(1)[J].Plant Quarantine,1998,12(2): 103-106.
[15]SEENIVASAN N.Nematostatic activity of root extracts of banana(Musa spp.) genotypes as pre-infectional resistance mechanism against the burrowing nematode,Radopholus similis[J].The Journal of Horticultural Science and Biotechnology,2018: 1-14.doi:10.1080/14620316.2018.1444513.
[16]SEENIVASAN N.Phytochemical profiling of burrowing nematode(Radopholus similis) resistant and susceptible banana (Musa spp.)genotypes for detection ofmarker compounds[J].Fruits,2018,73(1):48-59.doi: 10.17660/th2018/73.1.6.
[17]谢辉.植物线虫分类学[M].北京：高等教育出版社，2005.
XIE H.Taxonomy of Plant Nematode[M].Beijing: Higher Education Press,2005.
[18]杨欣，陈勇良，赵传波，谢辉.香蕉穿孔线虫的致死温度和时间的测定[J].中国植物线虫学研究，2010（3）: 1-4.
YANG X,CHEN Y L,ZHAO C B,XIE H.Determination of lethal temperature and time of Radopholus similis[J].Studies on plant nematodes in China,2010(3): 1-4.
[19]PINOCHET J,FERNANDEZ C,SARAH J L.Influence of temperature on in vitro reproduction of Pratylenchus coffeae,P.goodeyi,and Radopholous similis[J].Fundamental and Applied Nematology,1995,18(4): 391-392.doi: 10.1111/j.1468-1331.2009.02740.x.
[20]HOOPER D J.Extraction and processing of plant and soil nematodes[J].Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture,1990：45-68.
[21]TARJAN A C.Longevity of Radopholus similis (Cobb) in host free soil[J].Nematologica,1961,6(2): 170-175.doi:10.1163/187529261X00423.
[22]LOOS C A.Eradictation of the burrowing nematode Radopholus similis from bananas[J].Plant Disease Reporter,1961,45(6): 457-461.
[23]SOSAMMA V K,KOSHY P K.Survival of Radopholus similis in host free soil[J].Indian Journal of Nematology,1986,16(1): 74-76.
[24]黄春晓，谢辉，韩玉春，秦丹.香蕉穿孔线虫土壤存活力的测定[J].华中农业大学学报，2009,28(6): 685-689.doi: 10.3321/j.issn: 1000-2421.2009.06.009.
HUANG C X,XIE H,HAN Y C,QIN D.Determination of viability of Radopholus similis in soil[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2009,28(6): 685-689.doi: 10.3321/j.issn: 1000-2421.2009.06.009.
[25]李宝聚，姜鹏，张慎璞，石延霞，崔国庆.日本石灰氮日光消毒防治温室土传病害技术简介[J].中国蔬菜，2005(4): 38-39.doi:10.3969/j.issn.1000-6346.2005.04.017.
LI B J,JIANG P,ZHANG S P,SHI Y X,CUI G Q.A Introduction to the technology of Prevention of Soil-borne Diseases in Greenhouses by Calcium cyanamide Solar Disinfection in Japan[J].Chinese Vegetables,2005(4): 38-39.doi: 10.3969/j.issn.1000-6346.2005.04.017.
[26]蔡东纂，程永雄，陈弘毅.球根花卉线虫病害之发生及防治[J].植物病理学会刊，1995(4): 180-192.
CAI D Z,CHENG Y X,CHEN H Y.Occurrence and control of bulbous flower nematode diseases[J].Journal of Plant Pathology Society,1995(4): 180-192.