【研究意义】 壬基酚聚氧乙烯醚（NPEOs）是目前全球商用第二大类的非离子表面活性剂，被广泛应用于工业（造纸、纺织、橡胶、塑料等）、农业（农药乳化剂等）以及日常生活（清洗剂、服装、化妆品等）中。在NPEOs生产和使用过程中，其降解产物壬基酚(nonylpheol，NP) 最终经工业废水、生活污水和城市污水等多种渠道进入水环境中[1]。进入水环境中的NP降解困难，现有对NP的处理方法不能实现水体NP的完全转化，水体中的痕量NP可以通过水生生物的高度富集而扩大浓度，从而对水产鱼类多脏器及胚胎发育产生毒性，降低鱼类的生育能力，导致鱼类品质下降、减产及鱼苗繁殖困难；此外，因富集而扩大浓度的NP还可以通过食物链进入人体，进而影响人类健康。研究资料表明，在长江、珠江等多条江河水系、水产品的养殖用水、池塘，甚至人们的饮用水中都检测到NP的存在，在常食深海鱼油的妇女乳汁和性早熟患儿血清中也都检测到NP[2-7]。NP通过染毒水产鱼类、降低其品质进而危害人类健康的风险客观存在。在目前无法完全去除水环境NP的条件下，对NP所致水产鱼类胚胎毒性作用的改善研究将有利于水产鱼类品质、产量的提高及优质鱼苗的培育。【前人研究进展】 研究表明，生物体内，有毒物质的代谢将产生大量活性氧，当机体内活性氧不能被及时清除时，可引起机体的氧化应激，导致抗氧化酶活性的改变和膜脂质过氧化的损伤，从而对机体产生损伤[8]。一定量的NP能导致海洋微藻、蛤蜊抗氧化系统的破坏，表明壬基酚诱发机体活性氧的形成导致抗氧化系统的损伤是壬基酚诱发水生生物毒性反应的机制之一[9-11]。【本研究切入点】 茶多酚是茶叶中提取出来的天然物质，占茶叶干重的15%～25%，不仅具有抗畸变、防癌抗癌的能力，对机体活性氧自由基和脂类自由基也具有显著的清除能力，此外茶多酚还是一种优良的解毒剂，能拮抗外源污染物等化学物质对肝、肾的损伤并保护机体免受化学物质的致畸作用[12-15]。刘振兴等[16]发现，在饲料中添加一定量的茶多酚可以显著提高罗非鱼的生长性能和免疫力，表明鱼饲养中添加茶多酚具有可行性。【拟解决的关键问题】 利用白鲫鱼胚胎为研究材料，研究NP对白鲫鱼胚胎的毒性影响，同时探讨茶多酚对NP所致白鲫鱼胚胎毒性的改善作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野生白鲫鱼亲鱼于繁殖季节（2017、2018年3—4月）在闽江捕获，分别进行预试验和正式试验，试验地点为福建师范大学动物实验室。催产激素LRHA2和 DOM购自宁波第二激素制品厂。NP（化学纯）购自南京奥多福尼生物科技有限公司，用无水乙醇（分析纯）助溶，配制成250 mg/mL。茶多酚（纯度＞95%）购自天津希恩思生化科技有限公司。挑选性成熟雌雄鱼进行人工催产，混合注射，自然产卵受精，取受精后24 h的健康胚胎进行试验。试验期间水温18～20 ℃。
1.2 试验方法
1.2.1 NP对白鲫鱼胚胎的毒性试验 试验设清水对照、溶剂乙醇对照和NP染毒处理。根据预试验结果，NP染毒处理设3个质量浓度梯度（ 0.04、0.40、4.00 mg/L），每个质量浓度设2次重复，每个重复随机放置200个胚胎。每隔24 h半量更换试验用水，试验用水均以预先曝气48 h的自来水配置，试验容器为24.5 cm×24.5 cm×9 cm的塑料盆，内置2 L试验用水进行充气孵化。每天观察并记录胚胎发育情况，卵凝结或心脏停止搏动为胚胎死亡标志。于受精后7 d按以下公式统计胚胎孵化率及幼鱼畸形率:
1.2.2 茶多酚对NP所致白鲫鱼胚胎毒性的改善试验 根据NP毒性试验结果，选取一定浓度的NP液为NP对照，在此基础上添加不同浓度的茶多酚进行毒性改善试验。按照10倍稀释的方法将茶多酚配置成 0.35、3.50、35.00 μg/L 3个浓度处理。每个处理2次重复，每个重复随机放置200个胚胎。具体方法参照1.2.1。
试验数据运用SPSS 11.0系统软件进行单因素方差分析，利用线性回归分析NP的染毒剂量与效应关系。
2 结果与分析
2.1 茶多酚对NP所致白鲫鱼胚胎孵化毒性的改善
2.1.1 NP对白鲫鱼胚胎孵化的毒性作用 结果（图1）表明，与清水对照相比，溶剂乙醇对胚胎的发育不仅没有抑制作用，还显著提高了胚胎的孵化率，这可能与乙醇抑制水霉菌的生长、改善胚胎孵化环境有关。与溶剂乙醇对照相比，中、低浓度（0.04～0.40 mg/L）NP能显著降低白鲫鱼胚胎的孵化率，高浓度（4.00 mg/L）NP对白鲫鱼的胚胎毒性强，孵化作用影响明显，胚胎接触高浓度NP 24 h后即发生心跳停止、血循环终止，表现为停育现象，其7 d孵化率为0。
图1 NP对胚胎孵化的影响
Fig.1 Toxic effects of NP on embryo hatching
柱上小写英文字母不同者表示差异显著
Different lowercase letters represent significant differences
2.1.2 茶多酚对胚胎孵化的改善作用 选取0.40 mg/L的NP为基础液，在此基础上添加不同浓度的茶多酚进行胚胎孵化的改善试验，结果（图2）表明，低浓度（0.35 μg/L）的茶多酚处理胚胎的孵化率与NP对照没有显著差异，中浓度（3.50 μg/L）的茶多酚处理胚胎的孵化率比NP对照显著提高，而高浓度（35.00 μg/L）茶多酚处理胚胎的孵化率明显低于中浓度（3.50 μg/L）茶多酚处理，与NP对照没有明显差异，表明仅适当浓度（3.50 μg/L）的茶多酚能提高胚胎的孵化。
图2 茶多酚对胚胎孵化的改善
Fig.2 Improvement of embryo hatching by tea polyphenols
柱上小写英文字母不同者表示差异显著
Different lowercase letters represent significant differences
2.2 茶多酚对NP所致白鲫鱼胚胎发育畸形的改善
2.2.1 NP对白鲫鱼胚胎发育的影响 胚胎染毒24 h的发育观察结果显示，清水对照、溶剂乙醇对照和低、中浓度（0.04～0.40 mg/L）NP染毒处理的胚胎中绝大多数发育正常，可观察到胚胎卵膜内具有明显的视泡与尾部，尾部卷缩细长达头部，身体背面皮肤、腹腔壁、卵黄囊表面覆盖大量分散的黑色素，头部下方搏动的心脏清晰可见，且有红色的血液流至心脏（图3A）。但高浓度（4.00 mg/L）NP对胚胎的致畸作用强烈，染毒24 h后即表现为胚胎尾部明显的发育不良，发育停滞于心跳期，光学显微镜下可以观察到高浓度（4.00 mg/L）NP中胚胎具有明显的视泡，心脏内可见红色血液，但不见血液流动及心脏跳动，尾部发育不完全（图3B）。
胚胎染毒48 h后，仔鱼开始陆续孵化出膜，刚孵出的仔鱼喜欢侧卧静止，多数仔鱼形态正常，显微镜下可以观察到其尾部笔直，背鳍、臀鳍、尾鳍鳍褶相连呈薄膜状；黑色素斑点已遍布头部、背部、躯干部；心脏正常跳动，血液周身循环（图4A）。少数仔鱼存在发育畸形，主要表现在：卵黄囊水肿，卵黄囊明显大于正常仔鱼的卵黄囊，表现出明显的卵黄囊吸收延迟现象（图4B）；脊柱往一侧弯曲，或者呈 “S”形弯曲（图4C）；尾部向背部一侧翘起弯曲（图4D）；断尾上翘同时伴有卵黄囊吸收延迟的现象（图4E）；尾部发育不良，长度明显短于正常仔鱼尾部（图4F）。
图3 染毒24 h的胚胎
Fig.3 Embryos exposed for 24 h
A：清水对照，体态正常，心脏搏动有力，血液流动通畅，尾部细长，弯曲至头部（箭头）；B：4.00 mg/L NP处理，胚胎发育停止，不见发育的尾部
A：Morphology of larvae in clear water (control).Morphological development of larvae is normal and their hearts beat vigorously,blood flows smoothly,tails are slender and bend to their heads (arrows).B：Morphology of larvae treated with 4.00 mg/L NP.The embryo ceases to develop and the tail is absent
图4 NP染毒后孵化仔鱼的畸变形态
Fig.4 Abnormal shapes of larval exposed to NP
A：形态正常；B：卵黄囊水肿；C：脊柱弯曲；D：尾部弯曲；E：断尾伴卵黄囊水肿；F：短尾
A：Normal shape；B：Delayed absorption of yolk sac；C：Spinal curvature；D： Tail bending；E：Tail amputation with delayed absorption of yolk sac；F：Short tail
对受精7 d的仔鱼畸形率统计显示，溶剂乙醇对照仔鱼畸形率与清水对照没有显著性差异，说明溶剂乙醇对白鲫鱼没有明显的致畸作用，而中、低浓度（0.04～0.40 mg/L）的NP对孵化仔鱼具有显著的致畸作用（图5），且孵化仔鱼的畸形率与NP浓度呈正相关。以NP染毒浓度为横坐标，对孵化仔鱼的畸形率进行回归分析，其方程式为：Y=7.59X -3.88 （R=0.94，P＜0.01），相关关系经统计学检验具有极显著意义。
2.2.2 茶多酚对NP所致胚胎发育畸形的改善 在0.40 mg/L的NP基础液中加入不同浓度茶多酚后发现，与NP对照相比，在本试验的浓度范围（0.35～35.00 μg/L）内茶多酚均能明显降低仔鱼的畸形率（图6）。
综上所述，NP对白鲫鱼胚胎的发育具有一定的毒性作用，不仅显著降低胚胎的孵化率，而且显著性提高孵化仔鱼的畸形率，高浓度的NP能迅速导致胚胎停育；在NP中加入适量茶多酚不仅能显著提高白鲫鱼的孵化率，还能显著降低NP所致白鲫鱼仔鱼的畸形率。
图5 NP对孵化仔鱼的致畸毒性
Fig.5 Abnormal rate of larval induced by NP
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Different letters represent significant differences
图6 茶多酚对胚胎发育畸形的改善
Fig.6 Improvement of the abnormal rate by tea polyphenols
柱上小写英文字母不同者表示差异显著
Different letters represent significant differences
3 讨论
NP在水体中广泛存在，其对水生生物的胚胎发育毒性具有普遍性，目前已知 NP对斑马鱼、玫瑰无须鲃、金鱼等鱼类的胚胎发育具有毒性。然而不同鱼种的胚胎对NP的敏感性并不一致。张慧等[17]对斑马鱼胚胎毒性的试验显示，仅高浓度的NP 才能显著降低斑马鱼的孵化率并导致尾部畸形率和心包囊肿率增多，而中、低浓度NP对斑马鱼受精卵的发育没有显著性影响。金鱼胚胎毒性试验结果表明，虽然低浓度NP对金鱼的囊胚和原肠胚发育没有明显影响，但能造成胚胎尾部脊索的弯曲，而高浓度NP对胚胎毒性强，引发胚胎出现畸形增多、卵凝结及死亡等异常情况[19]。玫瑰无须鲃胚胎对NP敏感性高，即使低浓度的NP也能对玫瑰无须鲃的受精卵产生毒性，引发受精卵发育延迟和脊椎畸形；高浓度的NP对玫瑰无须鲃毒性强烈，受精卵仅处理2h即发生胚盘损失和卵黄浑浊，继而出现卵凝结而死亡[18]。本试验利用NP对白鲫鱼胚胎进行染毒，发现白鲫鱼胚胎对NP同样敏感，中低浓度的NP不仅降低了胚胎的孵化率，而且还显著提高了孵化仔鱼的畸形率，高浓度NP对白鲫鱼胚胎毒性极强，直接导致胚胎的停育，NP对白鲫鱼胚胎发育的这种毒性影响，与玫瑰无须鲃的胚胎毒性试验结果非常类似。
不同发育时期的胚胎对NP敏感性的不同是影响胚胎发育结果的原因之一。一般认为鱼类受精卵在早期卵裂过程中，由于胚胎细胞处于高度分裂期，此时的胚胎对外界环境高度敏感，外环境的有毒物质往往通过影响细胞分裂而导致卵裂终止和胚胎死亡。卵凝结和发育停滞是NP对卵裂期胚胎发育毒性的主要表现形式。囊胚期和原肠胚的胚胎对NP的敏感性比受精卵卵裂期的胚胎弱一些，虽然NP造成囊胚期和原肠胚的胚胎发育时间有所延迟，但是形态学上没有很明显的变化，可能的原因是这两个时期细胞主要进行内陷、外包等运动行为[18]。当胚胎发育进入成体节期时，由于这个时期脊索和神经管正在形成，因此外界有毒物质的存在将导致脊椎畸形和神经管形成障碍，具有这类缺陷的胚胎或者不能孵化出来，或者携带各种缺陷孵化出来，主要表现为尾部弯曲、短缺或卵黄囊肿大等畸形。本研究预试验对受精卵直接染毒并修复进行分析，发现茶多酚对受精后马上染毒的胚胎没有明显的修复作用，故正式试验所用的胚胎材料为受精后约24～26 h的尾芽期胚胎。此期胚胎的早期器官雏形已经形成，在解剖镜下可见初步的大脑已分化，眼囊清晰可见，胚体尾部呈圆锥状尾芽，尾鳍和体节等尚未完全形成，因此这个时期的胚胎在接触NP后，仅对脊椎和体节的形成造成障碍，导致胚胎孵化率的降低及各种尾部畸形增多。
许多研究认为NP对生物体的毒害与NP诱发机体产生过量氧自由基有关[19-25]，而茶多酚诸多的生物学功能中，清除自由基、抗氧化能力尤为突出。因此本试验在NP基础液中加入适量茶多酚后能显著提高白鲫鱼胚胎的孵化率，并降低孵化仔鱼的畸形率，这可能与低浓度茶多酚改善胚胎的氧化损伤有关[26-31]。
4 结论
NP对白鲫鱼胚胎具有一定的发育毒性，不仅导致胚胎孵化率降低，而且引起孵化仔鱼畸形率增加，而在NP中添加适量的茶多酚能改善NP引发的白鲫鱼胚胎发育毒性，使得胚胎孵化率增加，孵化仔鱼畸形率下降。
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