【研究意义】杜鹃红山茶（Camellia azalea） 为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）常绿灌木或小乔木，自然分布于广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区，为广东省重点保护野生植物。杜鹃红山茶花期长，在适宜条件下可四季开花^[1]，为山茶属植物的园林应用打开了广阔前景。目前，国内外关于杜鹃红山茶的研究主要集中在濒危原因及保护、 生物学特性及新品种选育等方面^[2]，而分子生物学水平上的相关研究较少，仅有少量关于其叶绿体基因组方面的研究^[3]，基因功能方面的相关研究少见，而筛选杜鹃红山茶适用的qRT-PCR内参基因可为杜鹃红山茶基因功能研究提供理论基础和技术保障。【前人研究进展】在基因功能挖掘的过程中，基因表达模式是分析基因在物种中所起作用的重要方法之一。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是目前基因表达分析的主要方法之一，要确保其结果的可靠性与准确性， 需要选择研究条件下适用的内参基因或组合基因来检测目的基因的相对表达量，以提高结果的可靠性。转录延伸因子的编码基因（EF1α）^[4-5]、 α-tubulin（TUA）^[6]、β-tubulin（TUB）^[4]、 Ubiquitin（UBQ）^[7]、肌动蛋白（Actin）^[8-10]和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）^[8]等看家基因常被用作各物种筛选内参基因的候选基因。研究发现，在不同条件下，内参基因的表达量也会发生变化，例如火龙果在不同的胁迫条件下与不同组织中的适用内参基因不同^[5]，拟南芥在二倍体和四倍体中所用的内参基因数目有差异^[11]，类似的情况也存在于柠条锦鸡儿^[12]和白桦^[13]中。因此，正确选择、 使用内参基因对基因功能的研究显得尤为重要。这方面的研究在杜鹃红山茶中尚未见报道。【本研究切入点】选择EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH等6 个看家基因作为候选内参基因，通过不同的计算程序GeNorm和NormFinder评估这些看家基因在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的稳定性。【拟解决的关键问题】筛选出适用于杜鹃红山茶不同组织和不同时期花瓣qRT-PCR分析的内参基因。利用筛选出的适用于不同条件下的内参基因，分析目的基因CaGASA3 的表达模式，验证在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中最佳内参基因的可靠性，以期为进一步研究杜鹃红山茶的关键功能基因提供技术保障和理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试样品来源于生长健壮的杜鹃红山茶树（栽种于广东省农业科学院环境园艺研究所茶花资源圃内，N23°23'、E113°23'），树龄5 年，树高3 m， 冠幅1 m，直径3.5 cm。取幼根（YR）、成熟根（MR）、幼叶（YL）、成熟叶（ML）、4 期花瓣（PS4）和5 期花瓣（PS5）用于筛选不同器官适用的qRT-PCR分析的内参基因，3 次重复；选取花蕾长度分别为0.5 cm（S1）、1.0 cm（S2）、1.5 cm（S3） 以及4 期花瓣（S4）和5 期花瓣（S5）用于筛选花发育不同时期适用的qRT-PCR分析的内参基因，3 次重复。用液氮速冻，-80℃保存备用。 主要试剂仪器设备：UNIQ-10 柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（B511321，生工生物工程股份有限公司）， 荧光定量PCR仪（StepOne Puls型， 美国ABI公司），凝胶成像仪（FR-980A，上海复日科技有限公司），台式高速离心机（TD5AWS，湖南湘仪实验仪器开发有限公司），电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂），电泳槽（DYCP32B，北京六一仪器厂），微型旋涡混合仪（WH-3， 上海沪西分析仪器厂有限公司），数显恒温水浴锅（HS-800D，太仓市科教器材厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成

总RNA提取采用UNIQ-10 柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（B511321），具体操作参照说明书。400 ng RNA用于cDNA第一链合成，方法参照文献^{[9, 14]}稍作改动。所得cDNA-20℃保存备用。

1.2.2 内参基因的选择和引物设计

参考已有的研究报道^[4-10]，在杜鹃红山茶转录组结果（中国国家生物信息中心登录号：CRX165336）中筛选出6 个差异不显著的看家基因作为候选内参基因，分别为EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH。 引物通过NCBI-blast设计，所用参数为：扩增序列长度为100~250 bp，引物长度为18~25 个碱基， GC含量45%~55%，Tm值为60（± 3）℃。各内参基因的引物信息见表1，由生工生物工程股份有限公司合成引物。

1.2.3 qRT-PCR反应条件

利用LightCycler480II型荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应， 采用20 μL反应体系，其中2X SG Fast qPCR Master Mix（B639271, BBI, Roche）10 μL、ddH2O 7.2 μL、 10 ng/μL cDNA 2 μL、上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）分别为0.4 μL。PCR反应程序为：95℃ 3 min，95℃ 5 s、60℃ 30 s，45 个循环。每个反应3 次重复。

1.2.4 引物特异性鉴定及扩增效率计算

通过1.5%琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR扩增的产物进行分析，分析反应熔解曲线图，判断所设计引物的特异性。将所有cDNA原液等量混合后稀释，设置5 个浓度梯度，分别为cDNA原液的100、10^-1、 10^-2、10^-3、10^-4 倍，测定qRT-PCR的标准曲线。 程序运行完成后计算线性相关系数（R²）和扩增效率（E）。

1.2.5 内参基因稳定性验证及CaGASA3 基因表达模式分析

以综合排名稳定的2 个内参基因来校准杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中CaGASA3 的表达量，验证所筛选的内参基因的表达稳定性。 CaGASA3 基因qRT-PCR扩增所用的引物为：上游引物5'CTTTCACCACCTGGGTTTGG3'，下游引物5'CTCACTGAAGGCCGTGGTAAA3'。

1.2.6 数据分析与内参基因的确认

试验数据采用Excel和OriginPro 9.1 进行整理，利用GeNorm^[15] 和NormFinder^[16]评估6 个候选内参基因在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的表达稳定性，依据评估结果对各候选基因进行排序，筛选出两组样品中适用的内参基因。最适内参基因数目的确定可以利用GeNorm计算配对变异值（Pairwise Variation Value）来实现。当V_n/n+1 ＞ 0.15 时，应当选择n+1 个内参基因作进一步校正，若V_n/n+1 ＜ 0.15，则无需引入n+1 个内参基因进行校正，n个内参基因已达到准确校正目的基因表达量的要求。

2 结果与分析

2.1 总RNA质量及引物特异性

以杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣为材料提取总RNA，经过平板电泳检测发现，28S和18S条带清晰（图1），OD_260/280 介于1.86~2.03 之间， 表明获得的总RNA质量较好，可用于后续试验分析。

YR：幼根；MR：成熟根；YL：幼叶；ML：成熟叶；PS4：4 期花瓣；PS5：5 期花瓣；

S1~S5：分别为长度为0.5 cm花蕾、1.0 cm花蕾、1.5 cm花蕾，4 期花瓣和5 期花瓣

YR: young root; MR: mature root; YL: young leaf; ML: mature leaf; PS4: petal of Stage 4; PS5: petal of Stage 5;

S1-S5: The flower bud with lengths of 0.5 cm（S1）, 1.0 cm（S2）, 1.5 cm（S3）, and petals of Stage 4（S4）and Stage 5（S5）.

2.2 引物扩增特异性分析和扩增效率

PCR扩增产物经平板电泳检测，结果（图2） 显示，产物大小介于132~227 bp之间，符合设计预期，产物单一且无杂带，表明所设计引物的特异性较好；同时，利用所选的6 个候选内参基因引物，分别对杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣的5 个浓度梯度（10 倍稀释）的cDNA模板进行qRT-PCR扩增，根据所得数据绘制对应的标准曲线，结果表明，6 个候选内参基因的相关系数R2 ＞ 0.9927（表2），表明cDNA模板量与对应的Ct值有较好的线性关系，满足qRT-PCR要求。同时， 6 个候选内参基因在两组样品中的熔解曲线均为单峰（图 3），且重复性好，可用于不同器官和不同 时期花瓣中的后续试验。

峰（图3），且重复性好，可用于不同器官和不同时期花瓣中的后续试验。

1：Marker；2：EF1α；3：TUA；

4：TUB；5：UBQ；6：GAPDH；7：Actin

2.3 候选内参基因表达丰度分析

对6 个候选内参基因在不同器官和不同时期花瓣中的Ct值进行汇总，通过OriginPro 9.1 软件预测候选内参基因转录丰度，Ct值越小，表达丰度越高。由图4A可知，在杜鹃红山茶不同器官中， 所有候选内参基因的Ct值介于17~24 之间，表明表达比较适中。GAPDH和EF1α 的Ct值最低，分别处于17.85~21.73 和19.32~23.04 之间，表明这2 个基因转录丰度最高。而TUA和TUB的Ct值最高， 分别介于23.97~27.57 和22.60~28.17 之间，表明其转录丰度较低。由图4B可知，在杜鹃红山茶不同发育时期的花瓣中，所有候选内参基因的Ct值均介于17~22 之间，表明表达较适中。GAPDH的Ct值最低，介于17.60~19.48 之间，表明该基因转录丰度最高。而TUA的Ct值最高，介于23.65~26.11 之间，表明其转录丰度较低。

2.4 候选内参基因表达稳定性分析

利用2 个软件分别评估6 个候选内参基因在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的表达稳定性。

2.4.1 GeNorm分析

GeNorm算法是根据所有候选内参基因的成对变异值来计算各基因的表达稳定值M的，M值越小表明基因稳定性越好，M ＜ 1.5 的候选内参基因才可作内参基因使用。GeNorm评估结果表明，6 个候选内参基因的M值均小于1.5， 表现出较高的稳定性。在不同器官中候选内参基因的M值大小排序为：TUB ＞ EF1α ＞ Actin ＞ UBQ ＞ TUA ＞ GAPDH（ 图5A）， 其中以GAPDH和TUA基因的稳定性最好。在不同时期的花瓣中候选内参基因的M值大小排序为：TUA ＞ EF1α ＞ Actin ＞ GAPDH ＞ TUB ＞ UBQ（图5B），其中以UBQ和TUB的稳定性最好。 利用GeNorm计算杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的配对变异值，结果（图6）表明，不同器官中V2/3 值为0.148，不同时期花瓣中V2/3 值为0.107，二者均小于0.15，因此，本试验所选的两组样品中最适内参基因数目均为2 个。

2.4.2 NormFinder分析

NormFinder算法是基于方差分析对候选内参基因稳定性进行排序，并引入不同样品组间表达差异。与GeNorm类似，候选内参基因的表达稳定值M越小，表达越稳定。结果表明， 在不同的器官中，6 个候选内参基因按照M值由高到低排列依次为：TUB ＞ EF1α ＞ UBQ ＞ Actin ＞ TUA ＞ GAPDH（ 图7A）， 表明GAPDH最稳定，其次为TUA和Actin。在不同时期的花瓣中， 6 个候选内参基因按照M值由高到低排列依次为： EF1α ＞ TUA ＞ Actin ＞ GAPDH ＞ UBQ ＞ TUB（图7B），表明TUB最稳定，其次为UBQ和GAPDH。

petals of different stages（B）of Camellia azalea

2.5 内参基因稳定性的验证

为了进一步验证筛选到的内参基因的稳定性，选择不同器官中稳定性最好的内参基因（TUA和GAPDH）和不同时期花瓣中稳定性最好的内参基因（TUB和UBQ），校准CaGASA3基因的表达模式。 结果（图8）表明，在不同器官中，分别以TUA、 GAPDH和TUA+GAPDH为内参时，CaGASA3 的表达模式趋势一致，CaGASA3 基因在杜鹃红山茶的地上部分表达均较高；不同时期花瓣中，分别以UBQ、TUB和UBQ+TUB为内参时，CaGASA3 在花瓣发育的不同时期表达模式趋势相同，均在S4 期表达量达到最高。通过CaGASA3 基因的表达模式分析，进一步证明了TUA和GAPDH为不同器官中适用的内参基因，TUB和UBQ为不同时期花瓣中适用的内参基因。

图中每个盒代表1 个内参基因的1 组处理，盒中横线代表中位数，盒的上下分别代表上/下四分位， 两端的盒须代表95%置信区间，“×”表示异常值

Each box represents a set of treatments for a reference gene.For each reference gene, the horizontal line inside the box is the median.The top and bottom

lines of the box are the first and third quartiles, respectively.Both ends of box-whiskers represent 95%confidence intervals “×” represent outliers

A：不同器官；B：不同时期花瓣A: Different organs; B: Petals of different stages

A：不同器官，B：不同时期花瓣A: Different organs; B: Petals of different stages

A：不同器官，B：不同时期花瓣A: Different organs; B: Petals of different stages

YR：幼根；MR：成熟根；YL：幼叶；ML：成熟叶；PS4：4 期花瓣；PS5：5 期花瓣S1~S5：分别为长度为0.5 cm花蕾、1.0 cm花蕾、1.5 cm花蕾，4 期花瓣和5 期花瓣

YR: young root; MR: mature root; YL: young leaf; ML: mature leaf; PS4: petal of Stage 4; PS5: petal of Stage 5;

S1-S5: The flower buds with lengths of 0.5 cm（S1）, 1.0 cm（S2）and 1.5 cm（S3）, and petals of Stage 4（S4）and Stage 5（S5）.

3 讨论

qRT-PCR技术是目前最常用的基因功能分析方法，应用qRT-PCR检测基因功能的前提是筛选出合适的内参基因^[17-26]。GeNorm^[15] 和NormFinder^[16]是qRT-PCR内参筛选中两种常用的评估程序，已在多种植物中广泛应用。利用这些方法，Dai等^[4]筛选出不同胁迫条件下适用于桑树的内参基因；Saddhe等^[8]筛选出不同盐胁迫条件下适用于红树的内参基因；Da Silva等^[7]筛选出适用于甘薯不同组织中的内参基因；Nong等^[5]筛选出适用于不同胁迫条件下火龙果中的最佳内参基因。 通常，看家基因在不同组织器官中具有稳定的表达水平，但它们的转录水平在不同条件下会有相应变化^[6,27]。因此，筛选出适用于不同研究目的的内参基因非常重要。

本研究选择了6 种看家基因作为候选内参基因， 通过GeNorm和NormFinder评估了6 个候选基因表达的稳定性，并利用CaGASA3 基因的表达模式验证了所选内参基因的可靠性，最终得出在杜鹃红山茶不同器官中的最佳内参基因为TUA和GAPDH，在杜鹃红山茶不同时期花瓣中的最适内参基因为TUB和UBQ。内参基因 α-Tubulin（TUA） 编码的 α 微管蛋白是细胞骨架的基础成分，在进化上具有较高的保守性，在许多物种中均能稳定表达^[20]。GAPDH是糖酵解、糖异生及光合作用碳循环过程中的关键酶，在红球姜21 和彩色马蹄莲^[19] 中均表达稳定。TUB2 编码的 β-微管蛋白在桑树^[4] 中表达稳定。UBQ可在红球姜^[21]、黄杜鹃^[22]和火龙果^[5]等植物中表达稳定。本研究结果表明， 在杜鹃红山茶不同器官和不同时期花瓣中的最适内参基因是不同的。鉴于不同的环境条件，如非生物胁迫和生物胁迫都会影响内参基因表达的稳定性， 今后将对杜鹃红山茶的不同胁迫条件下内参基因的表达稳定性作进一步研究。

4 结论

本研究通过GeNorm和NormFinder对杜鹃红山茶中6个候选qRT-PCR内参基因的稳定性进行评估。 由GeNorm程序评估得到不同器官中6个基因的稳定性排名为：GAPDH＞TUA＞UBQ＞Actin＞EF1α＞ TUB，不同时期花瓣中6个基因的稳定性排名为： UBQ＞TUB＞GAPDH＞Actin＞EF1α＞TUA；由NormFinder程序评估得到不同器官中6个基因的稳定性排名为：GAPDH＞TUA＞Actin ＞UBQ＞EF1α＞ TUB，不同时期花瓣中6个基因的稳定性排名为： TUB＞UBQ＞GAPDH＞Actin＞TUA＞EF1α。利用GeNorm计算配对变异值表明，不同器官和不同时期花瓣中最适内参基因数目均为2个，因此，杜鹃红山茶不同器官中最适内参基因为TUA和GAPDH，而不同时期花瓣中最适内参基因为TUB和UBQ。

（责任编辑 崔建勋）

孙映波，硕士，研究员，广东省现代农业产业技术体系花卉创新团队营养与栽培岗位专家，广东省农业科学院二级学科带头人。现任广东省农业科学院环境园艺研究所学科指导专家，兼任中国花卉协会兰花分会理事、 广东省兰花协会理事、广东省园艺学会理事。 主要从事花卉园林植物种质创新利用与栽培、园艺作物营养与施肥、环境修复技术等研发工作。主持并完成省市各级科研项目10 多项，承担完成科技成果转化工作2 项， 指导培养研究生2 名，指导多名中级专业技术人员进修及开展科研工作；主持或作为主要完成人获得省级科技成果二等奖3 项，省级科技成果三等奖2 项，广州市科技成果三等奖1 项，国家农业行业标准1 项，市厅级科技成果一等奖1 项及二等奖8 项；以第一发明人获得授权专利3 项、 实用新型2 项；参与获得花卉新品种审定及新品种权8 个； 出版专著3 部；在核心期刊上发表学术论文50 多篇，其中第一作者10 多篇，通讯作者10 多篇。

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