细菌表达dsRNA介导桔小实蝇flightin基因的RNA干扰

袁瑞玲1,2,郑传伟2,3,冯 丹1,2,王艺璇2,杜春花2,陈 鹏2

(1.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室,云南 昆明 650201;2.云南省林业和草原科学院, 云南 昆明 650201;3.兴义市林业局,贵州 兴义 562400)

摘 要:【目的】探索饲喂细菌表达目标基因dsRNA介导桔小实蝇flightin基因RNAi的可行性。【方法】将桔小实蝇flightin基因的相应干扰片段构建至L4440干扰载体,并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达flightin基因对应的dsRNA,命名为flightin-dsRNA。【结果】通过饲喂表达flightin-dsRNA的大肠杆菌10倍浓缩菌液,桔小实蝇flightin基因的表达普遍出现了不同程度的上调,其中,雌虫饲喂后5、10、20 d,雄虫饲喂后5 d与对照差异显著,雄虫饲喂后15 d诱发约43%的下调;该方法对桔小实蝇飞行能力及胸部肌肉发育未产生明显影响。【结论】通过饲喂表达flightin-dsRNA的大肠杆菌对桔小实蝇flightin基因进行RNA干扰不可行或干扰效果不明显。

关键词:桔小实蝇;flightin基因;HT115(DE3)菌株;荧光定量PCR;RNA干扰

【研究意义】RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种广泛存在于真核生物中高度保守的、由dsRNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解,使相应基因不能表达,从而引发基因转录后水平基因沉默的现象[1-3]。dsRNA 导入生物体内后,被细胞中称为Dicer 的RNase Ⅲ分解成21~23 bp的小干扰RNA(siRNA),siRNA 在沉默复合体(RISC)的作用下与目标mRNA 结合,序列特异性地降解靶mRNA,阻止相应蛋白产物的合成,导致靶标基因的功能丧失。【前人研究进展】RNAi技术已被广泛应用在基因功能研究、高通量靶标基因筛选、基因治疗、药物靶标预测等领域,对多种农林害中的成功试验,也证实了利用RNAi进行害虫防治的可能性和广泛性[4-5]。RNAi 技术在害虫防治领域的应用需要大剂量dsRNA,目前最常用的试剂盒合成方法价格昂贵、不能持续生产。利用转基因寄主植物表达昆虫源dsRNA对害虫有一定防效,但植物转基因难度高、研究周期长,具有很大的局限性。用细菌(如大肠杆菌)表达dsRNA的方法操作简单,具有成本低且表达产物量大等特点,是基因工程四大表达系统之一[6]。饲喂或注射细菌表达的dsRNA 能显著干扰甜菜夜蛾[7]、非洲甘薯象鼻虫[8]等害虫的生长,证明该技术在植物保护方面的应用潜力。桔小实蝇[(Bactrocera dorsalis(Hendal)],又名东方果实蝇(oriental fruit fly),属双翅目(Diptera)实蝇科(Trypetidea)、果实蝇属(Bactrocera),是我国二类进境检疫性害虫[9-11],超强的飞行能力使得对桔小实蝇的防治变得困难[12-13]。目前对该害虫的防治手段主要有人工防治、化学防治及性诱剂的生物防治等,这些手段具有一定的防治效果,但总体存在效率低、成本高、对生态环境不友好的问题。因此RNA 干扰这种靶标性强、环境友好型的技术在害虫防控领域展现出较大的应用潜力。

【本研究切入点】飞行蛋白flightin是一种大小在20 ku的多磷酸化肌原纤维蛋白,最早是在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)间接飞行肌中被发现[14]。flightin对昆虫肌肉伸展活化具有重要作用,在间接飞行肌的粗肌丝上与肌球蛋白高度融合,调控和指导粗肌丝的准确组装和收缩等[14]。选择飞行蛋白flightin基因作为RNA干扰靶标,破坏昆虫飞行肌表达通路,阻止昆虫肌肉伸展活化及肌丝的组装和收缩等生理过程,可达到害虫防治的目的。【拟解决的关键问题】本研究以L4440 质粒为载体,构建了利用大肠杆菌HT115 表达桔小实蝇flightin-dsRNA的体系,通过对桔小实蝇新羽化成虫饲喂细菌表达的dsRNA,检测该方法介导的RNAi 在桔小实蝇中的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫 供试虫源为云南省林业科学院森保所室内饲养的桔小实蝇种群。饲养条件为:温度25~30 ℃,湿度60%~70%,光周期L16∶D8。

1.1.2 菌株及质粒载体 大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司,大肠杆菌HT115(DE3)购自北京华越洋生物科技有限公司,L4440 质粒购自美国 Addgene 机构,含egfp基因的质粒由西南林业大学徐进研究员惠赠。

1.1.3 酶及有关试剂 总RNA提取试剂盒Trizol-A+、FastKing cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Premix Ex Taq实时荧光定量PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,TSINGKE Master Mix DNA Polymerase购自北京擎科新业生物技术有限公司,T4 DNA 连接酶、DNase I、RNaseA、限制性内切酶SacI、XhoI购自thermofisher公司,氨苄青霉素(Amp)、X-gal、IPTG购自Amresco公司,盐酸四环素(Tet)购自solarbio公司,DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司,异丙醇、氯仿、无水乙醇等其他分析纯试剂购自利安隆博华(天津)医药化学有限公司,引物合成及测序委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA的提取及反转录 桔小实蝇总RNA的提取按照Trizol- A+试剂盒说明书进行。FastKing cDNA第一链合成试剂盒反转录得到cDNA,20℃保存备用,以此作为后续实验 PCR模板。

1.2.2 引物设计 根据桔小实蝇flightin基因转录组序列(GenBank登录号:XM_011210668),用siDirect(http://design.RNAi.jp/)在线预测可能存在的 siRNA 位点,选择其中 678 bp 序列作为RNA 干扰片段。用Primer5.0和Oligo6,结合含有T7聚合酶的L4440干扰载体的多克隆位点以及桔小实蝇flightin基因和egfp序列的限制性内切酶位点设计上游和下游引物。上、下游引物的5'端分别加入SacI和XhoI酶切位点。

1.2.3 桔小实蝇flightin基因及对照egfp基因片段的克隆 分别以桔小实蝇cDNA和含egfp基因的质粒为模板,按照TSINGKE Master Mix DNA Polymerase说明书进行PCR扩增,克隆桔小实蝇flightinegfp基因干扰片段。PCR扩增体系:TSINGKE Master Mix DNA Polymerase 12.5 μL,上、下游引物和模板各1 μL,加灭菌ddH2O至总体积25 μL。扩增条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。反应结束后,用l%琼脂糖凝胶电泳检测并用DNA回收试剂盒纯化回收目的片段送测序。

1.2.4 桔小实蝇flightinegfp基因的RNA干扰表达载体构建 将L4440质粒与胶回收的桔小实蝇flightinegfp基因片段分别同时用SacI和XhoI进行双酶切,37 ℃,1 h,分别回收酶切产物。用T4连接酶将回收的L4440载体分别与flightinegfp基因片段以1∶3比例室温连接10 min。连接产物命名为L4440-flightin、L4440-egfp,分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

将转化的感受态细胞涂布在含Amp、IPTG、Xgal的固体LB平板培养基上,37 ℃过夜培养,挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中培养,菌液PCR检测阳性后,提取重组质粒L4440-flightin和L4440-egfp,用SacI和XhoI双酶切鉴定,筛选阳性克隆,取阳性克隆菌液送测序。

1.2.5 重组质粒转化大肠杆菌HT115 用热激法将L4440-flightin和L4440-egfp表达载体转入CaCl2法制备的HT115感受态细胞中,涂布于含50 μg/mL Amp和12.5 μg/mL Tet的LB固体培养基上,过夜培养后挑取单菌落接种到Amp和Tet抗性的LB液体培养基中,提取质粒并通过PCR及双酶切鉴定阳性克隆,重组质粒进一步通过测序进行验证。

1.2.6 dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达 将带有L4440-flightin和L4440-egfp的HT115菌液接种于Amp和Tet抗性LB液体培养基中,37 ℃振荡培养过夜,1∶25比例将菌液转入新的LB培养基中,37 ℃,200 r/min培养至菌液OD600 =0.4左右,加入IPTG终浓度至1.0 mmol/L进行诱导表达,诱导培养4 h后收集菌液。采用TRIzol法提取细菌总RNA,DNase I和RNase A溶液消化纯化总RNA,获得flightin-dsRNA和egfp-dsRNA。

1.2.7 饲喂细菌表达dsRNA的菌液后桔小实蝇flightin基因的RNA干扰 从桔小实蝇羽化开始饲喂IPTG诱导表达靶标dsRNA的大肠杆菌HT115的 10倍浓缩菌液,处理组(饲喂flightindsRNA菌液)和对照组(饲喂egfp-dsRNA菌液)各3个重复,每个重复200头虫(雌雄比1∶1)。将浓缩菌液拌进成虫饲料,每天更换一次新鲜饲料,连续饲喂25 d,处理组和对照组雌、雄虫分开。

RT-qPCR检测RNAi效果:采集1、5、10、15、20日龄虫样品,3次重复,每个重复各取50头虫,分别提取总RNA。荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RNAi后flightin基因的表达情况,采用2-△△Ct方法计算靶标基因相对表达量。flightinegfp基因及16S内参基因的qPCR引物如下:

通过飞行能力测试检测RNAi效果:经过持续饲喂后,分别在5、10、15、20日龄利用佳多飞行磨系统进行雌、雄虫飞行能力测试,参照袁瑞玲等[15]的方法。

整虫与胸部组织质量测定:随机选取待测桔小实蝇各20头,使用乙醚轻微麻醉后迅速称量整虫质量,然后迅速在解剖镜下去除翅、足、头、腹等组织,仅留下胸部肌肉组织快速称量其质量。

试验数据用SPSS19.0统计软件进行方差分析,用Duncan氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 桔小实蝇flightin及对照egfp基因干扰片段的克隆

PCR扩增得到含SacI和XhoI酶切位点的桔小实蝇flightinegfp基因片段,结果为,桔小实蝇flightin基因片段介于500~750 bp之间,对照egfp基因片段介于100~250 bp之间分别与预期添加了酶切位点和保护碱基后的大小692 bp和201 bp相符(图1 A 3、4泳道)。测序结果与GenBank报道的序列进行比对,无碱基差异,同源性达100%,桔小实蝇flightin基因及egfp基因干扰片段克隆成功。

把载体质粒L4440和胶回收得到的目的片段分别经限制性内切酶SacI和XhoI双酶切后,2 790 bp的L4440质粒线性化单一条带约2 755 bp,桔小实蝇flightin及对照egfp基因大小正确(图1 A 2、5、6泳道)。

2.2 dsRNA表达载体的构建

图1 flightin和egfp基因干扰片段的克隆及干扰载体的构建
Fig.1 Cloning of RNAi fragment of flightin and egfp and construction of RNAi vector

HT115菌株中提取的重组质粒L4440-flightin和L4440-egfp(图1 B)经SacI和XhoI双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳20 min检测均分别得到两条带,2 755 bp的线性化L4440质粒载体,及678 bp和187 bp左右的flightinegfp目的片段(图1 C),表明桔小实蝇flightin基因和对照egfp基因片段成功转入L4440质粒中,与预期设计一致。双向测序结果与目的基因序列完全一致,阅读框正确,说明已经成功构建了L4440-flightin和L4440-egfp干扰表达载体。

2.3 饲喂表达目的dsRNA菌液后flightin表达水平

通过连续饲喂表达flightin-dsRNA和egfpdsRNA的菌液后,处理组与对照组相比,在雌、雄虫中均未产生预期的下调效果,反而出现了不同程度的上调现象。雌虫在饲喂后1、5、10、15、20 d时全部产生上调,与对照相比分别上调1.15、2.70、2.27、1.02、3.50倍,其中,饲喂后5、10、20 d与对照差异显著,饲喂后1、15 d与对照无显著差异。雄虫饲喂后15 d诱发约43%的下调,而在饲喂后1、5、10、20 d分别诱发1.38、2.77、1.57、2.98倍的上调,其中饲喂后5日龄与对照差异显著,其余差异不显著。结果表明,雌、雄虫均在饲喂后5 d诱发的上调幅度最大。

2.4 饲喂表达flightin-dsRNA菌液后对飞行能力的影响

连续饲喂表达flightin-dsRNA和egfp-dsRNA的菌液后,5、10、15、20、25日龄的雌、雄虫飞行能力测试结果(图3)显示,在飞行距离上各日龄处理组与对照组差异不明显。结果表明,饲喂表达flightin-dsRNA的大肠杆菌菌液对桔小实蝇进行RNA干扰,对其飞行能力没有明显影响。

图2 荧光定量PCR分析桔小实蝇flightin基因表达水平
Fig.2 Expression level of flightin from Bactrocera dorsalis by real-time quantitative PCR

图3 饲喂表达dsRNA菌液后桔小实蝇飞行距离
Fig.3 Flight distance of Bactrocera dorsalis after feeding bacterial expressing dsRNAs

2.5 饲喂表达flightin-dsRNA菌液后胸部组织与整虫鲜重比

根据桔小实蝇饲喂菌液进行RNAi后flightin基因的表达量测定结果,选取上调幅度较大的5日龄雌、雄虫称量其整虫与胸部组织的鲜重,得到胸部与整虫的鲜重比。结果显示,处理组雌、雄虫鲜重比分别为34.64%和36.53%,与对照组雌、雄虫鲜重比的34.39%和35.99%没有差异,认为饲喂菌液进行RNAi对胸部肌肉发育无影响。

3 讨论

诸多研究报道,利用大肠杆菌HT115(DE3)工程菌表达dsRNA是经济、高产的方法。早在1998年,Timmons等[16]就开始利用HT115表达的dsRNA喂食线虫,结果靶标基因的表达受到抑制。RNaseIII是细菌中普遍存在的dsRNA 特异性核酸内切酶,由rnc 基因编码,HT115 菌株为rnc-突变不能降解自身合成的dsRNA。HT115经过修饰,插入一个λDE3噬菌体衍生物,可通过IPTG诱导表达T7 RNA聚合酶。HT115的四环素和Amp抗性,可在培养过程中分别排除rnc+反突变体和空载质粒。L4440载体序列的多克隆位点两侧各有1个相反方向的T7 聚合酶启动子,转入HT115 菌株后,可经IPTG 诱导表达dsRNA。

随着细菌表达dsRNA技术的不断成熟,该技术在包括桔小实蝇在内的多种昆虫研究中得以实现,有效沉默了目的基因表达[6-7,17-20]。在玉米上喷施表达菌液可抑制花叶病毒的感染[21],在桔小实蝇精子形成相关基因lolatopiracrhoupdmagu研究中,饲喂表达dsRNA的大肠杆菌干扰后,成功降低了基因表达水平并导致精子质量和数量的下降,产卵量及孵化率受干扰而降低[22]。利用该质粒构建的重组质粒可以在大肠杆菌HT115(DE3)中表达大量所需的外源目的dsRNA,在RNAi研究中,该方法比利用试剂盒体外转录和化学合成,能够大大降低实验成本,而且通过诱导表达目的dsRNA饲喂昆虫达到RNAi的操作相对简单易行[6,18]。然而,直接饲喂也存在一些问题,Li等[6]直接喂食桔小实蝇NoaRab11、V-ATP-DRpl19基因表达dsRNA的大肠杆菌后,成功降低了基因的表达水平,但部分出现上调现象。Liu等[23]研究表明,桔小实蝇成虫长期饲喂dsRNA或表达dsRNA的大肠杆菌菌液,靶标基因均会出现表达上调现象,导致该现象的机制尚不明确。在其他昆虫中不能成功干扰靶标基因的例子也鲜有报道,如黑腹果蝇饲喂表达dsRNA的酵母未能沉默靶标基因表达,对果蝇3种亚种饲喂RNAi体系同样未实现目的基因的沉默等[24-25]

本研究结果表明,桔小实蝇饲喂表达flightin基因dsRNA的大肠杆菌未造成预期的目的基因转录水平的下调,也未造成飞行能力的减弱或影响发育等,分析认为,未能成功沉默靶标基因的原因可能有:饲喂法对于桔小实蝇存在对RNAi的非基因特异性免疫耐受机制,有关桔小实蝇RNAi免疫耐受研究发现,dsRNA摄取由胞吞机制调控,其间会受到阻遏而无法进入细胞[26];饲喂表达dsRNA大肠杆菌后导致靶标基因上调,存在应激机制及抗性可能是造成这一现象的原因之一[27-28],很多刺激源(包括大肠杆菌)会激发桔小实蝇siRNA通路;Zambon等[29]发现果蝇在抗病毒过程中,出现基因表达上调,结果证实病毒激发了IMD、Toll-way和Jak-STAT的信号通路;不同物种中肠环境差异导致RNAi效率也不尽相同;摄取dsRNA剂量不合适,饲喂法由昆虫自主取食,无法保证其摄取量而影响RNAi效率,也无法确定引发RNAi的dsRNA剂量;桔小实蝇flightin基因在饲喂后1日龄时表达最高,成虫开始饲喂RNAi基本已经过了该基因表达高峰,饲喂法错过最佳干扰时间;有研究表明基于饲喂法的RNAi效率普遍低于注射法[30],本课题组已通过体外转录合成flightin-dsRNA注射桔小实蝇,成功下调了flightin基因的表达,降低了成虫的飞行能力(待发表);也有大量研究表明dsRNA介导的RNAi在双翅目中具有效率不高和持效性差等诸多问题[28]

4 结论

采用RT-PCR技术克隆桔小实蝇 Bactrocera dorsalis(Hendel)flightin基因片段,并以此为靶标,设计有效的干扰片段,以线虫RNAi干扰载体L4440为载体,成功构建了桔小实蝇flightin基因RNAi载体。转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达flightin基因对应的dsRNA。通过饲喂表达flightin-dsRNA的大肠杆菌,桔小实蝇flightin基因的表达出现了不同程度的上调;该方法对桔小实蝇飞行能力及胸部肌肉发育未产生明显的影响。未能成功沉默flightin靶标基因的具体原因有待后续研究进一步探明,利用饲喂表达flightin基因dsRNA的大肠杆菌方法对桔小实蝇flightin基因进行RNA干扰的可行性还需进一步确认。

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RNA Interference of Flightin Gene Mediated by Bacterially Expressed dsRNA in Bactrocera dorsalis (Hendel)

YUAN Ruiling1,2, ZHENG Chuanwei2,3, FENG Dan1,2, WANG Yixuan2, DU Chunhua2, CHEN Peng2
(1.Key Laboratory of Forest Plant Cultivation & Utilization, Kunming 650201, China;2.Yunnan Academy of Forestry and Grassland, Kunming 650201, China;3.Xingyi City Forestry Bureau, Xingyi 562400, China)

Abstract:【Objective】The study was to explore the feasibility of feeding target gene dsRNA expressed by HT115-mediated RNAi in Bactrocera dorsalis(Hendel) flightin gene.【Method】The RNAi fragment of flightin from B.dorsalis was inserted into L4440 dsRNA interference vector, and transformed into E.coli HT115 (DE3).The dsRNA corresponding to flightin, designated as flightin-dsRNA, was expressed by IPTG induction.【Result】Real-time quantitative PCR analysis revealed that the expression of flightin in B.dorsalis was generally up-regulated in different degrees by feeding 10-fold concentrated bacterial solution expressing fl ightin-dsRNA to B.dorsalis.Among which, there were significant differences between females after feeding for 5, 10 and 20 days, males after feeding for 5 days and the control, and about 43% downregulation was induced in males after feeding for 15 days.The flight ability and chest muscle development of B.dorsalis were not affected significantly.【Conclusion】The feasibility by feeding E.coli HT115(DE3) expressing flightin-dsRNA to interfere with the flightin gene of B.dorsalis needs to be further confirmed.

Key words: Bactrocera dorsalis; flightin gene; HT115(DE3); Real-Time Quantitative PCR; RNA interference

中图分类号:S476

文献标志码:A

文章编号:1004-874X(2020)02-0118-06

doi:10.16768/j.issn.1004-874X.2020.02.016

袁瑞玲,郑传伟,冯丹,王艺璇,杜春花,陈鹏.细菌表达dsRNA介导桔小实蝇flightin基因的RNA干扰[J].广东农业科学,2020,47(2):118-123.

收稿日期:2019-12-14

基金项目:国家自然科学基金(31660208)

作者简介:袁瑞玲(1982—),女,硕士,助理研究员,研究方向为森林保护与病虫害,E-mail:yuan.office@aliyun.com

通信作者:陈鹏(1975—),男,博士,研究员,研究方向为森林保护,E-mail:chenpengkunming@aliyun.com

(责任编辑 杨贤智)