【研究意义】目前，贵州把发展“三白”（即白菜、白萝卜、莲花白）作为脱贫攻坚的关键举措；而且蔬菜产业是贵州省委省政府确定大力发展的12大特色生态产业之一，因此，甘蓝产业的可持续发展尤为重要。近年来，对贵州甘蓝主产地区的病毒病调查发现，芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）是仅次于黄瓜花叶病毒的最重要的田间蔬菜病毒。受TuMV侵染的甘蓝植株表现出花叶、褪绿、叶片扭曲、斑驳等典型症状，严重影响甘蓝的品质和产量。TuMV是世界上最重要的植物病毒之一，能侵染43科156属318种植物，包括许多重要的大田作物［1］。TuMV可由至少89种蚜虫以非持续的方式传播［1］，因此，TuMV的传播蔓延速度快，难以防控。而了解TuMV 在不同地区的发生分布和遗传变异是制定相应TuMV防控措施的科学依据。【前人研究进展】TuMV属于马铃薯Y病毒属，是一个正义单链RNA病毒，具有长700～750 nm的弯曲丝状颗粒，基因组约为10 000个核苷酸（nt）。基因组包含一个大的开放阅读框（ORF），它被翻译成一个大的多蛋白（自动催化水解成10种蛋白质），以及一个小的重叠ORF［2］。TuMV的CP基因是马铃薯Y病毒基因组的一个可变区，已被广泛应用于该属分离株的分类［3-5］。从世界各地收集的不同TuMV分离株的基因组序列进行系统发育关系研究表明，TuMV分离株可分为6个主要的TuMV系统发育类群：Orchis、basal-Brassica（basal-B）、Iranian、basal-Brassica/Raphanus（basal-BR），Asian-Brassica/Raphanus（Asian-BR）和 world- Brassica（world-B）［6-8］。TuMV分离株在生物学上可分为5种寄主侵染类型：侵染十字花科植物，但不侵染其他芸薹属植物；侵染寄主是潜在的，偶尔侵染芸苔属植物，不侵染萝卜属植物；系统地侵染大多数芸苔属植物（系统性花叶症状），但不侵染萝卜属植物；Basal-B（R）寄主侵染多种芸苔属植物，表现为花叶症状，但偶尔侵染萝卜属植物；Asian-BR寄主侵染芸苔属和萝卜属植物，表现为花叶症状［6］。basal-B是变异最大的组群，world-B是变化更大、分布更广的组群，basal-BR和Asian-BR的变异较小。大多数欧洲分离株不感染萝卜，而亚洲分离株同时感染芸苔和萝卜［9］。2002年在中国发现了Asian-BR和world-B组TuMV分离物，随后又发现了basal-BR组TuMV分离物［10-11］。【本研究切入点】TuMV在我国浙江、四川、重庆、山东、河北和北京等地的大白菜、萝卜、甘蓝、辣椒及中药材如太子参等作物上发生危害［12-15］，对作物品质和产量造成严重影响。由于TuMV寄主范围广泛，推测可能与TuMV极易发生基因重组变异相关。目前，已有TuMV全基因组、CP基因、Hc-Pro基因、P3基因以及3’-UTR区段等核苷酸序列的分子变异报道［16-21］。研究TuMV的遗传和分子变异，有助于了解病毒生物学的重要特征，如毒力变化、宿主适应性、地理范围，以及它们作为新的流行病出现的可能性，这对于提出TuMV的防控措施至关重要。根据前期调查研究，TuMV是危害贵州甘蓝的主要病毒之一，但是对其病毒分子变异特性等尚未有研究报道。【拟解决的关键问题】本研究对贵州甘蓝主产地区的甘蓝病毒病样品进行ELISA检测，明确TuMV在甘蓝上的发生分布，用RT-PCR对甘蓝TuMV分离物的CP序列进行扩增，并用相关软件对CP序列进行遗传进化分析，以期为甘蓝抗TuMV的育种和防控提供科学基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试样品：采自贵州省安顺市西秀区、平坝区，威宁县草海镇、双龙镇和修文县龙场镇、久长镇等地花叶、黄化等疑似病毒病的甘蓝样品。每个区镇采集3块地，每块地按东西南北中5个点选取不同症状感染病毒病的甘蓝叶片。带回实验室后液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
试剂：芜菁花叶病毒（TuMV）多克隆抗体、碱性磷酸酶标记物、阳（阴）性质控物等试剂为美国阿格迪Agdia公司产品。植物总RNA提取试剂盒 TransZol Up Plus RNA Kit（ER501）、TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AT311-02）、EasyTaq®Mix buffer和EasyPure Quick Gel Extraction Kit（EG101）等生物试剂购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 芜菁花叶病毒（TuMV）的血清学检测 称取0.5～1 g样品放入样品提取网眼袋，加入2 mL GEB通用样品提取缓冲液进行研磨。在酶标板加入包被抗体100 μL/孔，4 ℃过夜（或37 ℃放置3 h），PBST洗板4次，每次浸泡3 min。加入病叶粗汁液100 μL/孔，并设阳性、阴性和空白对照，37 ℃放置3 h。PBST洗板4次，每次浸泡5 min，然后加入含5%脱脂奶粉的PBST封闭30 min。加单克隆抗体 100 μL/孔，37℃放置 3 h。PBST洗板后加入羊抗鼠酶标抗体100 μL/孔，37 ℃放置3 h，PBST洗板。加对PNP substrate室温显色15～30 min。反应完全后用酶标仪检测各孔在405 nm波长处OD值，每份样品重复3次，以样品OD值比阴性对照OD405值≥2判为阳性。
1.2.2 TuMV CP基因的扩增，克隆和测序 植物总RNA提取试剂盒提取甘蓝叶片总RNA。以总RNA为模板，使用北京全式金生物技术有限公司的将总RNA反转录成cDNA。引物设计用已报道的TuMV CP基因序列（GU167976）为参考。引物序列为TuMV CP-F: GCAGATGAAA C G C T T G A C G C A G G C C；T u M V C P-R:TACAACTTCATAACCCCTGAACGCC。进行PCR扩增，PCR反应体系（25.0 μL）：2 μL cDNA，正向引物、反向引物各 1 μL，12 μL 2×EasyTaq®，9 μL ddH2O。扩增程序：94℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，32个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存备用。取4 μL的PCR扩增产物于1%琼脂凝胶电泳检测扩增效果，将目的片段进行胶回收，用pEASY1–Blunt Simple Cloning Kit进行连接，并转化到DH5a，涂布于载体相应抗性的LB培养基平板上。阳性克隆长出后，挑取单菌落进行摇菌，提取质粒，送重庆擎科生物公司测序。
1.2.3 TuMV CP基因序列分析 测序序列用NCBI中 BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 进行比对，利用Bioedit5对核苷酸序列数据进行组装，DNAMAN6.0软件对测序所得序列进行核苷酸和氨基酸一致性分析；MEGA7.0软件以邻接法构建系统发育进化树，各分支置信度（bootstrap）进行1 000次重复分析。以山药花叶病毒（JYMV）基因组的同源区作为分析的外群，由于BLAST搜索显示，它是国际序列数据库中与TuMV最为密切相关的序列。
2 结果与分析
2.1 TuMV 感染甘蓝的田间症状
甘蓝叶片感染病毒以后，叶片出现花叶、黄化、畸形或斑驳，甘蓝生长缓慢，比健康植株矮小（图1）。
图1 甘蓝感染TuMV的田间症状
Fig.1 Field symptoms of cabbage infected with TuMV
2.2 TuMV血清学检测
贵州威宁县、修文县和安顺市3个甘蓝主要种植区采集甘蓝病毒病样品152份，检测出TuMV阳性样品66份，检出率为43.42%。结果（表1）表明，TuMV在贵州甘蓝上普遍发生，而且不同地区发生分布存在差异。威宁县草海镇、双龙镇，修文县龙场镇、久长镇和安顺市平坝区甘蓝感染TuMV的检出率分别为46.88%、52.38%、58.33%、50.00%和61.54%，安顺市西秀区的甘蓝病毒病样品上未检出TuMV。
表1 贵州省甘蓝病毒病样品TuMV检测结果
Table 1 Test results of TuMV samples of cabbage from Guizhou Province
采样地点Sampling location样品数Number of samples阳性样品数Number of positive samples检出率Detection rate（%）威宁县草海镇Caohai Town,Weining County 32 15 46.88威宁县双龙镇Shuanglong Town,Weining County 21 11 52.38修文县龙场镇Longchang Town,Xiuwen County 24 14 58.33修文县久长镇Jiuchang Town,Xiuwen County 36 18 50.00安顺市平坝区Pingba District,Anshun City 13 8 61.54安顺市西秀区Xixiu District,Anshun City 26 0 0.00合计Total 152 66 43.42
2.3 TuMV CP基因的扩增
将所有的甘蓝病毒病样品用TuMV特异性引物进行RT-PCR扩增，获得目的片段进行回收、连接和转化，经测序获得864bp的TuMV CP基因。结果（图2）表明，威宁县草海镇、双龙镇，修文县龙场镇、久长镇和安顺市平坝区甘蓝上感染了TuMV，而安顺市西秀区未检出TuMV。
图2 TuMV CP基因RT-PCR扩增
Fig.2 RT-PCR amplification of TuMV CP genes
M：Maker; 1～15:不同地区感染TuMV甘蓝病样；16：阴性对照；17：阳性对照
M: Maker; 1-15: Cabbage samples infected with TuMV in different areas;16: Negative control; 17: Positive control
2.4 TuMV CP基因一致性分析
检测出TuMV的每个地区选择3个分离物进行CP基因核苷酸和氨基酸的比较，结果（表2）表明，15个分离物间的核苷酸同源性为88.70%～100%，与比对分离物的同源性要高，而组内和组间的氨基酸一致性均为100%。重组分析结果可知：15个TuMV分离物CP基因中仅检测到1个潜在事件，即wening-4可能为xiuwen-3和其他序列重组而成。RDP method、GENECONV、Bootscanning、MaxChi、Cimaera、3SEQ和SiScan 7种计算方法中只有MaxChi算出重组，为8.300×10-4，表明贵州侵染甘蓝的15个TuMV分离物CP基因无明显重组事件。
2.5 TuMV CP基因的系统进化分析
系统进化树表明，根据TuMV CP基因核苷酸序列的差异，15个分离物TuMV基因聚在两个不同的分支，Pingba-3与world-B分离物聚为一支，weining-1、2、3、4、5、6，xiuwei-1、2、3、4、5、6，pingba-1、2等14个分离物与basal-BR聚为一支（图3）。贵州甘蓝TuMV分离物没有分布在Orchis、basal-B、Iranian和Asian- BR组。结果表明威宁和修文TuMV分离物只有1个株系，而平坝TuMV分离物有2个株系。综上所述，15个TuMV甘蓝分离物存在2个株系，basal-BR是为害贵州甘蓝的优势株系。
3 讨论
目前，我国萝卜TuMV分离株可分为Asian-BR, basal-BR 和 world-B3个类群，其中半数以上（52.54%）为basal-BR类群［22］。随着对TuMV重组特性和病毒进化的研究，我国不同省份间优势株系存在差异。四川分离株聚在world-B群中［5］，山东、吉林两省萝卜的TuMV分离株属于basal-BR［23］。山东、河南、辽宁、黑龙江及陕西等省份具有TuMV大白菜、萝卜分离物大致归属于world-B和basal -BR2个组［12］； 重庆萝卜TuMV分离物属于word-B组和basal-BR组［13］。陕西省32个油菜TuMV分离物与已知的138株来自世界其他地区TuMV分离株或序列进行遗传分类，获得了4个遗传簇：MB（主要是芸苔属分离株）、MR（主要是萝卜属分离株）、IBR（主要介于芸苔属和萝卜属簇之间）和OBR（主要是芸苔属和萝卜属簇之外）［1］。综上所述，在我国对感染TuMV十字花科作物的研究，多数集中在萝卜、白菜和油菜，而对侵染甘蓝的TuMV的株系研究报道较少。
表2 甘蓝病毒病样品TuMV CP基因核苷酸同源性分析
Table 2 Nucleotide homology analysis of TuMV CP genes in cabbage virus samples
TuMV分离物编号Code of TuMV Isolate核苷酸同源性Nuclecotide homology（%）weining-1 100 weining-2 99.40 100 weining-3 99.40 100.00 100 weining-4 98.70 98.40 98.40 100 weining-5 98.70 99.30 99.30 99.10 100 weining-6 99.10 99.70 99.70 98.70 99.70 100 xiuwen-1 99.30 98.70 98.70 99.40 99.40 99.10 100 xiuwen-2 99.50 99.20 99.20 98.50 98.50 98.80 98.80 100 xiuwen-3 99.50 99.20 99.20 98.50 98.50 98.80 98.80 98.80 100 xiuwen-4 99.10 99.70 99.70 98.70 99.70 99.30 99.10 98.80 98.80 100 xiuwen-5 99.40 100.00 100.00 98.40 99.30 99.70 98.70 99.20 99.70 99.70 100 xiuwen-6 99.70 99.10 99.10 99.10 99.10 98.70 99.70 99.20 99.40 99.10 99.10 100 pingba-1 99.30 98.70 98.70 99.40 99.40 99.10 100.00 98.80 99.10 98.70 99.70 99.70 100 pingba-2 99.10 99.70 99.70 98.70 99.70 100.00 99.10 98.80 99.30 99.70 98.70 99.10 99.10 100 pingba-3 88.70 88.70 88.70 88.50 88.90 88.80 88.90 88.70 88.80 88.70 88.80 88.90 88.80 88.80 100 GBR7-AB076556 90.40 90.40 90.40 90.30 90.60 90.30 90.60 90.20 90.70 90.40 90.70 90.60 90.30 94.70 90.20 100 HZLB2-AJ831808 98.80 99.00 99.00 98.70 99.20 98.80 99.10 98.60 99.30 99.00 99.20 99.10 98.80 88.70 98.60 90.90 100
图3 TuMV CP基因分离物的系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of TuMV CP gene isolates
本研究采用ELISA和RT-PCR方法对贵州甘蓝病毒病样品进行TuMV鉴定，结果表明两种检测方法的阳性检出结果一致，说明这两种方法均能保证TuMV检测的准确性。在贵州威宁、安顺和修文等地种植的甘蓝上均能检测出TuMV，表明该病毒在贵州的发生分布较广。
TuMV CP基因是该病毒分组的重要依据［24］，而侵染贵州甘蓝的TuMV的种群结构特点未见报道。本研究通过TuMV CP基因进行扩增，测序比对，然后构建系统进化树发现贵州15个TuMV甘蓝分离物分布在basal-BR和 World-B组中，而北京感染TuMV甘蓝分离物用P3基因构建系统进化树发现，TuMV分离物属于 World-B组［25］；表明贵州与北京甘蓝TuMV分离物的归属是一致的。许多文献报道重组在植物RNA和DNA病毒变异和适应性进化中起着重要作用。在马铃薯Y病毒中，74%的TuMV基因组是重组体［10］。贵州15个TuMV甘蓝分离物CP基因无重组事件，这与前人研究结果一致［12］。这可能与寄主植物、采样时间、地理分布或环境条件等因素密切相关。
贵州甘蓝TuMV是basal-BR为优势毒源，山东和吉林萝卜TuMV是basal-BR型，而world-B组为重庆市萝卜的优势毒源［23］，这可能由于寄主植物和地理位置不同而产生的差异。江苏省徐州市感病的油菜、萝卜及菠菜上分离到 3个芜菁花叶病毒分离物位于 Basal-BR组［20］。表明basal-BR和 World-B组在我国的十字花科作物上普遍发生。对TuMV 序列进行x系统进化分析，能对其演变及致病性有深入的了解，可进行抗病育种鉴定。如在澳大利亚东部，一种新的芜菁花叶病毒（TuMV）突变株克服了TuMV抗性基因，抑制了该病毒在甘蓝型油菜作物中的传播［26］。因此，对感染TuMV的甘蓝分离物进行序列分析研究，有望进一步对我国甘蓝品种选育进行筛选鉴定，为TuMV的防控提供科学依据。
4 结论
在贵州甘蓝种植区进行调查发现，TuMV普遍发生危害，且引起甘蓝花叶、黄化等典型症状，用酶联免疫吸附法和分子生物学方法对贵州3个甘蓝种植区6个乡镇的152份甘蓝病毒病样品进行TuMV检测，结果表明有5个乡镇检测出该病毒，阳性检出率为43.42%。用TuMV CP基因进行序列分析表明，贵州TuMV甘蓝分离物有两个组群，分别为basal-BR和World-B组，除平坝有一个TuMV分离物聚在World-B组，多数TuMV分离物聚在basal-BR组。
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