食品安全是被定义为食物中有毒或有害物质引起影响人体健康的公共卫生问题［1］。我国是饲料生产和消费大国、动物源食品（肉类、鸡蛋、牛奶、水产品）生产大国，是兽用化学制剂、农药使用量最大的国家之一。每年至少超过5万t抗菌药物用于养殖业，超过50%为药物饲料添加剂，霉菌毒素污染农产品普遍存在，生态环境中重金属污染严重，从农场到餐桌食品安全的风险无处不在。发展灵敏、快速、准确的检测技术是保障食品安全的最后一道防线。用于筛选成本较低、速度较快的生物分析，尤其是基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析，是目前化学性危害因子快速检测的主流技术。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构（如Fc片段），从而克服单克隆抗体在应用范围方面的缺陷，具有广阔的应用前景［2］。研究表明，在骆驼科动物中发现的抗体能有效穿透肿瘤组织并快速消除。骆驼科动物自然产生仅由重链组成的抗体，其中靶抗原识别部分由单个可变结构域组成，重链抗体可变区也被称为纳米抗体，属于基因工程抗体，具有高溶解度、高稳定性、高特异性、亲和力。纳米抗体由于其优越的性能，在各种领域有着广阔的应用前景，包括食品安全检测、体内和体外疾病诊断、靶向治疗、靶向给药等［3-4］。本文就纳米抗体生物学特征、纳米抗体展示技术以及在食品安全检测中的应用进行阐述。
完整常规抗体形似字母Y，基础单元结构由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链通过二硫键连接组成，具有12个蛋白域和完整的Fc段，组成骆驼科重链抗体的两条完全相同的重链由铰链区形成的链间二硫键连接，每条重链分子由一个铰链区和两个恒定区（CH2、CH3）及重链可变区（VHH）组成，具有6个蛋白域以及完整Fc片段。骆驼科重链抗体与之相比，缺乏轻链与恒定区CH1，CH1是与轻链经链间二硫键相连的部位。单域抗体可变结构域（VHH）仅具有1个蛋白域，无Fc片段，分子量小，仅为常规抗体的1/10，约为15 ku，具有增加其溶解度的结构特征［5-8］。
人抗体重链的VH与骆驼重链抗体的VHH结构存在约75%的同源性，两者含有虽小但十分重要的差异，差异主要在于FR2和互补决定区（CDR）中。在VH的FR2内，4个高度保守的疏水性氨基酸（V37、G44、L45、W47）与VL结构域相互作用，在VHH中被4种亲水性氨基酸（F37、E44、R45、G47）取代，这些氨基酸的取代也解释了纳米抗体的溶解度增加现象。在VHH中，抗原仅被3个环识别而不是6个环，然而VHH中的环与常规mAb相比，缺少3个CDRs区，且环更长。目前已有研究提出通过CDR的延伸扩大VHH互补决定区，尤其是CDR3。VHH中较长的CDR3允许其形成指状结构，呈暴露的凸环，能够延伸到靶蛋白上的空腔中，使VHH能够识别结合独特的抗原表位，而凸环中的半胱氨酸可与CDR1或FR2的45位点的半胱氨酸形成环间二硫键，使得抗体结构更加稳定。VHH较长的CDR将加大抗原结合位点的实际表面，补偿VL结构域提供的抗原结合表面区域的缺失，可以解释VHH在单域形式中的抗原结合能力［9-10］。
纳米抗体相比常规抗体来说有许多独特优势，包括：（1）结构简单，缺乏轻链，仅由单个重链可变区组成；分子量小，是常规抗体的1/10，约为15 ku［11］，穿透性好；性质稳定，在非常严苛的条件（强酸、强碱、高温等）下仍能保持其生物活性，且适于进行基因工程抗体改造进化，具有优异的稳定性；（2）特异性强，亲和力高，FR2结构中存在氨基酸取代，使纳米抗体比常规抗体片段更易溶，CDR3使Nbs能识别常规抗体不能识别的抗原位点或是不易接近的抗原位点，如酶活性位点和隐性病毒表位；（3）制备过程简便，可以在大肠杆菌及酵母菌等生物中高效表达，处于高温和酸碱溶剂中更稳定，明显缩短研发周期、降低生产成本，有效解决抗体规模化制备的难题；（4）组织渗透能力强，能够更快地被正常组织清除，可与半衰期较短的放射性核素结合在体内成像，应用于分子显像及靶向治疗［12-13］。
纳米抗体库根据构建方式不同分为天然纳米抗体库、免疫纳米抗体库、半合成/合成纳米抗体库。
天然纳米抗体文库通常通过对非免疫羊驼外周血淋巴细胞进行mRNA提取，克隆可变区基因库并通过噬菌体展示及其他技术获得纳米抗体。从该类型的纳米文库中分离抗体的质量取决于库容大小及多样性，天然抗体库的多样性取决于最初收集不同个体的淋巴细胞数量，还可以通过混合从不同个体动物收集的血样以确保文库的多样性，从而增加最终文库大小。天然纳米抗体文库无抗原偏好性，可以为任何潜在的抗原鉴定更广泛的结合物，例如可用于毒性抗原、免疫原性较弱抗原以及自身物质的筛选，但由于未经免疫刺激体细胞成熟的过程，所以只有从库容大、多样高的文库中筛选时才能筛选出高特异性和亲和力的抗体［14］。
免疫纳米抗体文库的构建通过免疫羊驼建立免疫抗体库，构建过程与天然库相同。免疫抗体库的制备首先需对动物进行免疫，通过免疫抗原，体内刺激特异性HCAbs在体内进行亲和力成熟。通过克隆外周血淋巴细胞中的可变区基因库，构建库容约107 CFU/mL的抗体库，并通过噬菌体展示或其他技术进行筛选，所抽取的血液样品代表免疫动物血流中存在的淋巴细胞的免疫抗体文库。该方法在很大程度上受到抗原天然抗原性的限制，当抗原具有高致病性（传染病剂）和毒性或为非免疫原性小分子时，通过免疫动物获取抗体是不可行的。此外，在骆驼科动物身上进行实验必须确保没有染病和动物死亡的风险，也没有个体间免疫的自然差异，所以该方法在实施过程中的实际效果受动物个体差异性、血流稳定性、靶标抗原性以及毒性等影响［15］。
库容大小和多样性是影响免疫文库甚至天然文库的抗体筛选效率的关键问题。体内抗体亲和力成熟在较大程度上依赖于体细胞超突变［16］，半合成/合成文库正是模拟这个过程。通过确定抗原特异性的高变序列的CDR，以及保守的框架区（FR），保存纳米抗体的结构完整性。随机化CDR的氨基酸长度和碱基序列，特别是CDR3区，该区域为抗原-抗体的主要结合位点［17］。Yan等［18］基于CABCII10保守的美洲驼单结构域抗体片段（VHH）框架［19］，通过随机化CDR3区引入多样性，构建合成噬菌体展示纳米体文库，成功地筛选出针对PA或NGAL的纳米抗体。Chen等［20］基于单一框架，通过使用精确设计的简并碱基，将多样性限制在4个互补决定区，设计和生成噬菌体展示的合成抗体文库。Moutel等［21］基于稳健的纳米抗体支架hs2dAb，创建了具有高度多样性的非免疫重组纳米抗体库，成功筛选及鉴定出针对高度多样化靶标的高功能性结合物。
纳米抗体技术主要包括噬菌体展示技术、核糖体展示技术以及在此基础上的纳米抗体改造技术等。
噬菌体展示技术（phage display technology）于1985年首次被George P. Smith提出。该技术基于外源肽或蛋白质与噬菌体表面上的外源蛋白融合表达，依赖于待选蛋白质与其基因之间的物理联系。目的基因与丝状噬菌体M13的p3基因的5’末端融合，导致颗粒在其尖端表达［22］。利用抗原抗体特异性结合的特点对噬菌体库中大量抗体基因进行筛选，与杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术可以快速筛选出针对生物体内任何靶蛋白的抗体，且绕开了杂交瘤免疫动物等过程。通过将整个文库与靶抗原一起孵育，可以对多种抗原包括纯化的抗原、裂解物、完整细胞或组织切片等进行筛选，但纯化靶抗原仍是最简单、最有效的方法。洗脱的噬菌体可用于感染大肠杆菌、富集噬菌体，并用之后的轮次筛选［23-24］。ELISA筛选单个克隆以产生抗原特异性抗体，对ELISE阳性克隆进行测序以推析出抗体的氨基酸［25］。
核糖体展示技术（Ribosome Display Technology，RDT）已被证明是一种强大的体外选择和体外分子定向进化方法。核糖体展示最初是由Mat等提出［26］，用于从具有高度多样性的天然文库中选择和进化蛋白质或肽，以结合任何选择的目标靶标用于从折叠蛋白质文库中产生高亲和力结合物。完整的核糖体展示步骤：制备大型DNA文库，体外转录翻译，亲和筛选，体外分子定向进化［27］。首先通过RT-PCR构建scFv基因，使其作为抗体蛋白体外表达模板，然后在体外进行转录和翻译表达，形成核糖体－mRNA－scFv复合物，随后以固相化的抗原分子亲和筛选出高亲和力scFv，不需要克隆和转化文库。因此通过基于PCR的方法在文库中引入随机突变并选择改进的结合物是非常方便的，可以方便地进行真正的定向进化［28］。核糖体展示的抗体库大小上限可达1015拷贝。通过核糖体展示技术，可分离抗小分子半抗原抗体。因此，这项技术可有效获得所需抗体，且不需要动物免疫；能够检测农业和食品工业中的小型半抗原，如杀虫剂、环境污染物或有毒物质。Guerfal等［29］将针对绿色荧光蛋白的骆驼科纳米抗体的免疫文库融合到酿酒酵母凝集素基因（SAGI）的C未端部分，核糖体展示已成功应用于抗体单链Fv片段（ScFv），不仅可以选择特异性而且可以选择稳定性和催化活性。Roth等［30］描述了从免疫的羊驼中构建VHH抗体酵母表面展示文库，以及在基于荧光激活细胞分选（FACS）的筛选过程中完成抗原特异性分子的简便分离。
体外展示方法筛选抗体受限于文库的库容及多样性，从抗体库中筛选得到的抗体通常亲和力较低，此外通过免疫方法获取特异性抗体，或者是展示方法鉴定过的抗体在免疫过程中，免疫原皮下注射的高浓度抗体具有潜在的可变性或难以预测的溶解度和粘度，抗体异常聚集而引发的抗体皮下传送被阻止［31］。体外进行抗体亲和力成熟的方法有错配PCR法（error-prone PCR）、DNA改组法（DNA shuffling）和链置换法（chain shuffling）、分子模拟和计算机辅助抗体进化。其中后者是当前计算机科学与生物学相结合研究的重要体现。通过物理、化学和分子生物学以及计算机辅助设计的手段进行抗体修饰，对现有抗体进行结构改造来改进其特性［32］。这些特性包括结合亲和力和特异性、折叠稳定性、溶解度、药代动力学、效应子功能，以及与双特异性抗体和抗体-药物偶联物的附着相容性。Kurella等［33］使用同源模型引导的抗体人源化，用分子动力学对抗体进行动态模拟，分析预测抗体的三维结构以及动力学特征，计算抗原抗体在结合过程中的能量变化，能量最小化应用于该人源化模型。通过对关键位点的氨基酸的调整，重新引入关键构象残基。该方法不仅消除了空间冲突，还可以恢复与其抗原的结合亲和力相关的功能，从而降低其免疫原性、交叉反应率，甚至提高亲和力与特异性等，可筛选出更加合理的抗体构象，增强抗体属性。改造后的抗体特性更适合在临床和食品安全检测中应用。
纳米抗体技术最初应用于诊断和治疗领域。目前，大多纳米抗体生物技术应用是指蛋白质或其他大分子抗原，而少见报道涉及针对小半抗原（分子量≥1 500 u）使用的纳米抗体。但越来越多研究表明，可以从高亲和力纳米抗体库中筛选出高敏感性纳米抗体。由于纳米抗体识别抗原能力较强，可将其作为检测探针用于检测各种基体的小分子。通过从噬菌体展示抗体库中筛选得到针对有害物质的抗体，用于食品真菌毒素、小分子有毒物质或农药残留等有机小分子化合物的免疫学检测中。
毒素有的在食品中天然存在，有的在适合条件或在加工过程产生，其快速检测方法是保障食品安全的重要措施。Wang等［34］通过噬菌体展示从免疫的羊驼纳米抗体库中分离出了一种对黄曲霉高度反应性的纳米抗体PO8-VHH，并开发了一种基于纳米抗体和多克隆抗体的夹心ELISA，作为早期检测系统，适合快速检测曲霉农产品污染。骆驼科重链抗体的可变域也越来越多地适用于检测各种基质中的小分子。Xu等［35］通过生物淘选从天然羊驼噬菌体展示抗体文库中获得高活性微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，MC-LR）噬菌体纳米抗体。King等［36］为表明VHH可作为预防李斯特菌病的新型疗法的潜力，从天然噬菌体展示文库中鉴定出几个结合InlB的LRR结构域的VHH，VHH在InlB的c-Met相互作用位点结合，从而成为防止细菌入侵的竞争性抑制剂，表明VHH有作为预防李斯特菌病的新型疗法的潜力。He等［37］首次报道了针对肠炎沙门氏菌的纳米抗体，开发的纳米抗体具有高的热稳定性和良好的特异性，并建立一种基于纳米抗体的肠炎链球菌检测方法，进一步证明了基于纳米抗体的试剂在生物分析化学中的实用性。
随着人们对食品安全性关注的不断提高，对食品中农药残留及农产品污染的检测研究也越来越多，食品中农药残留及农产品污染问题主要是粮食、蔬菜、水果中的农药残留超标问题。目前，常见农药主要分为有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类四大类。杀虫剂西维因在农业中被广泛使用，但其残留物对食品安全和人类健康构成威胁。Liu等［38］使用基于VHH的ELISA法测定食品中大麦和玉米中的西维因，能有效改善农药残留检测的灵敏度。苯氧基苯甲酸（3-PBA）是许多拟除虫菊酯类杀虫剂的人类尿代谢产物，可以用作生物标志物。Zhang 等［39］检测蔬菜和水果样品中的呋喃丹时，通过从双峰驼免疫文库中分离出特异性识别呋喃丹的纳米抗体；采用间接竞争性ELISA方法，筛选出的纳米抗体具有良好的热稳定性以及对甲醇和乙腈的高耐受性。Huo等［40］建立了一种基于纳米抗体-碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）融合蛋白的快速灵敏的直接竞争荧光酶免疫分析法（Direct competition-luciferase immunoassay,dc-FEIA），用于检测3-PBA，对硫磷是一种广泛使用的具有高毒性和持久性的有机磷农药。Zhang等［41］基于免疫的羊驼构建了噬菌体VHH文库，并通过与3-PBA竞争结合筛选纳米抗体，构建了VHH-AP融合物与dc-FEIA，通过对大白菜、黄瓜和生菜样品进行验证，进一步证明了基于纳米抗体在检测食品中农药残留及农产品污染中的可实践性，表明基于纳米抗体的免疫分析方法简便，快速且具有成本效益，因此是检测呋喃丹的理想筛选工具。
病毒感染容易引起流行性传染病，一旦感染流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒疾病会严重危害人类的健康和生命，Nbs具有作为抗病毒治疗剂的优势［42-43］。Zhao等［44］成功筛选出专门针对MERS-CoV刺突蛋白的受体结合域。通过在体内对C末端人Fc标签进行改造Nbs的半衰期显著延长，Nbs可以有效地交叉中和从人和骆驼中分离出来的多种MERS-CoV株的感染。说明Nbs可以作为成本低、有效且广谱的抗MERSCoV治疗剂。Stalin等［45］指出Nbs不仅可以针对MERS-CoV，而且可以针对其他新兴病原体开发新的干预措施。De等［46］开发了一种新型的抗甲型流感病毒方法，该方法可选择性地将先天免疫细胞募集到病毒部位复制。针对暴露于表面的病毒抗原的VHH可以很容易地配备效应器功能，这些功能可以触发保护性抗病毒活性，而不是直接中和病毒。
在肿瘤成像方面，纳米抗体与光学成像、PET、超声成像及SPECT技术结合用于临床疾病快速检测诊断，由于纳米抗体的分子量小，没有Fc片段，可以高特异性地结合到靶标，且可在体内快速消除，使纳米抗体在成像方面具有很强优势。
纳米抗体在食品安全检测方面还需要进一步深入研究及应用，它虽克服了小分子功能性抗体的缺点，但仍有不足之处，如亲和力低、稳定性差等。体外改善纳米抗体性能的方法：（1）确保半抗原-蛋白结合物的免疫原性，提高库容量及多样性，通过体外筛选，优化的筛选策略，进行抗体亲和力成熟，提高抗体的表达量和表达效率［48］。（2）优化几个关键属性：亲和力、特异性、折叠稳定性、溶解度以及与双特异性纳米抗体和纳米抗体-药物偶联物的彼此间相容性，主要通过设计支架、互补决定区（CDR）、改变特定的氨基酸等。而单一属性进行抗体改造时，可能会引起别的关键属性发生质的变化，从而使抗体改造效果不佳。所以，在进行抗体设计时需要进行系统的设计方法。随着纳米抗体改造技术不断完善，纳米抗体特有的优势也必将在食品安全检测技术上发挥重要作用。
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Nanobody Technology and Its Application in Food Safety Detection