【研究意义】桉树（Eucalyptus）是原产澳大利亚的桃金娘科桉属植物的总称［1-2］，20世纪80年代引种至我国后，已选育出巨尾桉、邓恩桉、大花序桉等速生、耐寒、大径材优良品种，是我国目前南方的主要速生用材林造林树种［3-5］。广西桉树种植面积居全国首位，其木材被广泛用于制浆造纸、人造板和纤维板等，特别是在造纸木浆生产中有着极重要地位［6-8］。【前人研究进展】在传统选育优良纸浆材品种的基础上，针对木质素合成途径中的关键基因，利用基因工程手段调控基因表达，进而改良木材品质是研究的热点［9-10］。CAD是木质素合成途径中最早被研究的酶类之一，催化木质素单体合成最后一步反应，被认为是木质素形成的标志，更是木质素合成过程中的关键酶和调控节点［11］。目前，已从多种植物中克隆了CAD基因，并利用正、反义抑制和过表达等多种方法在体外对其功能进行了研究［12-14］。在玉米bml突变株中，CAD活性下降60%～70%，木质素含量降低近80%，G木质素和S木质素含量也均有下降［15］。在亚麻中抑制CAD活性，木质素下降约40%，改变了细胞壁的结构，果胶和半纤维素含量降低，但纤维素水平没有发生变化［16］。【本研究切入点】尾叶桉GLU4无性系（Eucalyptus urophylla clone GLU4）是广西广泛种植的桉树良种，其木材纤维特性适宜制浆，是纸浆材首选树种。2014年起，广西林业科学研究院率先在尾叶桉良种GLU4的基础上开展了木质素合成调控的转基因技术研究，前期研究取得进展，在一系列木质素合成途径基因中，已锁定应用尾叶桉肉桂酰乙醇脱氢酶（Cinnamoyl alcohol dehydrogenase，CAD）转化烟草可抑制木质素合成［17-18］。上述对EuCAD基因研究中是使用基因全长序列构建RNA干扰载体，序列片段较长，载体构建和应用都不够便捷，且容易引发脱靶效应等风险。同时RNAi技术的优势之一，就是利用较短的干扰片段进行转录后调控，选取基因中的关键片段用于RNAi更为适宜。【拟解决的关键问题】本研究采用生物信息学工具对EuCAD基因进行序列分析，根据编码蛋白保守结构域的分布情况，选择EuCAD基因的部分序列构建小片段的RNA干扰抑制表达载体并转化植物，分析干扰片段对烟草CAD基因表达和木质素合成的调控效果，为桉树转基因研究提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
烟草无菌组培苗、DH5a菌株、农杆菌LBA4404菌株为广西优良用材林资源培育重点实验室保存。
ExTaq聚合酶、RNA LA PCR反转录试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购于普洛麦格生物技术有限公司；SG Fast qPCR Master Mix（2×）购自上海生工生物公司；RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、高效植物基因组提取试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、Universal DNA 纯化回收试剂盒、离心柱型普通质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司；琼脂糖、抗生素等常规试剂购于当地生化试剂公司。引物、序列合成及测序由上海生工生物公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 RNAi载体构建 利用Blastp、ProtParam、psipred、SWISS-MODEL等生物信息学软件对EuCAD基因序列进行分析，根据保守结构域的分布情况，选择一段同时涵盖NAD（P）结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点的序列用于构建RNAi载体。根据选定的序列，利用Vector NTI软件分析筛选出44 bp的片段，序列为5'-gaatttg ccacagtgacattcaccagatcaagaatgatcttggcgc-3'。利用上述片段以“尾尾相连”的方式设计成反向重复序列，并在两端附加XhoI酶切位点后，由上海生工生物公司合成序列，得到携带目标片段的克隆载体pUC57-RNAi。
利用XhoI酶消化pUC57-RNAi，通过凝胶电泳回收得到目标序列，同时利用XhoI酶消化pCAMBIA3301载体，同样经过凝胶电泳回收后，得到去除掉bar基因序列的载体骨架。将载体骨架与回收的目标序列连接，连接产物转化DH5a，应用载体上的测序引物3301-F（5'-CCCTTATCTGGGAACTACTCAC-3'）、3301-R（5'-CGCTGAAATCACCAGTCTCTC-3'）对转化子进行PCR鉴定，对可扩增得到目标长度片段的克隆进行测序。将测序结果与目标序列比对，序列一致的为构建成功的RNAi载体。RNAi载体构建成功后，常规方法导入农杆菌LBA4404中用于转化。
1.2.2 烟草转化植株培育 利用携带RNAi载体的农杆菌采用常规方法转化烟草，经过愈伤组织培养、芽再生培养阶段的抗生素筛选获得阳性再生芽。随机挑选阳性再生芽，对其进行编号并转入生根培养，每个芽编号为一个株系，获得的再生植株移栽后置于温室内培养。保留每个株系的组培继代芽，以备后续扩繁培养该株系转基因植株之用。
移栽培养60 d后，取叶片提取基因组总DNA。应用载体上的测序引物3301-F/3301-R，对转基因植株进行PCR鉴定，同时对长度相符的PCR扩增产物测序以验证插入的RNAi序列准确性。
从测序鉴定结果正确的转基因株系中随机挑选3个株系按照编号追溯其继代芽，经扩繁后培育转基因植株用于表型检测。
1.2.3 转基因烟草植株叶片CAD基因表达水平检测 利用Vector NTI软件针对内参基因烟草actin基因设计荧光定量引物actin-F（5'-CTG GAATCCATGAGACTACTTACAA-3'）、actin-R（5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3'）。 针 对目标基因烟草CAD（X62343.1）基因设计引物CAD-F（5'-GTATGGCACCAGAACAAGCAG-3'）、CAD-R（5'-CCAATGCCTCTTGTCTCTTCTTAT-3'）。
转基因烟草植株移栽培养240 d后，自茎尖向下第3节处取叶片，按试剂盒说明书提取RNA并反转录合成cDNA，用上述引物对CAD基因表达水平进行检测，每个株系选择3株用于试验。依据基因表达水平检测结果，对调控效果最明显的株系进行下一步的表型检测。
1.2.4 茎部木质部厚度分析 参试株系取3株温室培育270 d的烟草茎部顶端向下第4节和第6节处茎部组织，按常规方法制成石蜡切片并用番红-固绿法染色［19］。制好的切片用Nikon研究用光学显微镜进行观察，NIS-Elements软件拍照并测量茎部直径。测量时每个样品选取1张切片，在茎部截面的各个方向分别采集茎部直径数据和木质部厚度数据60个。
1.2.5 纤维素木质素含量测定 取温室培育270 d的烟草植株选择自顶端向下第3～10节茎部，去除叶片后65℃烘干24 h，粉碎后过0.425 mm筛，用于木质素和纤维素含量检测。木质素含量采用酸性洗涤方法测定，参照GB/T20808-2006执行。纤维素含量采用硝酸法测定［20］。参试株系取3株植株作为3个重复。
试验数据采用SPSS 19.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 RNAi载体构建
pCAMBIA3301载体上的测序引物3301-F/3301-R分别位于XhoI酶切位点旁侧约50 bp处，XhoI酶切位点之间的bar基因序列在构建过程中被替换为目标序列，PCR产物长度从650 bp左右缩短至约200 bp。对转化菌落PCR鉴定结果（图1）显示，检测得到扩增出目标特异性条带的阳性克隆。对阳性克隆提取质粒测序后，结果显示插入序列与预期序列一致，RNAi载体构建成功，命名为pCAMBIA3301-RNAi。
图1 RNAi载体构建的转化菌落PCR验证
Fig. 1 PCR validation of the transformed colony constructed by RNAi vector
M：RealBand DNA Marker（100～1 500 bp）；1～3：pCAMBIA3301-RNAi转化菌落PCR扩增产物，其中1、3为阳性克隆
M: RealBand DNA Marker（100-1 500 bp）; 1-3: PCR amplification products of colony transformed by the vector pCAMBIA3301-RNAi,1 and 3 were the positive clones
2.2 烟草转化植株培育
将重组载体pCAMBIA3301-RNAi采用农杆菌介导方法转化烟草，获得转基因烟草植株，取叶片提取基因组总DNA用测序引物3301-F/3301-R进行PCR鉴定。基因组上插入RNAi载体的转基因植株中可以检测到长度200 bp的特异性片段，而未整合RNAi载体的植株中则扩增不到目标条带。PCR鉴定结果显示获得了阳性植株（图2）。对阳性植株进一步进行PCR扩增产物测序，测序结果显示序列与目标RNAi序列一致的鉴定为转基因植株。试验共获得28个转基因株系，从中随机挑选3个命名为R1、R2、R3，用于表型检测。
图2 烟草转化苗PCR验证
Fig. 2 PCR validation of transgenic tobacco seedling
M：RealBand DNA Marker（100～1 500 bp）；1～3：pCAMBIA3301-RNAi载体转基因植株PCR鉴定结果，其中1、3为阳性植株
M：RealBand DNA Marker（100-1 500 bp）; 1-3: PCR identification results of transgenic plants containing pCAMBIA3301-RNAi vector,1 and 3 were positive plants
2.3 转基因植株CAD基因表达水平检测
在GenBank上检索到烟草完整CAD基因（X62343.1），将其与RNAi片段所用的44 bp序列比对，两序列一致性达到66.7%，序列同源较高，推测其RNAi片段很可能对目标基因引发较强的抑制作用。
对获得的转基因烟草植株中CAD基因表达水平进行检测，结果显示3个转基因株系中CAD基因表达水平都较野生型呈现显著下降（图3），说明转入的RNAi片段如预期的引发了RNAi，抑制了CAD基因的表达。其中R2、R3株系中CAD基因表达分别较野生型降低67.93%和76.30%，R1株系中降幅最大、降低至野生型的12.51%，说明该株系中调控效果最为理想，进一步对其茎部结构和木质素含量等表型进行检测。
图3 转基因烟草中基因表达水平分析
Fig. 3 Analysis of gene expression level in transgenic tobacco
柱上小写英文字母不同者表示差异显著
Different lowercase letters on the bar represent significant differences
2.4 转基因植株茎部解剖结构分析
转基因植株生长状况与野生型无异，植株叶片伸展，茎干挺直，培养270 d后苗高达到1.6 m左右，能正常开花结实。为研究转入的RNAi片段是否影响烟草茎部结构的形成，选取转基因植株茎部第4节和第6节横切，制成石蜡切片并染色。从表1可知第4节和第6节处茎部直径，转基因株系和野生型之间无显著差异，说明转基因植株茎部的生长发育未受到显著影响。对第4节和第6节处茎部的木质部厚度测量结果显示，在第4节处转基因植株木质部厚度较野生型显著降低11.75%，在第6节处降幅缩小至10.06%。
表1 转化植株茎部直径、木质部厚度变化
Table 1 Changes in stem diameter and xylem thickness of transformed plants
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
木质部厚度Xylem thickness（µm） 茎部直径Stem diameter（µm）第4节The 4th node植株编号Plant number 第6节The 6th node第4节The 4th node第6节The 6th node WT 320.91±14.10a 427.53±20.03a 6634.29±249.95a 8576.63±422.21a R1 283.21±10.80b 384.53±15.55b 6247.00±718.03a 8357.81±307.51a
2.5 纤维素木质素含量测定
对转基因植株茎部组织中木质素含量和纤维素含量进行检测，结果（表2）显示，转基因植株中木质素含量与木质部厚度变化趋势相一致，较野生型显著降低15.26%，说明转入的RNAi片段起到了定向调控木质素合成的调控效果。但转基因植株中纤维素含量并未如预期中呈现补偿性的增加，反而较野生型显著降低10.61%。
表2 转基因烟草中木质素、纤维素含量
Table 2 Lignin and cellulose contents in transgenic tobacco
注：同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著。
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant differences.
纤维素含量Cellulose content（%）WT 13.37±0.04 a 35.16±0.03 a R1 11.33±0.03 b 31.43±0.01 b植株编号Plant number木质素含量Lignin content（%）
3 讨论
在对目标基因序列不甚了解时，进行RNAi通常使用基因全长序列构建RNAi载体，这种常规的研究策略在许多植物中取得了较好的研究结果，但也有研究者提出，干扰片段过长，自身复制过程中碱基错配几率更高，同时较长的序列更容易与其他非目标基因序列匹配，脱靶风险更高［21］。若想选择目标基因的部分小片段用于RNAi，所选择片段的位置至关重要。Holen等［22］针对目标基因的不同位置设计4条RNAi片段用于研究，结果发现了一种可能的位置效应；张斌等［23］对OsPUT1基因的RNA干扰研究也提出类似的位置效应。由此可推断，针对目标基因选择RNA干扰片段时，片段在基因CDS中的位置应当谨慎选择。
鉴于CAD蛋白在木质素合成中的重要功能，在许多植物中都对其进行了基因克隆和功能研究［24-26］，到目前为止NCBI已收录2 428条陆生植物CAD蛋白序列。不同植物中的CAD具有高度的同源性，对CAD蛋白序列比对分析发现，几乎所有CAD都具有两类典型的保守的结构域：第一类是辅酶和底物结合结构域，包括NAD（P）结合位点、底物结合位点；第二类是酶活性中心结构域，包括Zn结合催化位点和Zn结合结构位点［27］。本研究所选序列从其编码蛋白的结构域来看，该段序列编码蛋白兼具辅酶、底物结合结构域和酶催化结构域，对CAD酶的催化活性影响较大。从基因序列位置分析，所选片段近于转录翻译的起始端，倘若RNA干扰在此处发生，CAD酶几乎无法转录或翻译，对酶活性的抑制也将更为明显。在将RNAi片段转化烟草后，发现片段对木质素的调控效果较为理想，从基因表达水平到木质素含量和木质部厚度均较野生型显著降低，试验结果与预期相一致，说明所选序列为比较理想的RNAi片段。
研究中还发现，植物茎部结构特点是从上到下木质化程度逐渐提高，而在转基因植株中，随着木质化程度的提高，茎部木质部厚度较野生型的降幅却有所降低，通过抑制CAD基因表达调控木质素合成的效果却逐渐弱化。推测造成这种变化的原因可能在于CAD对木质素合成的调控主要发生在木质化初期，在木质化中后期，这种调控效果被其他代谢通路中的基因应答作用而掩盖。同时，通过数据分析发现，转基因植株中木质部厚度的降幅均在10%左右，降幅较低，较小的降幅可能在木质化过程中被逐渐积累的木质部厚度稀释，造成降幅差异逐渐不显著。对此在后续研究中可尝试使用底物标记等手段，分阶段解读木质化过程，有望深入揭示抑制CAD基因调控木质素合成的生理生化机制。
4 结论
本研究选择了一段同时包含NAD（P）结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点的CAD基因片段用于构建RNAi载体。结果表明，在将RNAi片段转化烟草后，转基因植株茎部直径与生长发育与野生型无异，植株中CAD基因表达水平显著降低，植株茎部木质素含量与木质部厚度均较野生型降低10%以上。本研究结果可为下一步桉树木质素合成调控研究提供技术参考。
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