【研究意义】啮齿动物是哺乳动物中种类最多、分布最广、数量最大的类群，其中一些种类对农业生产、人类健康及公共安全造成巨大危害［1-3］。为控制害鼠，通常采用以生态调控为基础的综合治理技术，其中化学防治是极其重要的防控措施。而抗凝血类杀鼠剂是一类慢性化学药剂，相对比较安全、适口性好、灭鼠效率高，自20世纪80年代，在我国农牧区和城市广泛使用［4-6］，是当前最主要的杀鼠剂。但是连续使用超过6年的地区陆续报道了鼠类抗药性的产生，抗药性、交互抗性和抗性种群的出现，大大降低了灭鼠效果，增加了灭鼠难度和成本［7-9］。而新药创制难度大，且必须同时满足“高效、安全、经济”的特点［10-11］。如何延缓鼠类抗药性、提高杀鼠剂的利用率、降低杀鼠剂的生态风险成为亟待解决的问题。【前人研究进展】已有研究发现一些药物等能增强抗凝血剂的作用［12-15］，冯志勇等［14］将增效剂S和增效剂A按照一定比例分别配制成增效灭鼠剂Ⅰ和增效灭鼠剂Ⅱ用于灭鼠试验，结果表明，复配增效灭鼠剂显著降低抗凝血灭鼠剂的用量，适口性好、安全性高，不仅对室内试验的小白鼠和小家鼠控制效果好，而且对农田的鼠类灭效也较高。王俊超等［15］研究发现添加了双氯芬酸钠、丙三醇等辅料配制的溴敌隆液剂和粉剂能有效毒杀大白鼠、小白鼠、褐家鼠、大仓鼠和布氏田鼠，适口性良好，既降低了溴敌隆的浓度，又保证了灭效。而在我国南方地区，气候潮湿多雨，稻谷具有适口性好、保鲜期长和来源广泛的优点，是农区灭鼠的最适诱饵。但是抗凝血杀鼠剂难溶于水，稻壳对抗凝血杀鼠剂进入米粒具有阻滞作用。张美文等［16］通过生物测定及光谱分析表明，谷壳对敌鼠钠盐进入米粒中具有50%左右的阻滞率。鼠类只取食稻谷中的米粒，药物主要粘附在稻谷表层，残留在田间、户外的毒谷和毒壳易造成环境污染及非靶标动物中毒的风险［17-19］。【本研究切入点】针对稻谷毒饵利用率低、生态风险大的问题，以溴敌隆杀鼠剂的溶解性及稻谷毒饵的特性为切入点，研究农药助剂如渗透剂对抗凝血杀鼠剂的渗透作用和增效作用，揭示抗凝血剂的增效机制。【拟解决的关键问题】本研究拟通过筛选助剂增加抗凝血类杀鼠剂的渗透能力，提高稻谷毒饵的利用率，室内生测试验验证助剂对抗凝血类杀鼠剂控制小白鼠的增效作用，为科学精准治理鼠害提供理论基础和技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
主要试剂：大卫溴敌隆母液（有效成分含量0.5%，商丘市大卫化工厂），溴敌隆标准品（美国AccuStandard公司），色谱纯甲醇（美国Fisher公司），乙酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），二甲基亚砜（天津市富宇精细化工有限公司），N, N-二甲基甲酰胺（天津市富宇精细化工有限公司）。
主要仪器：Dionex ultimate 3000高效液相色谱工作站，配荧光检测器（Dionex，美国），HY-5回旋式振荡器（常州澳华仪器有限公司），KQ2200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
试验动物：昆明小白鼠，雌雄各半，共154只，于2019年12月购自广州市黄埔区长胜养殖场。
1.2 试验方法
试验于2019年12月至2020年4月在广东省农业科学院植物保护研究所大丰试验基地进行。
1.2.1 常规稻谷毒饵及添加助剂后的稻谷毒饵配制方法 0.01%溴敌隆稻谷毒饵：有效成分含量0.5%的溴敌隆母液50 mL兑水200 mL，充分搅拌倒入2.5 kg稻谷中，混匀，待药液被吸干后，晒干。
0.0025%溴敌隆稻谷毒饵：有效成分含量0.5%的溴敌隆母液5 mL兑水80 mL，充分搅拌倒入1.0 kg稻谷中，混匀，待药液被吸干后，晒干。
添加1%、2%、4%、8%、24%N,N-二甲基甲酰胺的0.01%溴敌隆稻谷毒饵：准确称量5、10、20、40、120 mL二甲基甲酰胺，再分别与35、30、20、0、0 mL水混合，再加入10 mL有效成分含量0.5%的溴敌隆母液，混匀后与500 g稻谷搅拌，混合均匀，待药液吸干后晒干，配制成浓度为1%、2%、4%、8%、24%的N,N-二甲基甲酰胺0.01%溴敌隆稻谷毒饵。不同浓度二甲基亚砜的0.01%溴敌隆稻谷毒饵的配制方法与N,N-二甲基甲酰胺相同。
添加4%N,N-二甲基甲酰胺的0.0025%溴敌隆稻谷毒饵：准确称取40 mL N,N-二甲基甲酰胺与40 mL水混合均匀，再加入5 mL有效成分含量0.5%的溴敌隆母液，混匀后与1.0 kg稻谷搅拌，再次混匀，待药液吸干后晒干，配制成浓度为添加4%N,N-二甲基甲酰胺的0.0025%溴敌隆稻谷毒饵。添加4%二甲基亚砜的0.0025%溴敌隆稻谷毒饵的配制方法与该浓度N,N-二甲基甲酰胺相同。
1.2.2 溴敌隆稻谷毒饵样品前处理 将溴敌隆普通毒谷稻壳与糙米手工分离，分别用粉碎机研磨，过0.250 mm筛。准确称取1 g壳粉及4 g米粉，置于100 mL具塞离心管中，加入甲醇40 mL，加塞后振荡15 min，超声提取15 min，3 000 r/min离心5 min。预先以5 mL甲醇活化中性氧化铝柱（AL5006-N，Alumina N SPE，500 mg/6mL），弃流出液，分别取壳粉上清液4 mL，米粉上清液5 mL上样，用10 mL甲醇-乙酸（95:5）溶液洗脱，收集洗脱液，在60℃下用氮气吹干，再用1 mL甲醇溶解残渣，过有机滤头（0.2 μm，13 mm），供高效液相色谱仪测定。添加助剂的毒谷中溴敌隆样品前处理方法与普通毒谷相同。
1.2.3 添加助剂的毒谷对小白鼠的毒杀作用 选择成年、健康、非孕、无外伤的个体，雌性36只，雄性38只，称量体重，采用无选择定量摄食试验，单笼饲养。先用稻谷饲养2 d，然后按体重15%提供毒谷连续饲喂小白鼠，每天称毒谷的消耗量，更换新饵。3 d后，清除毒谷，改用饲料正常饲养，观察14 d，记录小白鼠死亡时间，计算死亡率。
1.2.4 添加助剂的毒谷对小白鼠的适口性试验 选择成年、健康、非孕、无外伤的个体，雌性41只，雄性39只，称量体重，采用有选择摄食试验，单笼饲养。先用稻谷饲养2 d，然后分别将5 g稻谷和5 g溴敌隆毒谷对角线放入饲养笼内，让小白鼠自由选择取食，每天称稻谷和毒谷的消耗量，更换新饵并交换位置。连续选择摄食3 d后，清除毒谷，改用饲料正常饲养，观察14 d，记录小白鼠死亡时间，计算摄食系数。
1.3 测定指标及方法
（1）毒饵中溴敌隆含量测定方法：采用高效液相色谱法，色谱柱C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温：30℃；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL；检测器：荧光检测器，激发波长310 nm，发射波长390 nm；流动相A：水+0.25%乙酸；流动相B：甲醇+ 0.25%乙酸，梯度洗脱：0～5 min，B保持25%，5～20 min，B升高至95%，20～25 min，B由95%升至100%。
（2）添加助剂后毒饵生物测定指标：毒杀试验中测定毒饵每天的消耗量，计算致死时间及死亡率；适口性试验中测定无毒饵和毒饵每天的消耗量，计算致死时间及死亡率。
试验数据采用Excel 2010、SPSS 16.0进行处理和分析，采用LSD最小显著性差异法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 两种助剂配制的毒谷糙米中溴敌隆含量
添加不同浓度N,N-二甲基甲酰胺配制的0.01%毒谷与对照（0.01%毒谷）糙米中溴敌隆含量之间有显著差异（F＝455.064，df＝5，P≤0.001）。添加8%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.01%毒谷糙米中溴敌隆含量最高，但与添加4%N,N-二甲基甲酰胺的无显著差异，添加助剂后糙米中溴敌隆含量均显著高于对照糙米中的含量（表1）。
添加不同浓度二甲基亚砜配制的0.01%毒谷与对照（0.01%毒谷）糙米中溴敌隆含量之间有显著差异（F＝76.887，df＝5，P≤0.001）。添加4%二甲基亚砜配制的0.01%毒谷糙米中溴敌隆含量最高，显著高于其他处理。除添加1%二甲基亚砜配制的毒谷糙米中溴敌隆含量与对照无显著差异外，其他浓度二甲基亚砜配制的毒谷糙米中溴敌隆含量均显著高于对照（表1）。
表1 添加不同浓度N, N-二甲基甲酰胺及二甲基亚砜配制的0.01%毒谷糙米中溴敌隆含量
Table 1 Content of bromadiolone in the brown rice of 0.01% poison grins prepared by different concentrations of N, N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide
溴敌隆含量Content of bromadiolone（μg/g）N, N-二甲基甲酰胺N, N-dimethylformamide助剂Adjuvant浓度Concentration（%）10.17 ± 0.13 2 19.79 ± 0.26 4 24.72 ± 0.51 8 25.59 ± 0.48 24 12.20 ± 0.12二甲基亚砜Dimethyl sulfoxide 1 7.17 ± 0.16 2 10.48 ± 0.64 4 17.55 ± 0.61 8 12.83 ± 0.36 24 10.72 ± 0.26对照CK 6.66 ± 0.49 1
表2展示了常规毒谷（0.01%）、低浓度毒谷（0.0025%）及添加两种助剂配制的低浓度毒谷中溴敌隆的分布。常规毒谷中壳含药量为88.37 μg/g，占总药量的92.99%，糙米含药量为6.66 μg/g，占总药量的7.01%。低浓度毒谷中稻壳含药量为21.74 μg/g，占总药量的95.39%，糙米含药量为1.05 μg/g，占总药量的4.61%。4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%毒谷中稻壳含药量为18.11 μg/g，占总药量的76.38%，糙米含药量为5.60 μg/g，占总药量的23.62%。4%二甲基亚砜配制的0.0025%毒谷中稻壳含药量为17.99 μg/g，占总药量的77.39%，糙米含药量为5.26 μg/g，占总药量的22.61%。经4%N,N-二甲基甲酰胺及4%二甲基亚砜处理后，0.01%溴敌隆毒谷糙米中药物含量均显著提高，比常规的0.01%溴敌隆毒谷分别增加271.17%和163.51%。与低浓度毒谷相比，添加两种助剂配制的低浓度毒谷中糙米的含药量显著提高（4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敌隆毒谷，t＝-10.110，df＝2.038，P＝0.009；4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷，t＝-7.722，df＝4，P＝0.002），分别增加433.33%和400.95%。添加两种助剂配制的低浓度毒谷之间糙米中含药量没有显著差异（t＝0.488，df＝4，P＝0.651）。
2.2 两种助剂配制的毒谷对小白鼠的毒杀作用
如表3所示，添加两种助剂的低浓度毒谷对小白鼠的毒杀效果显著高于未加助剂的低浓度毒谷（4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敌隆 毒 谷，X2＝19.259，df＝1，P＝0.000；4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷，X2＝15.824，df＝1，P≤0.001），与未加助剂的高浓度毒谷（0.01%溴敌隆毒谷）作用效果相当。平均致死时间，4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷显著长于0.01%溴敌隆毒谷（F＝12.818，df＝3，P≤0.001），其他处理之间没有显著差异，组内雌雄个体没有显著差异。由此可见，添加助剂的毒谷具有明显的毒杀作用和增效作用。
2.3 两种助剂配制的毒谷对小白鼠的适口性
适口性试验结果见表4，两种助剂的毒谷摄食系数表现不同，添加4%二甲基甲酰胺的0.0025%毒谷摄食系数与两种未添加助剂的对照没有差异（与0.01%毒谷相比：t＝-0.474，df＝38，P＝0.639；与0.0025%毒谷相比：t＝-1.699，df＝25.899，P＝0.101），而添加4%二甲基亚砜的0.0025%毒谷摄食系数显著低于两种未添加助剂的对照（与0.01%毒谷相比：t＝6.301，df＝20.599，P≤0.001；与0.0025%毒谷相比：t＝7.132，df＝23.624，P≤0.001）。总体而言，摄食系数均超过0.3的适口性标准，适口性良好，且雌雄之间差异不大。毒杀率结果与毒杀作用试验结果一致，添加助剂的毒谷毒杀率显著高于同样浓度未添加助剂的毒谷（4%N,U-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敌隆毒谷，X2＝32.727，df＝1，P≤0.001；4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷，X2 ＝ 25.6，df＝1，P≤0.001），与高浓度未添加助剂的毒谷效果相当。平均致死时间，两种助剂配制的0.0025%溴敌隆毒谷与0.01%溴敌隆毒谷之间无显著差异。
表2 0.01%毒谷及4%两种助剂配制的0.0025%毒谷中溴敌隆含量
Table 2 Content of bromadiolone in 0.01% poison grains and 0.0025% poison grains prepared by 4% two adjuvants
毒谷米中溴敌隆含量Content of bromadiolone in the brown rice of poison grains（μg/g）0.01%溴敌隆毒谷0.01% bromodiolone poison grains处理Treatment毒谷壳中溴敌隆含量Content of bromadiolone in the rice hull of poison grains（μg/g）88.37 ± 2.36 6.66 ± 0.49 0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains 4%二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains prepared by 4% dimethylformamide 21.74 ± 0.72 1.05 ± 0.04 18.11 ± 0.31 5.60 ± 0.45 4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains prepared by 4% dimethyl sulfoxide 17.99 ± 0.42 5.26 ± 0.54
表3 两种助剂配制的溴敌隆毒谷的毒杀效果
Table 3 Toxic effect of the bromodiolone poison grains with two adjuvants
致死时间Lethal time（d）0.01%溴敌隆毒谷0.01% bromodiolone poison grains处理Treatment性别Sex平均体重Average weight（g）试鼠数量Number of tested mice毒杀率Poison rate（%）22.75±2.03 6 100 6.67±0.76♂27.31±1.16 8 100 6.88±0.81♀+♂ 25.36±1.22 14 100 6.79±0.55 0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains♀29.73±1.39 10 30 7.67±0.33♂31.87±0.63 10 40 7.75±0.48♀+♂ 30.80±0.78 20 35 7.71±0.22♀4%二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains prepared by 4% dimethylformamide♀31.78±1.58 10 100 6.90±0.18♂33.77±0.60 10 100 6.90±0.28♀+♂ 32.78±0.85 20 100 6.90±0.16 4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains prepared by 4% dimethyl sulfoxide♀37.81±1.16 10 90 9.44±0.47♂39.76±1.01 10 100 9.10±0.46♀+♂ 38.79±0.78 20 95 9.26±0.32
表4 两种助剂配制的溴敌隆毒谷适口性试验结果
Table 4 Test result of palatability of the bromodiolone poison grains with two adjuvants
处理Treatment性别Sex平均体重Average weight（g）试鼠数量Number of tested mice日均摄入量Daily intake（g） 摄食系数Feeding coefficient无毒饵Normal bait毒饵Poison bait毒杀率Poison rate（%）致死时间Lethal time（d）0.01%溴敌隆毒谷0.01% bromodiolone poison grains♀ 23.95 ± 1.70 11 1.05 ± 0.13 3.09 ±0.10 2.9 100 7.36 ± 0.56♂ 24.67 ± 2.09 9 1.45 ± 0.20 2.64 ± 0.26 1.82 89 6.38 ± 0.32♀+♂24.28 ± 1.29 20 1.23 ± 0.12 2.88 ± 0.14 2.34 95 6.95 ± 0.36 0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains 4%二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains prepared by 4% dimethylformamide♀ 26.04 ± 0.37 10 0.73 ± 0.13 2.44 ± 0.21 3.34 20 9.00 ± 0.00♂ 27.40 ± 0.60 10 1.18 ± 0.30 2.05 ± 0.31 1.74 0♀+♂26.72 ± 0.38 20 0.96 ± 0.17 2.25 ± 0.19 2.34 10 9.00 ± 0.00♀ 31.28 ± 0.83 10 1.16 ± 0.11 2.87 ± 0.12 2.78 100 7.30 ± 0.34♂ 30.91 ± 0.96 10 1.18 ± 0.12 2.70 ± 0.14 2.59 100 7.40 ± 0.16♀+♂31.10 ± 0.62 20 1.17 ± 0.08 2.79 ± 0.09 2.69 100 7.35 ± 0.18 4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷0.0025% bromodiolone poison grains prepared by 4% dimethyl sulfoxide♀ 32.72 ± 1.70 10 2.80 ± 0.18 1.97 ± 0.15 0.70 80 8.13 ± 0.48♂ 45.85 ± 1.58 10 2.61 ± 0.15 2.34 ± 0.15 0.90 100 8.20 ± 0.47♀+♂39.29 ± 1.88 20 2.70 ± 0.12 2.16 ± 0.11 0.80 90 8.17 ± 0.33
3 讨论
杀鼠剂与其他化学农药不同，必须依赖靶标鼠类取食才能发挥作用，因而毒饵取食效率是关键。稻谷是适合南方灭鼠采用的毒饵，鼠类剥壳食米，米中的含量对于药效起到至关重要的作用，而以往的研究没有针对稻谷毒饵中溴敌隆含量分布展开研究。相关研究报道发现，敌鼠纳盐在沸水中具有一定的溶解度，通过浸泡法配制稻谷毒饵，经测定米中含有敌鼠钠盐含量达到43%，接近一半［16］。本研究结果表明，0.01%溴敌隆毒谷中90%以上的药量粘附稻壳上，仅7%的含量存在米中，溴敌隆难溶于水，稻壳的阻滞作用导致药物难以到达米粒中，因此，溴敌隆毒谷的利用率有待提高。
阿斯匹林［20-21］、水杨酸钠［12］、双氯苯酸钠［15］等抗凝血杀鼠剂的增效剂，其增效机制是通过加速动物体内血液循环，加快中毒鼠出血速度，从而达到协同抗凝血的作用。不同于前人对于杀鼠剂增效剂的研究，本研究的目的是针对溴敌隆毒谷糙米中含量偏低这一问题，通过筛选助剂及其适宜的浓度，增加溴敌隆的溶解性和渗透性，提高米粒中的含药量，从而减低杀鼠剂用量，提高杀鼠剂的利用率。本研究采用的两种助剂，二甲基亚砜、N,U-二甲基甲酰胺均为用途很广的优良溶剂，能与水及大部分有机溶剂互溶。通过高效液相色谱荧光检测，发现4%浓度的两种助剂渗入米中的溴敌隆含量更高，推断低浓度的助剂可能渗透力不足，而更高浓度的助剂渗透力已经达到饱和，也可能与其他因素有关。
从实验室内生物测定结果可见，添加两种助剂对低浓度的溴敌隆毒谷增效明显，与常规0.01%浓度相比，添加4%助剂的0.0025%溴敌隆毒谷无论毒杀效果及适口性方面都表现良好，验证了两种助剂的渗透能力及增效作用，达到了预期目的。另外，4%助剂用量配制的稻谷单独饲喂对小白鼠没有毒性，而且不影响适口性。与协同增效的药物不同，本研究添加了助剂没有显著缩短小白鼠的致死时间，可能与增效机制不同有关，抗凝血杀鼠剂属于慢性杀鼠剂，助剂的作用仍然保持抗凝血剂的致死机理，但是增加了杀鼠剂在水中的溶解性，提高了杀鼠剂的利用率。类似地，应用于害虫防治的杀虫剂，渗透剂类助剂可促进有效组分渗透到靶标生物体内，或者溶解昆虫体壁的蜡质层，增强药液透过生物表面的能力，从而提高杀虫剂的药效和降低用量［22-23］。
抗凝血杀鼠剂仍然是未来一段时间控制鼠害的重要技术措施，在抗药性问题日益突出、新药研制困难的形势下，通过合理使用抗凝血杀鼠剂增效剂，可以大幅降低杀鼠剂的用量，减少杀鼠剂的生态风险，延缓鼠类对抗凝血杀鼠剂的抗药性，延长现有抗凝血杀鼠剂的使用寿命。本研究后续将深入开展农田灭鼠试验及对非靶标生物的安全性试验，以期获得更大的经济效益和社会效益。
4 结论
利用各种农药助剂可以将农药活性成分输送到作物、杂草、害虫和其他有害生物的靶标位点，使其充分发挥药效，减少用量，减轻污染。本研究结果表明，经4%N, N-二甲基甲酰胺及4%二甲基亚砜处理后，0.01%溴敌隆毒谷糙米中的药物含量均显著提高，添加4%N, N-二甲基甲酰胺和4%二甲基亚砜配制的0.0025%溴敌隆毒谷，糙米中的药物含量也均显著增加；而且用4%的两种助剂配制的0.0025%溴敌隆毒谷，对小白鼠均具有较好的适口性及毒杀效果。因此，4%N, N-二甲基甲酰胺或4%二甲基亚砜作为助剂对溴敌隆毒饵均有显著的增效作用，并可显著降低杀鼠剂的使用浓度。
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