【研究意义】番石榴（Psidium guajava）为桃金娘科番石榴属植物，亚热带果树，主要生长在我国广东、广西、海南、台湾、福建等热带及亚热带地区^[1]，其中在广东省惠州、茂名等地区种植较多。番石榴叶是指番石榴的干燥叶子或者带叶嫩茎，其气清香、味涩、甘苦^[2]，含有较丰富的营养物质以及微量元素，且富含多酚、黄酮、多糖等活性物质。番石榴叶作为一种天然果树自然资源，在墨西哥、秘鲁的民间食用历史悠久，常用番石榴叶煎煮来治疗腹泻，预防肥胖和糖尿病等^[3]。广东省近年来加大资金和科研力量的投入，不断引进和培育番石榴新品种，建立番石榴种质资源圃和标准化示范园，对现有番石榴品种进行收集和保护，并推广新品种^[4-5]，当前番石榴资源的利用主要以鲜销果肉为主，而大量番石榴叶未得到充分利用。研究番石榴叶茶的理化特性和功能活性随贮藏时间的变化规律，掌握番石榴叶茶不同冲泡时间的抗氧化活性，可为番石榴叶茶质量评估标准提供参考，为番石榴副产物综合利用奠定理论基础。

【前人研究进展】目前针对番石榴叶的功能性研究较多，已有研究表明番石榴叶具有抗氧化、降血糖、抗腹泻、止血、抗癌等功效^[6-10]。叶伟^[6]对不同番石榴叶有机溶剂提取物的抗氧化活性进行测定，提出番石榴叶提取物具有开发抗氧化抗衰老药物以及酪氨酸酶抑制剂的应用前景。沈静^[7]将番石榴叶提取物作用于糖尿病小鼠，得出番石榴叶提取物可能通过上调PI3K/Akt发挥降糖作用，改善胰岛素抵抗的结论。邬亚男^[3]通过混菌固态发酵，提高番石榴叶中活性物质的含量，并与β-环糊精形成包容物，提高其水溶性及生物利用度。这些研究都为番石榴叶的加工利用提供理论基础，我国一些茶厂将番石榴叶加工制成保健型茶产品，然而当前尚未有文献系统评估番石榴叶茶的功能性物质含量及活性。

【本研究切入点】本试验以不同年份的番石榴叶茶作为研究对象，比较其香气成分，判断是否具有茶类产品的风味成分；比较功能成分含量和活性强弱，以评估番石榴叶茶功能性及贮藏稳定性。【拟解决的关键问题】本研究旨在评估不同年份番石榴叶茶的理化特性，探索贮藏过程中功能活性的变化，明确抗氧化能力最强的冲泡时间段。

1　材料与方法 1.1　试验材料

本试验所用的番石榴叶茶由广东名扬生物科技有限公司提供，经广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所鉴定为番石榴（Psidium guajava）叶。两个样品分别于2018年4月、2019年4月生产（简称样品A、样品B），两者加工工艺（图 1）完全相同。通过比较分析两个样品的理化性质，明确番石榴叶茶的储存特性和生物活性，为其在食品中的应用提供理论基础。

试剂：福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris），苏州亚科科技有限公司；焦性没食子酸、邻苯三酚、邻二氮菲、无水葡萄糖，天津市福晨化学试剂厂；抗坏血酸（VC）、苯酚，天津市大茂化学试剂厂；盐酸（HCl）、浓硫酸（H₂SO₄），广州化学试剂厂；α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），上海瑞永生物科技有限公司。以上所有化学试剂均为分析纯。

仪器与设备：N-100旋转蒸发仪，上海爱郎仪器有限公司；6890N Network GC System气相色谱-质谱联用，安捷伦科技有限公司；UV-1800紫外分光光度计，岛津企业管理（中国）有限公司；Synergy H1酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1 样品提取　 （1）固相萃取：番石榴叶茶粉碎过0.425 mm筛，称取0.3 g，加入6 mL沸水于顶空瓶中，室温下平衡5 min，置55 ℃的水浴磁力搅拌器中，插入萃取头吸附60 min。（2）水提取制备：参照罗思媛等^[11]的方法，料液比改为1∶60，在浸泡15、30、45、60 min时，收集水提物，备用。（3）采用乙醇浸提，超声辅助法提取多酚，具体步骤参照沈维治等^[12]的方法。（4）水提醇沉法提取多糖，参考杨烨^[13]的方法。

1.2.2 番石榴叶茶香气成分测定　 气相色谱质谱条件参照胡西洲等^[14]的方法，程序升温和质谱条件不变，分流比为20 ∶ 1。

1.2.3 番石榴叶茶多酚含量测定　 以没食子酸标准溶液绘制标准曲线，参照程沁园等^[15]的方法，采用福林酚法测定多酚含量。

1.2.4 番石榴叶茶多糖含量测定　 以葡萄糖标准溶液绘制标准曲线，参考彭珊珊等^[16]的方法，采用苯酚硫酸法测定样品葡萄糖的含量，计算总多糖含量。

式中，C为样品溶液葡萄糖的浓度，μg/mL；D为样品定容体积，mL；M为总多糖质量，g。

1.2.5 番石榴叶茶水提物抗氧化活性测定　 参照符春丽等^[17]的方法测定番石榴叶茶的抗氧化活性，以VC为阳性对照，各组平行测定3次，取平均值。

（1）番石榴叶茶水提物对DPPH自由基清除能力的测定：取样品溶液2 mL、DPPH自由基溶液2 mL，充分混匀后避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度A_样品，计算DPPH自由基清除率。

式中，A_背景为无水乙醇代替DPPH；A_空白为无水乙醇代替样品。

（2）番石榴叶茶水提物对羟基自由基清除能力测定：取邻二氮菲乙醇溶液1.5 mL、磷酸盐缓冲液3 mL，混匀后依次加入FeSO₄溶液1.0 mL、样品溶液3.0 mL、双氧水1.0 mL，混匀，37 ℃反应1 h，于536 nm处测定吸光值A_样品，计算羟基自由基清除率。

式中，A_损伤为无水乙醇代替样品；A_未损伤为双蒸水代替双氧水，无水乙醇代替样品。

（3）番石榴叶茶水提物对超氧阴离子清除能力测定：在试管中依次加入Tris-HCl缓冲液2.25 mL、样品溶液2 mL、邻苯三酚0.2 mL，混匀，常温条件下反应30 s，加入0.5 mL盐酸溶液终止反应，于320 nm下测定吸光度A_样品，计算超氧阴离子清除率。

式中，A_空白为无水乙醇代替样品。

（4）番石榴叶茶水提物对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：参照龙晓珊^[18]的方法，以阿卡波糖为阳性对照，在96孔板中加入样品溶液50 μL、α-葡萄糖苷酶溶液（用磷酸缓冲溶液配制）25 μL，混匀，37 ℃反应10 min，加入PNPG溶液（用磷酸缓冲溶液配制）25 μL，混匀后37 ℃反应30 min，加入碳酸钠溶液100 μL终止反应，在酶标仪450 nm波长处测定吸光度A_样品，计算α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中，A_背景为磷酸缓冲溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液；A_空白为磷酸缓冲溶液代替样品。

试验数据采用Miceosoft Excel软件整理，用SPSS软件进行处理和单因素方差分析，用Origin软件绘制图表。

2　结果与分析 2.1　不同年份番石榴叶茶香气成分的比较

通过气相色谱质谱检测，样品A中检测到69种香气成分，样品B有52种，表明样品A中的香气成分更加丰富。经分析，番石榴叶茶中的香气成分可分为萜类化合物、挥发油和其他三大类，其中萜类化合物最多，如β-石竹烯、（-）-蓝桉醇、α-姜黄烯等；挥发油类物质次之，如（+）-香橙烯、香树烯、苯甲醛等（表 1）。苯甲醛是茶叶的香气成分之一^[19]，在黄茶^[20]和白茶^[21]中也存在，说明番石榴叶茶可作为茶叶饮用。

2.2　不同年份番石榴叶茶多酚含量的比较

福林酚法为测定总多酚的常用方法，试验所测得的没食子酸标准曲线的回归方程为Y=0.0116X+0.0863，R²=0.9996。由表 2可知，番石榴叶茶经乙醇浸提后，样品A的多酚含量为34.23 mg/L，样品B的多酚含量为40.93 mg/L，样品B中的多酚含量较样品A多，说明茶叶在贮藏过程中，多酚类物质发生了降解，可能与贮藏环境或多酚本身的性质有关。

2.3　不同年份番石榴叶茶多糖含量的比较

葡萄糖标准曲线的回归方程为Y=0.0081X+0.1443，R²=0.9997。由表 2可知，番石榴叶茶经水提醇沉后，样品A的多糖含量为11.36 mg/g，样品B的多糖含量为6.95 mg/g，可看出样品B中的多糖含量较样品A少，这是由于提取物为水提物，叶茶在贮藏过程中微生物参与反应，从而水溶性多糖含量增多。

2.4　不同年份番石榴叶茶抗氧化活性的比较

在比较番石榴叶茶对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子抗氧化活性的过程中，均以VC作为阳性对照，1 mg/mL的VC对3者的清除率分别为97.26%、90.84%、98.14%。由图 2可知，两个样品对3种自由基均具有一定的清除能力，且样品B的抗氧化活性高于样品A，说明番石榴叶茶具有抗氧化活性，且以贮藏时间较短的样品B抗氧化活性较好。

图 2显示，不同浸泡时间茶汤对自由基的清除能力具有相同的变化趋势，均为先上升后下降，两个样品的变化趋势也相同。浸泡30 min时，样品A、B对DPPH自由基和超氧阴离子的清除能力均达到最大，对DPPH自由基的清除率分别为57.62%、60.11%，与其他时间点差异显著，对超氧阴离子的清除率分别为21.83%、23.55%；浸泡45 min时，样品A、B对羟基自由基的清除率达到最大，清除率分别为74.81%、93.89%。说明番石榴叶茶的冲泡时间为30~45 min时具有最强的抗氧化活性。

2.5　不同年份番石榴叶茶对α -葡萄糖苷酶抑制活性的比较

如图 3B所示，番石榴叶茶可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且与样品质量浓度呈正相关。当样品质量浓度为1.5 mg/mL时，样品A和样品B对α-葡萄糖苷酶活性均有抑制效果，抑制率分别为94.66% 和79.96%，且样品A抑制效果显著高于样品B；阿卡波糖（图 3A）、样品A、样品B对α-葡萄糖苷酶活性半抑制率（IC₅₀）的浓度分别为1.86、0.79、1.1 mg/mL，说明番石榴叶茶对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性，且贮藏时间较久的样品A抑制效果更强，优于阳性药物阿卡波糖。

3　讨论

番石榴叶作为一种天然的果树自然资源，民间常用来煎煮治疗腹泻及预防肥胖和糖尿病等^[3]。莫单丹等^[22]对番石榴叶炮制品进行显微特征、薄层色谱鉴别，测定其水分、总灰分、酸不溶性灰分以及有效成分槲皮素的含量，并以此建立了质量评价标准。已有研究表明，番石榴叶提取物的抗氧化能力与多酚及黄酮含量有关且呈线性相关，同时其中的多糖对碳水化合物水解酶具有较强的抑制能力^[23]。番石榴叶茶因加工工艺的差异，普遍存在理化性质不稳定和功能性成分损失的现状，然而针对番石榴叶茶开展的理化性质及质量标准的研究并不多见。因此，本试验对番石榴叶茶中的多酚及多糖进行提取，测定其含量，后对其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制作用进行测定。

香气是人们评价茶叶的重要指标之一，本试验中，番石榴叶茶的香气成分主要为萜类化合物和挥发油物质，与Borah等^[24]所测得的番石榴叶香气成分相似。除此之外，在番石榴叶茶中还检测到了苯甲醛，中国茶学辞典提到苯甲醛为茶叶中的特征香气成分之一^[19]，说明番石榴叶具有向茶叶产品加工方向发展的潜质。

本试验结果显示，番石榴叶茶贮藏时间越长，其多酚含量越少，多糖含量越多，推测在贮藏过程中多酚发生降解，而多糖由于微生物的参与导致含量增加。胡绍德等^[25]对16种不同年份黑茶的多酚含量以及成分进行研究，得到年份越久的黑茶中多酚含量越少、儿茶素含量也较低的结论，说明多酚类物质长期储存会发生降解。张佳欣^[26]对不同年份茯苓茶中水溶性多糖的含量以及多糖组分的研究结果显示，茯砖茶多糖随着陈化时间的增加而略有增加，多糖成分中中性糖为主体成分。说明在贮藏过程中，茶叶的成分在发生变化，部分不溶性多糖因为微生物的参与转变为可溶性多糖，以致水提物中多糖含量增加。

周先荣等^[27]测定2008、2012、2016年普洱茶的体外抗氧化活性结果显示，3个年份普洱茶均具有较好的抗氧化活性，其中以2016年普洱茶多酚的抗氧化效果最佳。本试验测得2019年番石榴叶茶水提取的抗氧化活性较强，说明贮藏时间越短，茶叶中多酚的抗氧化活性越强。本试验还证明番石榴叶茶冲泡时间在30~40 min时，抗氧化活性最强。由于番石榴叶茶中的抗氧化物质前期大量且快速地溶出，而后随着时间的延长，抗氧化物质发生氧化或者结构发生改变，导致其活性降低。王波等^[28]给予糖尿病小鼠番石榴叶水提物，结果表明番石榴叶提取物对小鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶活性具有明显的抑制作用，并呈现剂量效应关系，本研究同样测得番石榴叶茶提取物对α-葡萄糖苷酶活性具有较强的抑制作用，且贮藏时间较长的样品抑制效果较明显。

4　结论

本试验比较了两个年份番石榴叶茶的香气成分、多酚和多糖含量，探讨其抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果表明，番石榴叶茶中的功能性物质在贮藏过程中有所改变，抗氧化活性以及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率相应发生变化；随着泡茶时间的延长，抗氧化活性呈现先增加后减少的趋势，最佳泡茶时间为30~45 min。贮藏时间较久的2018年样品α-葡萄糖苷酶抑制活性优于阳性药物阿卡波糖，说明番石榴叶茶具有开发成降血糖功能性代用茶的潜质。番石榴叶茶的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性与多酚和多糖的含量有密切关系，其作用机制有待进一步探究。我国华南地区有着丰富的番石榴叶资源，但是利用率较低，本试验不仅为番石榴叶茶在食品行业的实践应用奠定了理论基础，而且为番石榴果树资源综合利用提供切实可行的途径。