【研究意义】印楝素（azadirachtin, AZA）作为植物源杀虫剂的典型代表，可抑制多种害虫的生长发育，已被广泛应用到害虫防制中^[1]。草地贪夜蛾是农业生产中的重要害虫^[2]，也是对印楝素最为敏感的害虫之一。研究表明，对FOXO基因是调控昆虫生长发育的关键转录因子^[3]，但该基因如何调控印楝素所诱导的昆虫细胞凋亡却未见报道，这在一定程度上制约了印楝素的科学使用。【前人研究进展】印楝素是从印楝树（Azadirachta indica A. Juss）的种子、叶子和其他部分中分离出来的柠檬苦素类化合物，几十年来一直在害虫综合治理中用作拒食剂和害虫生长调节剂^[4]。AZA被认为是最有效生物农药之一，最适合于商品化开发的植物源杀虫剂^[5-7]。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是起源于美洲大陆的一种跨国界迁飞性农业重大害虫，具有繁殖能力强、迁飞扩散快和防控难度大等特点^[8-10]。其寄主范围广，幼虫可取食禾本科、菊科、豆科和苋菜科等76科353种植物，给生产带来巨大威胁^[11]。前人研究表明，AZA可以诱导粉纹夜蛾（Cabbage looper Hi-5）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura SL-1）和草地贪夜蛾（Spdoptera frugiperda sf9）等多种昆虫细胞凋亡，进而抑制细胞增殖^[12-14]。此外，AZA已被证明可激活癌细胞中的多种凋亡信号通路，如受体通路、AIF介导通路、ROS依赖性、p38和JNK1/2通路以及MAPK通路^[15-16]。细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD），是一种特殊的细胞死亡方式，是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程^[17]。当细胞凋亡调控失衡时，可引起细胞过度增殖或过度凋亡，导致细胞死亡和相关疾病的发生^[18]。FOXO基因作用广泛，参与调控生长、抗肿瘤、细胞分化、新陈代谢及细胞凋亡等多种过程^[19]。FOXO不仅可调控幼虫的生长发育，还能通过胰岛素受体InR对胰岛素信号通路进行反馈调节^[20]。【本研究切入点】我们之前的研究表明AZA可通过溶酶体释放组织蛋白酶而诱导中肠细胞凋亡^[21]，FOXO基因位于溶酶体信号通路的上游，可参与调控凋亡信号的转导通路，那么该基因是如何调控印楝素诱导的昆虫细胞凋亡呢？本研究从转录因子FOXO出发，结合细胞生物学、分子生物学等技术手段，研究FOXO基因在印楝素诱导sf9细胞凋亡中的作用。【拟解决的关键问题】本研究以印楝素和草地贪夜蛾卵巢细胞为研究对象，探讨印楝素通过FOXO转录因子调控sf9细胞的增殖和凋亡的作用机理，为探索印楝素分子机制提供理论依据。

1　材料与方法 1.1　试验材料

药物及试剂：草地贪夜蛾卵巢细胞sf9（C0004）购自于深圳市百恩生物科技有限公司，印楝素（A115081）购于上海晶纯生化科技股份有限公司，SFM（12682-019）购于赛默飞世尔科技公司，小牛血清（11011-8611）购自于杭州四季青生物工程材料有限公司，Phospho- FOXO（#84192）、Cleaved Caspase-3（#9661）、Bim（#2933）均购自Cell signaling公司，小鼠单克隆抗体，HRP标记的山羊抗小鼠IgG（D110087）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，HRP标记羊抗兔IgG（#A0208）购自碧云天生物技术有限公司，ECL显色试剂盒（#1705060）购自Bio-Rad公司，BCA定量试剂盒（#PA115）购自于天根生化科技（北京）有限公司。

细胞培养：将复苏后稳定生长的sf9细胞置于培养基中，加入含有10%小牛血清的SFX，在27 ℃细胞培养箱中孵育，传代至对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2　CCK-8法检测细胞增殖

将传代至对数生长期的sf9细胞悬浮液（100~500 CFU/μL）接种到96孔板（100 μL/ 孔）中。待细胞贴壁后，吸弃培养基，加入不同浓度的AZA培养液，设置AZA 0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20、40、80 mmol/L 8个浓度处理，另设细胞对照和溶剂对照（1‰ DMSO），27 ℃孵育48 h，向各孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育3 h，于450 nm处测定吸光度。每个浓度设置8个重复孔，并取每组中3次实验的平均值，计算细胞活力:

式中，A _加药为含有细胞、CCK-8和AZA的孔内OD值，A _空白为只含CCK-8、不含细胞和AZA的孔内OD值，A _零加药为含细胞、CCK-8不含AZA的孔内OD值。

1.3　透射电镜观察sf9细胞

5 mmol/L AZA分别作用于细胞24、48、72 h，对照加入1‰ DMSO细胞培养液，每隔2 d重新更换培养液并重新给药。反复吹打后收集细胞悬浮液，室温800 r/ min离心5 min，弃去上清液。用PBS溶液（pH7.4）洗涤3次，800 r/ min离心5 min后用2.5%戊二醛吹散并置于4 ℃过夜。第2天室温800 r/ min离心5 min，收集细胞沉淀，用PBS溶液（pH7.4）洗涤3次，800 r/ min离心min。使用2% 琼脂粉包埋细胞沉淀，修切包埋块后用PBS清洗3次，800 r/ min离心5 min。用1%锇酸固定2 h，每次PBS洗涤3次，每次洗涤30 min；用不同浓度梯度的乙醇进行脱水处理，每次脱水20 min。脱水后的样品用树脂与丙酮渗透4 h，然后在纯树脂中渗透过夜；将样品在聚合反应器中聚合，重新包埋后用LKB-V超薄切片进行切片，后将超薄切片用乙酸双氧铀- 柠檬酸铅染色，自然干燥后在透射电子显微镜下观察、拍照。

1.4　流式细胞仪分拣Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞

将sf9细胞铺满6孔板的90 %，用AZA处理细胞处理方式同透射电镜检测；使用细胞刮刀轻轻刮取细胞，800 r/min离心5 min收集细胞沉淀；用预冷的PBS洗涤细胞沉淀2次，800 r/min4 ℃离心5 min，弃上清。使用500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，用5 μL Annexin V-FITC和5μL PI混匀后轻轻吹打细胞后避光，室温反应10 min。最后使用流式细胞仪检测Annexin V- FITC的绿色荧光和PI的红色荧光。

1.5　Western blot检测蛋白表达

5 mmol/L AZA处理sf9细胞48 h后，对照加入1‰ DMSO的细胞培养液，用PBS洗涤3次，用RIPA提取总细胞蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，加入4×蛋白质上样缓冲液。煮沸5 min，分装后于- 20 ℃冰箱保存待用。将约20 μg蛋白质进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白质转移至PVDF膜。将10%脱脂奶粉封闭2 h后，将一抗于4 ℃摇床上孵育过夜，用PBS洗涤膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，并用ECL发光试剂盒测试。使用Image Pro4.5图像分析软件进行灰度扫描，分析每个条带的灰度值，以β-Tubulin作为内部参考。分别以Phospho-FOXO、Cleaved Caspase-3、Bim和β- Tubulin进行灰度比值计算作半定量分析。

1.6　RNA提取和qRT-PCR

用TRIzol试剂提取sf9细胞的总RNA，通过试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green Master MixqPCR定量试剂盒测定FOXO和α-tubulin的mRNA表达水平。引物序列如下：FOXO（F: 5'- GGATGTGCATTCTATGGTGTACC -3';R: 5'-TTTCGGGATTGCTTTATCTCAGAC -3'）, α-tubulin（F: 5'- CGCATTCATGGTTGATAACG-3'; R: 5'- GGGCACCAAGTTAGTCTGGA -3'），基因相对表达量采用2^-ΔΔCt法测定^[22]，重复3次。

1.7　双链RNA合成及Caspase-3酶活检测

通过T7 RNAi系统（RiboMAXTM）合成dsRNA FOXO，用LipofectamineTM 2000转染sf9细胞。转染dsRNA FOXO后，收集AZA处理的sf9细胞利用Caspase-3酶活检测试剂盒测定其活性。800 r/min离心5 min收集细胞，PBS洗涤细胞3次，加入RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。随后使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白溶液与Caspase-3的特异性发光底物在37 ℃避光孵育4 h，在405 nm处测定光密度。

试验数据使用SPSS 19.0单因素方差分析（SPSS，Chicago，USA）进行差异显著性测验。

2　结果与分析 2.1　印楝素抑制sf9细胞增殖

CCK-8法检测结果表明，AZA在体外对草地贪夜蛾卵巢细胞的增殖有明显的抑制作用。作用48 h后，细胞活力随AZA浓度的增加而显著降低（图 1A），呈明显的浓度依赖性。当AZA在较低浓度0.625 mmol/L时，细胞活力为95.32%；当AZA处理浓度为5 mmol/L时，细胞存活率为67.31%，将该浓度用作后续试验的处理浓度。进一步用5 mmol/L的AZA处理sf9细胞24、48、72、96 h后发现，细胞活力随处理时间的延长而呈下降趋势（图 1B）。由此可见，AZA对sf9细胞的抑制作用呈明显的时间和浓度依赖性。

2.2　印楝素破坏sf9细胞的微观结构

用5 mmol/L AZA分别处理sf9细胞0、24、48、72 h，从结果（图 2）可以看出，AZA处理0 h细胞结构完整，细胞核较大核膜清晰可见，染色质分布均匀，可见明显的细胞器。当AZA处理24 h后，细胞核收缩，染色质聚集，细胞质呈空泡状；处理48 h后，细胞空泡化增加，细胞膜收缩，染色质聚集更严重，细胞变形; 处理72 h后，细胞核的染色质聚集成大颗粒并沿核膜分布，细胞骨架破损，细胞变形不能维持正常的稳态，细胞崩解逐级走向死亡。表明印楝素可破坏草地贪夜蛾卵巢细胞的超微结构。

2.3　印楝素诱导sf9细胞凋亡

根据Annexin V- FITC/ PI联用的流式细胞分拣原理，其检测能够将样本中的正常细胞（图 3A左下）、死亡细胞（图 3A左上），早期凋亡细胞（图 3A右上）和中晚期凋亡细胞（图 3A右下）分类和统计，获得的结果可以更好地计算细胞凋亡率。根据统计结果（图 3B），可看出随AZA处理时间延长，早期凋亡细胞比率增加。处理0 h为1.09%，处理24 h为14.83%，处理48 h为23.81%，处理72 h为46.94%，不同处理间差异显著，即AZA诱导的sf9细胞凋亡率与时间呈正相关。

2.4　印楝素通过上调FOXO基因诱导sf9细胞凋亡

用5 mmol/L AZA处理sf9细胞48 h后，与对照相比凋亡蛋白Bim和Cleaved-Caspase-3的表达水平显著增加（图 4A、B）。FOXO总蛋白表达无明显差异，但P-FOXO蛋白表达显著低于对照。表明AZA可抑制sf9细胞中FOXO蛋白的磷酸化水平，从而诱导凋亡。进一步利用qRT-PCR检测发现，FOXO基因的表达量与AZA处理时间呈正相关，在此基础上通过RNAi技术降低FOXO基因在sf9细胞中的表达量，经AZA处理后发现Caspase-3的酶活性显著降低。表明AZA可通过上调转录因子FOXO的表达而诱导sf9细胞凋亡。

3　讨论

印楝素是目前世界公认的活性最强的拒食剂和昆虫生长调节剂，是最优秀的生物农药之一。印楝素处理后，昆虫不能正常蜕皮，停滞在幼虫- 蛹中间体或永久幼虫状态^[13]。大量实验证明，印楝素可导致草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和粉纹夜蛾等昆虫离体细胞的线粒体膜电位降低，引起细胞凋亡^[23-24]。早在1993年，Rembold和Annadurai曾报道印楝素可影响草地贪夜蛾卵巢细胞sf9的增殖和蛋白合成^[25]。本研究采用CCK-8方法证实了AZA可抑制草地贪夜蛾卵巢细胞的增殖，且呈现时间和浓度的依赖性。透射电镜发现sf9细胞的微观结构发生明显变化，即细胞核发生变形和皱缩，染色质聚集，细胞质空泡化；流式细胞凋亡率检测表明，凋亡细胞与处理时间呈正相关，提示AZA抑制sf9细胞增殖，促进细胞凋亡，与前期研究结果一致。

细胞凋亡受细胞内各种分子调节，FOXO属于叉头转录因子家族，在细胞凋亡中起重要作用^[26]，可被PI3K/Akt信号通路调控，该通路与细胞生存密切相关。FOXO为Akt的下游底物，激活Akt使FOXO的Thr32、Ser253及Ser315三个位点发生磷酸化，并从细胞核转运至细胞质，不发挥其转录因子的作用；反之，当Akt的活性下降时，FOXO的磷酸化水平下降，非磷酸化的FOXO可移位进入细胞核，发挥其转录活性，诱导靶基因的转录^[27]。Bim蛋白是Bcl-2凋亡相关蛋白家族中仅含有BH3结构域的促凋亡蛋白，是FOXO诱导的重要靶基因，转录因子FOXO可结合于Bim的启动子上调控Bim的表达。Bim表达上调促进线粒体释放细胞色素c及Caspase的激活，从而导致细胞凋亡^[28-29]。本研究显示，AZA作用sf9细胞后，FOXO总蛋白水平没有显著变化，但磷酸化水平降低，靶基因Bim的蛋白表达量增加，Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平上升，说明印楝素通过降低sf9细胞中FOXO基因的磷酸化水平，使其发挥其转录因子活性，进而诱导FOXO的靶基因促凋亡蛋白Bim表达量升高，该蛋白表达量升高导致Caspase-3的激活。为验证这一结论，本研究在此基础上，利用RNAi技术降低sf9细胞中FOXO基因表达，AZA处理后发现Caspase-3活性显着降低，证实转录因子FOXO可调控AZA诱导的sf9细胞凋亡。然而，由AZA控制的细胞的凋亡过程非常复杂，涉及多个信号通路和生物过程，其分子机制仍需进一步研究。

4　结论

本研究以草地贪夜蛾卵巢细胞sf9为研究对象，探讨了印楝素对sf9细胞增殖的影响及其作用机理。结果表明，印楝素对sf9细胞有明显的增殖抑制作用，且呈明显的时间和浓度依赖性。透射电镜观察到5 mmol/L AZA可破坏sf9细胞的微观结构，导致细胞核收缩，染色质聚集，细胞质空泡状；进一步通过流式细胞仪检测发现，AZA可诱导sf9细胞凋亡并与处理时间呈正相关；分子生物学实验发现AZA可使sf9细胞中FOXO蛋白的磷酸化水平降低，靶基因促凋亡Bim和Cleaved Caspase-3的表达量增加；进一步利用RNAi技术沉默FOXO后，经AZA处理发现Caspase-3的酶活性显著降低。表明印楝素可通过上调FOXO的表达而诱导草地贪夜蛾卵巢细胞凋亡。