2021, Vol. 48文章信息
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基金项目
- 国家自然科学基金（31801418）；广东省自然科学基金（2020A1515011146）；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系项目（CARS-10-B03，CARS-10-C15）
作者简介
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邹宏达（1982—），男，博士，助理研究员，研究方向为甘薯遗传育种，E-mail：zouhongda@gdaas.cn; 房伯平，三级研究员，国家现代农业产业技术体系鲜食型甘薯改良岗位科学家，广东省农业科学院“十三五”优势学科团队学术带头人，广东省农业科学院作物研究所甘薯研究首席科学家。农业农村部薯类作物专家指导组成员、国家甘薯产业体系中国甘薯专业委员会副理事长、中国甘薯品种评价委员会委员副主任、中国热带作物学会薯类专业委员会副理事长、中日韩甘薯研究协会理事
主要从事甘薯新品种选育与配套技术，甘薯种质资源的收集、保存与评价利用以及甘薯病虫害防控与抗性研究等。承担国家基础性项目、欧盟第五框架合作研究项目、农业部“948”计划、科技支撑计划、行业计划项目以及科技部“863”项目和广东省自然科学基金、广东省科技攻关和广州市政府招标等多个项目。获得研究成果5项，其中省级以上科技成果3项。主持选育成通过省级以上审定的甘薯品种25个，其中通过国家品种审定或鉴定的16个。出版论著3部，制定了农业部行业标准《农作物种质资源鉴定技术规程 甘薯》等。发表科技论文80余篇，其中第一作者或通讯作者40篇，SCI收录9篇.
通讯作者
- 房伯平（1961—），男，研究员，研究方向为甘薯遗传育种，E-mail：bpfang01@163.com.
文章历史
- 收稿日期：2021-10-31
2. 仲恺农业工程学院农业与生物学院，广东 广州 510225
2. College of Agriculture and Biology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China
【研究意义】甘薯为旋花科甘薯属植物，是一种高产、稳产、营养丰富、开发用途广、经济效益高的重要薯类农作物，在粮食、食品、饲料、工业原料及新型能源等方面具有重要的应用[1]。随着经济的发展和生活水平的提高，甘薯已从传统上的纯粮食作物向营养健康型经济作物转变，并已培育出多种专用型品种[2-4]。甘薯是广东省重要的经济作物，种植面积近几年维持在5万hm2左右，其种植面积仅次于水稻、花生，居全省主要农作物第3位[5]。广东省甘薯产业以种植生产、销售、消费优质鲜食型甘薯为主，是全国最大的鲜食甘薯消费和集散地[6]。鲜食型甘薯主要是指不经过深加工，直接适宜蒸、煮、烘烤的甘薯品种。多年以来，我国的鲜食型甘薯品种遗传选育的食味评价标准均是以蒸制为主，分为薯块甜度、黏度、面度、香度、纤维感[7], 其中香味是甘薯品质评价的重要指标，也直接影响消费者选择, 但甘薯香味的感官评价更多是依赖于育种家的经验，缺乏量化的评价标准。挥发性风味化合物是甘薯香味的物质基础，因此分析代表性鲜食型甘薯品种蒸制前后的挥发性风味成分，可为鲜食型甘薯的品种改良及判断消费者的喜好提供重要参考标准。【前人研究进展】国内外鲜食型甘薯的主要烹饪方式包括蒸、煮、烘烤、炸制、微波等，不同烹饪方式下，甘薯挥发性风味化合物的结构和组成差别明显[8]。相对于煮、微波的加工方式，烤制的甘薯香味物质的种类较多，浓度较高，香味更加明显[9]，且最先开展甘薯香味研究的美国其主要的甘薯食用方式为烘烤[10]，因此以往大多数研究甘薯挥发性风味物质成分的加工方式均以烤制为主。如李臣等[11]以12个不同加工类型甘薯品种为实验材料，比较其烘烤前后主要营养成分变化和甘薯香味组分差异，发现苯乙醛、苯甲醛、葵醛、β- 愈创木烯和石竹烯为甘薯香味共有组分, 并证实美拉德反应和脂肪热降解是甘薯香味形成的重要途径。田晴等[12]通过气相色谱- 质谱联用（GC-MS）探究不同烘烤时间（1、2、3 h）及温度（150、200、250 ℃）对冀粉1号甘薯香气成分的影响，结果表明不同条件下共检测到63种香气成分，其中19种为共有，醛、醇、酚类物质相对含量所占总香气成分比重较大。Tsai等[13]通过GC-MS研究甘薯品种台农57号220 ℃下不同烘烤时间的香气成分组成，共检出46种挥发性化合物，其中2- 呋喃甲醇、糠醛、麦芽酚为被确定为烤制甘薯香气的主要来源。国内鲜食型甘薯的主要食用方式为蒸煮，这是也我国目前甘薯遗传选育的主要方向，但关于甘薯蒸制前后的挥发性风味成分分析的研究国内外却鲜见报道。【本研究切入点】2006—2016年广东省农业科学院作物研究所共选育了20个广薯系列甘薯品种通过国家品种鉴定或广东省审定[6]，其中优质鲜食型甘薯品种广薯87是其中的优异代表品种，广薯87蒸制后食味粉香、薯香浓郁，口感好，连续多年被遴选为广东省主导甘薯品种，因此本研究以代表性鲜食型甘薯品种广薯87为试验材料，研究其蒸制前后的挥发性风味成分变化及差异。【拟解决的关键问题】通过全自动顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱- 质谱（GC-MS）联用技术对广薯87鲜薯和蒸薯的挥发性风味成分进行检测，并通过差异分析及代谢通路分析，初步发掘与甘薯蒸制香味相关的挥发性风味成分，以期为鲜食型甘薯品种改良提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料广薯87于2019年12月15日收获于广东省农业科学院白云试验基地，生育期120 d，收获后对薯块进行分级处理，选取中等大小薯块（200 g左右）进行样品制备。
主要仪器设备：7890B-7000D气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪，DB-5MS色谱柱, 120 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Agilent公司；MM400球磨仪，德国Restsch公司；SPME Allow Cond固相微萃取装置、Fiber Conditioning Station老化装置，Agitator样品加热箱，瑞士CTC Analytics AG公司。
1.2 试验方法1.2.1 样品制备 鲜薯样品制备：选取大小适中、质量相近的鲜薯，洗净切丝，混合均匀后取适量样品放入-80℃冰箱保存。
蒸薯样品制备：选取大小适中、质量相近的鲜薯，洗净后置于蒸笼上，蒸制1 h后挖取适量样品，放入-80 ℃冰箱保存。
1.2.2 挥发性成分的提取 采用GC-MS方法测定风味物质成分。从-80 ℃冰箱中取出样品进行液氮研磨，涡旋混合均匀，每个样本称取约1 g于顶空瓶中，分别加入饱和NaCl溶液，10 μL（50 μg/mL）内标溶液。在100 ℃恒温条件下，震荡5 min，将老化的120 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶中，顶空萃取15 min，于250 ℃下解析5 min，然后进行GC-MS分离鉴定。
1.2.3 GC-MS参数条件 色谱条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（纯度≥ 99.999%），恒流流速1.2 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流进样，溶剂延迟3.5 min。程序升温：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃ /min升至100 ℃，再以7 ℃ /min升至180 ℃，最后以25 ℃ /min升至280 ℃，保持5 min。
质谱条件：电子轰击离子源（EI），离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质谱接口温度280 ℃，电子能量70 eV，扫描方式为全扫描模式，质量扫描范围：m/z 50~500 amu。
1.2.4 代谢物相对含量分析 基于MWGC数据库，对样本的代谢物进行质谱定性及相对定量分析。分析时样本的指纹质谱图与数据库中的参考质谱图进行匹配对比，进行打分定性，并且参考保留指数信息，增加定性的准确度，排除假阳性物质的干扰。用MassHunter定量软件处理样本下机质谱文件，选择定量离子进行色谱峰的积分和校正工作，增强相对定量的准确性。选取Fold Change ≥ 2和Fold Change ≤ 0.5的代谢物。代谢物在对照组和实验组中差异为2倍以上或0.5以下，则认为差异显著。
1.2.5 代谢物相对含量分析 差异代谢在生物体内相互作用，形成不同的通路。利用KEGG数据库[14]对差异代谢物根据通路类型进行注释并展示。在此基础上，利用按照筛选标准鉴定得到的差异代谢物的KEGG注释信息，选择至少含有5个差异代谢物的KEGG代谢通路，对这些通路中的所有差异代谢物的相对含量进行聚类分析，以便更好地研究潜在重要代谢通路中的物质含量在不同分组中的变化规律。
2 结果与分析 2.1 挥发性风味物质成分分析通过采用HS-SPME和GC-MS联用技术对广薯87鲜薯及蒸薯挥发性风味物质进行检测，筛选出Match factor ≥ 60的化合物（表 1）。鲜薯共检测出71种挥发性物质，主要包括醛类（40.52%）、萜类（16.18%）、杂环类（15.17%）、醇类化合物（11.59%）等。蒸薯共检测出69种挥发性物质，主要包括醛类（47.36%）、芳烃类（21.39%）、萜类（10.33%）化合物等。从挥发性风味物质成分的相对含量可知，醛类化合物是构成广薯87鲜薯及蒸薯的主要香气成分，该类化合物一般具有奶油、脂肪、香草以及清香等气味[15]。其中，苯乙醛是广薯87鲜薯及蒸薯所有挥发性物质中含量最高的一种化合物，相对含量为分别为16.78%和19.62%。苯乙醛在自然界中广泛存在，由氨基酸苯丙氨酸合成, 稀释后具有水果香甜气息[16]。
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广薯87鲜薯主要的挥发性物质还包括己醛（14.65 %）、戊基呋喃（11.78 %）和辛烯-3-醇（6.56%）。己醛属于醛类化合物，具有青香、叶香、果香、木香[17]，戊基呋喃属于杂环类化合物，具有豆香、果香、青草香及类似蔬菜的香气[17]，辛烯-3- 醇属于醇类化合物，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气[18]。
广薯87蒸薯的主要挥发性物质还包括2, 4-二叔丁基苯酚（13.98%），己醛（11.78%）和氯乙酸2- 苯乙基酯（6.79%）。2, 4- 二叔丁基苯酚属于芳烃类化合物，具有枯焦气息[17], 氯乙酸2-苯乙基酯则属于卤代烃类化合物, 在荔枝酒的发酵过程中可检测到。
由表 1可知，广薯87鲜薯蒸制后，2, 4- 二叔丁基苯酚，氯乙酸2- 苯乙基酯的相对含量明显上升，而戊基呋喃的相对含量明显下降。
2.2 差异代谢物的确定据差异倍数Fold Change值对广薯87鲜薯和蒸薯检测到的挥发性物质进行差异筛选，选取Fold Change ≥ 2和Fold Change ≤ 0.5的挥发性物质，以Fold Change值大于2为上调，小于0.5为下调。当该挥发性物质在对照组和实验组中差异为2倍以上或0.5以下，则认为相对含量上有明显差异。以此为标准共筛选出47种差异代谢产物，其中上调的挥发性物质有14种，下调的挥发性物质有33种（表 2）。
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在对广薯87鲜薯和蒸薯所检测到的挥发性物质进行定性和相对定量分析后，将差异倍数Fold Change值进行log2处理，图 1为其上调和下调变化排在前10的差异挥发性物质结果。在这20种代谢产物中，包括2种醇（2, 2, 3, 3- 四甲基- 环丙烷甲醇，神经醇），4种芳烃（乙苯烯，间二甲苯，2, 4- 二叔丁基苯酚，萘），2种醛（正辛醛，反式-2, 4- 癸二烯醛），6种萜（樟脑，月桂烯，（+）-α- 芹烯1，α- 萜类品烯，δ-3- 蒈烯，3, 6, 6- 三甲基- 双环[3.1.1]庚-2- 烯），2种卤代烃（氯乙酸2- 苯乙基酯，1, 4- 二氯苯），2种杂环类化合物（2- 丙基-1H- 咪唑，2- 丙基- 呋喃），1种烃类（3, 3, 4- 三甲基- 庚烷），一种酚类（顺式对甲酚）。其中，上调包括氯乙酸2- 苯乙基酯、顺式对甲酚、1, 4- 二氯苯、3, 3, 4- 三甲基- 庚烷、正辛醛、樟脑、乙苯烯、间二甲苯、2, 4- 二叔丁基苯酚、萘；下调包括2- 丙基-1H- 咪唑、2, 2, 3, 3- 四甲基- 环丙烷甲醇、月桂烯、（+）-α- 芹烯1、神经醇、反式-2, 4- 癸二烯醛、α- 萜类品烯、2- 丙基- 呋喃、δ-3- 蒈烯、3, 6, 6- 三甲基- 双环[3.1.1]庚-2- 烯。由表 2可知，上调倍数最高的化学物为氯乙酸2- 苯乙基酯，上调倍数为4.4；下调倍数最高的化合物为2- 丙基-1H- 咪唑，下调倍数高达13.49。
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| 图 1 广薯87鲜薯和蒸薯挥发性物质上调和下调变化排在前10位的差异代谢物 Fig. 1 Top ten up-regulated and down-regulated differential metabolites between fresh and steamed sweet potatoes of Guangshu 87 |
2.3 差异代谢物通路分析
通过查找KEGG数据库可以得到差异挥化性化合物的ID，将获得到的差异挥发物ID输入到KEGG代谢通路数据库，对差异较大代谢物KEGG的注释结果按照KEGG中通路类型进行分类。如图 2所示，差异挥发物的代谢途径共检测到5条代谢通路，分别是苯丙烷类的生物合成、次级代谢物的生物合成、代谢途径、单萜生物合成及柠檬烯和蒎烯的降解。差异挥发物占比最多的是代谢途径，该代谢通路检测到的差异代谢物主要有1, 4- 二氯苯、乙苯烯、间二甲苯、萘、邻二甲苯、E-2- 辛烯醛、（+）- 柠檬烯。在次级代谢物的生物合成代谢通路中，检测到的差异代谢物主要有柠檬醛、月桂烯、（+）- 柠檬烯、E-2- 辛烯醛；单萜生物合成代谢通路检测到的差异代谢物主要有月桂烯、（+）- 柠檬烯；柠檬烯和蒎烯的降解代谢通路检测到的差异代谢物主要有（+）- 柠檬烯；苯丙烷类的生物合成代谢通路检测到的差异代谢物主要有丁子香酚。
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| 图 2 广薯87鲜薯和蒸薯差异挥发物的KEGG分类 Fig. 2 KEGG Classification of differential volatile components between fresh and steamed sweet potatoes of Guangshu 87 |
利用按照筛选标准鉴定得到的差异代谢物的KEGG注释信息，选择至少含有5个差异代谢物的KEGG代谢通路并对该通路中的所有差异挥发物的相对含量进行聚类分析，并将结果绘制成聚类热图，不同颜色代表差异挥化物相对含量归一化处理后得到的数值，反映其相对含量的高低，其中红色代表高含量，绿色代表低含量（图 3）。在代谢途径中，广薯87除E-2- 辛烯醛、（+）- 柠檬烯表达下调外，其余芳烃类化合物均表达上调。大部分芳烃类化合物具有特殊的芳香气味，进一步推测鲜薯蒸熟后产生的挥发性物质主要来源于1, 4- 二氯苯、乙苯烯、间二甲苯、萘、邻二甲苯等芳烃类化合物。而苯丙烷类的生物合成、次级代谢物的生物合成、单萜生物合成及柠檬烯和蒎烯的降解余下的四条代谢通路的差异代谢物均呈下调。E-2- 辛烯醛具有青草香和脂肪香味[19]。柠檬烯是多种水果（主要为柑橘类）、蔬菜及香料中存在的天然成分，在柑橘类水果（特别是其果皮）、香料和草药的精油中含量较高。柠檬醛天然品存在于柠檬草油、山苍子油、柠檬油等中，具有抑菌谱广、无毒或低毒的特性[20]。月桂烯具清淡的香脂香气, 存在于红茶及砖茶、沱茶等后发酵茶中，其含量因发酵而增加。丁子香酚具浓郁的石竹麝香气味，具有很强的杀菌力，兼有局部防腐作用。
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| 图 3 广薯87鲜薯和蒸薯KEGG通路的差异挥发物聚类热图 Fig. 3 Cluster heatmap of differential volatile components in KEGG pathway of fresh and steamed sweet potatoes of Guangshu 87 |
3 讨论
顶空固相微萃取技术（HS-SPME），不需有机溶剂，高度整合浓缩、萃取、采样和进样程序，所需样品量少、成本低、灵敏度高，通过与气相色谱- 质谱（GC-MS）联用，可快速准确地对挥发性风味成分进行定性和定量分析[21]。本研究通过HS-SPME和GC-MS联用，成功检测了优质鲜食型甘薯品种广薯87鲜薯和蒸薯的挥发性风味成分及相对含量，表明以上方法可以有效应用于甘薯香味物质的研究，并可弥补食味评价中香味指标主观性强、评价标准难以量化的缺点。甘薯在通过不同的加工方式处理后，其挥发性风味组分及相对含量均存在差异。Wang等[9]通过GC嗅觉分析，共发现确认了36种风味物质，但煮制和微波处理的甘薯产生的香味活性物质仅为烤制的54.26% 和6.43%。三种加工方式共有的挥发性风味成分分别为苯乙醛、1, 2, 4- 三甲基苯、香叶酸甲酯和p- 紫罗兰酮，被认为是构成甘薯香味的基础。其余风味物质中2- 乙酰基呋喃、苯甲醛、2-戊基呋喃、麦芽酚、芳樟醇、香叶醇和α- 蒎烯为烤制所特有，麦芽酚为煮制所特有，芳樟醇和香叶醇为微波所特有。前人关于甘薯挥发性风味成分的研究，均以加工熟化后的熟薯为研究对象，而忽视了与鲜薯的比较，如李臣等[11]研究发现，广薯87经过烘烤加工后，烯类及萜烯类化合物相对含量高达63.17%，而在本研究中发现，广薯87的鲜薯及蒸制后的熟薯中，醛类化合物相对含量最高，分别为40.52% 和47.36%，萜类仅为16.80% 和10.33%。Wang等[10]对甘薯烘烤香味形成途径的相关研究发现，甘薯烘烤加工后香味的形成涉及美拉德反应、焦糖化反应、脂类和类胡萝卜素降解以及糖苷萜类的热释放等途径，其中美拉德反应和焦糖化反应起到最主要的作用。广薯87蒸制后挥发物的形成则主要涉及芳香烃类化合物等代谢途径，其芳烃类挥发性风味成分也由鲜薯的4.48% 提升至蒸制后的21.39%。前人研究发现苯乙醛是甘薯烘烤后重要香味组分[9-13]，但本研究发现广薯87蒸熟后，同鲜薯比较产苯乙醛的含量变化不明显，而2, 4-二叔丁基苯酚、氯乙酸2- 苯乙基酯的相对含量明显上升，推测醛类物质构成了广薯87蒸制后香味的本底，而二叔丁基苯酚、氯乙酸2- 苯乙基酯则对其蒸制的香味贡献更大。
4 结论本研究通过HS-SPME和GC-MS联用，分析了广薯87鲜薯及蒸薯挥发性风味物成分组成及相对含量差异。广薯87鲜薯及蒸薯分别检测出71和68种挥发性物质，主要挥发物均为苯乙醛，但蒸煮前后相对含量差异不显著。广薯87鲜薯蒸制后，2, 4- 二叔丁基苯酚，氯乙酸2- 苯乙基酯的相对含量明显上升，而戊基呋喃的相对含量明显下降。对所检测出的代谢物进行差异筛选，从样品中共筛选出47种差异代谢物，筛选出蒸制后上调的代谢物有14种，蒸制后下调的代谢物有33种。对差异较大代谢物KEGG的注释结果按照KEGG通路类型进行分类，得出5条代谢通路。其中，含有最多差异代谢物的KEGG代谢通路为代谢途径，共检测到7种差异代谢物。其中，蒸制后1, 4- 二氯苯、乙苯烯、间二甲苯、萘、邻二甲苯含量明显上升，E-2- 辛烯醛、（+）- 柠檬烯、柠檬醛、月桂烯、丁香酚含量下降。
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（责任编辑 杨贤智）