【研究意义】烟草（Nicotiana tabacum L.）是世界上重要的经济作物，作为卷烟工业原料的同时，其药用价值备受关注。烟草中含有绿原酸、芦丁（亦称芸香苷）、茄尼醇等多种活性成分，其中绿原酸具有抗肺炎链球菌、金葡球菌和痢疾志贺氏菌等细菌，抗艾滋病、甲型流感、乙型肝炎等病毒，抗肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤等肿瘤，治疗血脂异常、糖尿病、高血压等代谢性疾病等多种药理作用^[1-2]；芦丁可以有效清除自由基、抗脂质过氧化、抗病毒、拮抗血小板活化因子、抗急性胰腺炎等；茄尼醇是合成辅酶Q10和维生素K2的主要中间体，还可以作为抗溃疡药物、抗癌药物的合成原料^[3-4]。广东省农业科学院作物研究所于20世纪50年代开始烟草种质资源的收集工作，目前保存各类烟草资源约1 300份，其中包括广东地方特有资源300多份，这些烟草资源在本地保存后绿原酸、芦丁、茄尼醇等重要活性成分的含量变化尚不清晰。因此，明确各活性成分的含量差异，对于开发利用这些烟草资源具有重要的现实意义。【前人研究进展】绿原酸和芦丁都是多酚类化合物，在烟草中的含量较高，占烟草中植物多酚含量的80% 以上^[5]。植物中广泛存在的绿原酸类物质有6种异构体，即绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C，这些异构体都具有一定的生物活性^[6]。史春云等^[7]测定了不同产地上部烟叶中8种多酚物质的含量，结果表明烟叶中含量较高的是绿原酸和芸香苷，且不同产地的多酚含量差异较大，其中以河南襄县的绿原酸含量最高。李力等^[8]分析了不同来源的18个烤烟样品中6种多酚的含量，发现从高到低依次为绿原酸、芸香苷、隐绿原酸、新绿原酸、莰菲醇基-3- 芸香糖苷、莨菪亭。万诚等^[9]的研究结果显示，在烟草整个生育期，烟叶中绿原酸呈4种变化趋势，分别为上升、上升－下降－上升、“M”和“W”型变化趋势；其中在烟叶成熟采收时，烤烟类与香料烟类品种的绿原酸含量最高、为2.3%，其次是晾晒烟，白肋烟最低、为1.4%。这些研究表明，在不同产地、不同类型、不同生育期的烟草中，绿原酸、芦丁等的含量有较大差异。茄尼醇是一种萜烯类化合物，在烟叶、马铃薯叶和桑叶中含量突出，尤其在烟叶中茄尼醇含量可高达0.3%~3%^[10]。Kotipalli等^[11]对茄科植物中提取的茄尼醇进行测定，证实了烟草是茄尼醇最丰富的来源（0.85%~3.75%）。刘宇欣等^[12]的研究表明，白肋烟及烤烟中茄尼醇含量较高，香料烟其次，而雪茄烟含量最低。同一类型烟草品种在不同的取样时期，茄尼醇的含量均以叶中最高，其次是茎，根中最低^[13]，且烟草不同叶位茄尼醇含量的顺序为上部叶＞中部叶＞下部叶^[14-15]。不同生长期的云烟85和漂河1号烟叶中茄尼醇含量随着烟株苗龄的增加而逐渐上升，现蕾时叶中的茄尼醇含量达到最大值，此后逐渐下降，并趋于平缓^[16]。也有一些关于不同产区烟草茄尼醇含量变化的报道^{[12, 15, 17-18]}。以上研究表明，茄尼醇在烟草中的含量最高，不同类型、不同组织、不同叶位、不同生育期以及不同产区的烟草中，茄尼醇的含量也有较大差异。【本研究切入点】广东省农业科学院作物研究所目前保存烟草种质资源约1 300份，是我国烟草资源的主要保存单位^[19]，由于烟草资源主要以种子形态在特定环境中进行保存，一定时间后种子发芽率逐渐下降，因此需要按计划分年度进行繁种更新，以保证烟草种质的长期保存^[20]。繁种用烟草种质资源中各活性成分含量亟需明确，而前人的研究多是检测打顶后烟草各成分的含量^[21-23]，不打顶条件下含量变化尚未见相关报道。【拟解决的关键问题】利用HPLC方法检测繁种用烟草种质资源中绿原酸、芦丁、茄尼醇等重要活性成分的含量，以期为所保存烟草种质资源的有效开发利用提供参考。

1　材料与方法 1.1　试验材料

试验在广东省农业科学院白云基地进行，试验地肥力中等，前作为水稻。供试17份烟草种质资源材料包括K326、云烟87、翠碧一号、广烟125、广烟127、NC82、NC347、CV099、SR1307、黄坑7号-1、黄坑片坑3号等11份烤烟和S20大牛舌、S19大肩叶、S18大幅烟、S21大秋根-2、S17大都青梗、S16打宾柳叶烟等6份晒烟，于2020年7月10日播种育苗，9月1日移栽，采用大田常规栽培管理，烟株现蕾后不打顶，在叶片成熟期采收上二棚叶片，每份资源采收3株，每株采1~2片叶，105 ℃杀青30 min，然后去掉各叶片的主脉，再于55 ℃烘箱中烘干备用。

仪器：高效液相色谱仪（Agilent 1260，美国），超声波清洗器（KQ-250DE，江苏昆山），电子天平（Mettler Toledo EL204，德国），高速冷冻离心机（Thermo Scientific SL16R，美国），超纯水器（Millipore Direct-Q，美国），多功能粉碎机（FW100，天津）。

试剂：甲醇、乙醇、乙腈、甲酸和磷酸二氢钠均为Sigma Aldrich品牌，HPLC级别。绿原酸（Chlorogenic acid）、新绿原酸（Neochlorogenic acid）、隐绿原酸（Cryptochlorogenic acid）、异绿原酸A（Isochlorogenic acid A）、异绿原酸B（Isochlorogenic acid B）、异绿原酸C（Isochlorogenic acid C）、芦丁（Rutin）和茄尼醇（Solanesol）等分析标准品，纯度均≥ 98 %，购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1 溶液配制　分别精确称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C标准品各10 mg，分别定容于200 mL容量瓶中，配制成50 μg/mL的母液，然后等梯度分别稀释成50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39 μg/mL标准品溶液，测定分析曲线。

准确称量芦丁和茄尼醇标准品各10 mg，分别定容于10 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL的母液，然后等梯度分别稀释成1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125 mg/mL的标准品溶液，测定分析曲线。

1.2.2 样品制备　将烘干的烟叶用多功能粉碎机进行粉碎，过孔径0.425 mm筛备用。称取0.1 g左右的烟末样品于2 mL离心管，加入1.0 mL提取液，在30 ℃、超声提取20 min，重复3次；浸提液以10 000 r/min离心10 min，将上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，然后将稀释后的样品进行HPLC分析。6种绿原酸异构体的提取液为50% 的甲醇，芦丁和茄尼醇的提取液为纯甲醇。

1.2.3 HPLC分析　色谱条件：色谱柱为VPODS（Shim-pack，5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温为35 ℃，紫外检测器为Agilent 1260 VWD。

（1）6种绿原酸异构体的测定。流动相A（0.1% 甲酸）：B（乙腈），流速1.0 mL/min，进样量5 μL，检测波长327 nm。梯度洗脱程序见表 1。

（2）芦丁的测定。流动相A（0.1% 磷酸二氢钠）：B（乙腈）= 68 : 32，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，检测波长275 nm。

（3）茄尼醇的测定。流动相A（乙醇）：B（甲醇）= 72 : 28，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，检测波长215 nm。

2　结果与分析 2.1　色谱条件确定

为了准确区分6种绿原酸异构体，利用HPLC法进行检测，并参照董珊等^[24]的方法，以0.1% 甲酸和乙腈为流动相，进行梯度洗脱，利用1260 VWD检测器，检测波长选择327 nm，6种化合物可得到良好的分离（图 1）。芦丁的检测以0.1% 磷酸二氢钠和乙腈为流动相，检测波长选择275 nm。茄尼醇检测的流动相是乙醇和甲醇，检测波长为215 nm。柱温选择35 ℃，该温度下8种化合物的分离效果良好。

2.2　线性关系分析

以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程，结果（表 2）显示，6种绿原酸异构体在12.5~0.40 μg/mL范围内线性关系良好，检出限为1.1~1.5 mg/kg，定量限为3.7~5.0 mg/kg；芦丁、茄尼醇分别在1.0~0.03125、0.5~0.03125 mg/mL范围内线性关系良好。图 1~ 图 3分别为6种绿原酸异构体、芦丁和茄尼醇标准品的HPLC色谱图，其中6种绿原酸异构体的保留时间为7.637~17.468 min，芦丁、茄尼醇的保留时间分别为7.289和7.370 min。

2.3　6种绿原酸异构体含量分析

从图 4可以看出，6种绿原酸异构体中，新绿原酸以S16打宾柳叶烟的含量最高（215.91 mg/ kg），其次是NC347、NC82（分别为189.96、162.18 mg/kg），而K326最低（未检测到）；含量高于100 mg/kg的种质有8份，其中烤烟和晒烟种质各4份，分别占所测种质的36.4% 和66.7%。绿原酸的含量如图 5所示，以S16打宾柳叶烟最高（4 813.41 mg/kg），其次是S20大牛舌、S19大肩叶（分别为2 475.67、2 081.68 mg/ kg），而K326最低（47.43 mg/kg）；含量高于1 000 mg/kg的种质有9份，其中烤烟5份，晒烟4份，分别占所测种质的45.5% 和66.7%。隐绿原酸的含量如图 6所示，也是以S16打宾柳叶烟最高（670.13 mg/kg），其次是S19大肩叶、S20大牛舌（分别为425.63、311.53 mg/kg），而K326最低（未检测到）；含量高于200 mg/kg的种质有9份，其中烤烟5份，晒烟4份，分别占所测种质的45.5% 和66.7%。以上结果表明，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸含量较高的晒烟类烟草种质数占比均较高，烤烟类不同烟草种质中这3种活性成分的含量差异较大。

异绿原酸B的含量如图 7所示，在8份烟草种质中检测到，均为烤烟，占所测种质的72.7%，以广烟127的含量最高（108.68 mg/kg），其次是NC82、K326，均低于100 mg/kg，另外9份种质中未检测到，其中包括3份烤烟和6份晒烟；异绿原酸A的含量如图 8所示，17份烟草种质的含量均低于10 mg/kg，其中以NC82最高（9.89 mg/ kg），其次是NC347、S21大秋根-2，除广烟125和黄坑7号-1烤烟种质中未检测到外，全部晒烟以及9份烤烟种质中均有检测到；异绿原酸C的含量如图 9所示，17份烟草种质的含量均低于20 mg/ kg，以广烟127含量最高（19.80 mg/kg），其次是CV099、S20大牛舌，全部晒烟以及9份烤烟种质中均有检测到，与异绿原酸A相似，只有广烟125和黄坑7号-1烤烟种质中未检测到。以上结果表明，异绿原酸B在所选6份晒烟烟草种质中均未检测到，广烟125和黄坑7号-1烤烟中均未检测到异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C，17份烟草种质中这3种活性成分的含量与前3种相比，大多较低。

综上可以看出，绿原酸是6种异构体中含量最高的，在17份烟草种质中均有检测到，其次是隐绿原酸和新绿原酸，而异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C的含量总体偏低，其中异绿原酸A和异绿原酸C在15份种质中均有检测到，异绿原酸B在多数烤烟种质中检测到，但在全部晒烟中均未检测到。

2.4　芦丁含量分析

如图 10所示，芦丁以NC347烤烟的含量最高（46.456 g/kg），其次是S19大肩叶（7.782 g/ kg）和S17大都青梗晒烟（6.250 g/kg），而云烟87烤烟最低（1.206 g/kg）；含量高于3 g/kg的烤烟和晒烟种质分别有3份和6份，分别占27.3% 和100%。可见，不同烤烟种质中芦丁的含量差异较大，含量范围为1.206~46.456 g/kg，而不同晒烟种质中芦丁的含量差异比烤烟稍小，为3.269~7.782 g/kg。

2.5　茄尼醇含量分析

如图 11所示，茄尼醇以NC347烤烟中的含量最高（44.913 g/kg），其次是K326烤烟（11.140 g/kg）、S17大都青梗晒烟（9.844 g/kg），而黄坑7号-1烤烟中最低（2.793 g/kg）。含量高于3 g/kg的烤烟和晒烟种质分别有9份和5份，分别占所测资源的81.8% 和83.3%。可见，不同烤烟种质中茄尼醇的含量差异较大，含量范围为2.793~44.913 g/kg，而不同晒烟资源中茄尼醇的含量差异也相对较小，为2.857~9.844 g/kg。

3　讨论 3.1　绿原酸、芦丁的含量差异

绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸生成的缩酚酸，在6种绿原酸异构体中，绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸均为单咖啡酰奎宁酸，异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C均为二咖啡酰奎宁酸。Meinhart等^[25]分析了巴西100种商业化种植植物中6种绿原酸异构体的含量，其中绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸分别在66、63、52种植物中检测出，而异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C分别在55、48、48种植物中检测出。该研究表明，绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸在多数植物中都能检测到，但也有多种植物检测不到异绿原酸B和异绿原酸C，与本研究结果相似。在咖啡中，3种单咖啡酰奎宁酸的浓度相对较高^[26]，单咖啡酰奎宁酸约占生咖啡豆质量的10%^[27]，其中以绿原酸的含量最为丰富^[6]。咖啡和金银花是绿原酸异构体含量均较高的两种植物。董珊等^[24]的研究表明，咖啡和金银花中6种绿原酸异构体的含量均相对较高，其中金银花以绿原酸含量最高、为1.94×10⁴ mg/kg，其次是异绿原酸A和异绿原酸C，分别为6.42×10³、2.00×10³ mg/kg；咖啡中绿原酸和隐绿原酸含量接近，分别为8.34×10³和8.48×10³ mg/kg，其次是新绿原酸、为4.99×10³ mg/kg。马跃新等^[28]发现滇金银花中绿原酸含量为24.79~34.01 mg/g。在烟草中，绿原酸含量与烟草的香气密切相关，因而与烟草及其制品的等级呈正相关，绿原酸含量高的烟叶及卷烟质量越好；绿原酸还对烟草的生长发育、烟叶颜色以及烟株抗病虫害、抗寒及其他逆境等方面有着重要影响^{[9, 29]}。欧阳璐斯等^[30]研究发现，烟草中14种多酚类化合物的含量差异较大，以绿原酸的含量最高、为3 828.3~9 251.6 mg/kg，新绿原酸、隐绿原酸含量分别为794.8~1 628.9、1 215.7~2 505.2 mg/kg。本研究结果表明，绿原酸在其6种异构体中含量最高，这与史春云等^[7]、李力等^[8]、Magaña等^[6]、欧阳璐斯等^[30]的研究结果一致；其次是隐绿原酸和新绿原酸，与李力等^[8]的研究结果一致。本研究中，17份烟草种质中K326烤烟的绿原酸含量最低，这与万诚等^[9]的研究结果即烤烟类型品种K326的绿原酸含量最高（28.544 mg/g）相差较大，这种差异可能主要与各烟草种质在现蕾后未打顶有关，烟草在现蕾后转入生殖生长，消耗较多的营养，造成烟叶品质下降，而绿原酸含量与改善烟叶等级密切相关^[31]。

芦丁和绿原酸同属于多酚类化合物，前人的研究中通常同时检测两种化合物。史春云等^[7]、李力等^[8]和欧阳璐斯等^[30]的研究结果显示，烟草多酚类物质中，芦丁的含量仅次于绿原酸，含量范围分别为5.73~14.88、2.61~7.87、2 825.9~ 6 412.6 mg/kg。本研究中，NC347烤烟中芦丁的含量最高，比史春云等^[7]报道的最高含量高约32 g/kg，其他16份烟草种质的含量范围与欧阳璐斯等^[30]和李力等^[8]的结果趋于一致。然而，本研究中芦丁与绿原酸的含量相比整体偏高，这与前人研究报道有较大差异。也有其他作物中芦丁含量比较高的报道，如Vollmannová等^[32]研究了不同荞麦品种叶片中芦丁、牡荆素、槲皮素、山奈酚等化合物的含量，其中芦丁的含量最高，为17.742~31.069 mg/g，含量最高的荞麦品种Kasho-2与NC347烤烟较接近。

3.2　茄尼醇的含量差异

茄尼醇是烟草石油醚、环己烷提取物的主要组成成分。烟草石油醚、环己烷提取物被认为是烟草香气成分的重要来源，也是烟气有害成分的贡献者，是烟叶质量评价的主要指标^[15]。根据前人的研究报道，烟草中茄尼醇的含量为0.3%~4.13%^{[10-11, 18]}。本研究中，NC347烤烟中茄尼醇的含量最高，质量分数为4.49%，比前人报道的4.13% 高0.36%，该种质在资源鉴评方面值得深入研究；其他16份烟草种质的质量分数为0.28%~1.11%，与前人的结果基本一致。本研究11份烤烟和6份晒烟种质中，茄尼醇含量高于5 g/kg的分别有6份和3份，说明所测烤烟类种质的茄尼醇含量较高，与刘宇欣等^[12]的结果类似，而且与所测种质绿原酸的含量相比也整体偏高。

4　结论

本研究17份繁种用烟草种质资源中，芦丁和茄尼醇的含量与绿原酸相比总体较高，且均以NC347烤烟的含量最高，质量分数分别为4.65% 和4.49%，该种质值得进一步研究，可以作为芦丁和茄尼醇开发利用的候选种质。绿原酸在其6种异构体中含量最高，且以S16打宾柳叶烟晒烟最高、为0.48 %，但17份烟草种质的绿原酸含量与前人报道的结果相差较大，由于这些种质在现蕾后未打顶，可能对绿原酸有较大的影响，下一步需要明确打顶与不打顶条件下各种质中绿原酸的差异。