2021, Vol. 48文章信息
引用本文 |
基金项目
- 国家重点研发计划项目（2017YFD0101904）
作者简介
- 刘开（1994—），女，在读硕士生，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail：1603591859@qq.com.
通讯作者
- 曹必好（1970—），男，博士，教授，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail：caobh01@scau.edu.cn.
文章历史
- 收稿日期：2020-12-24
2. 华南农业大学农学院, 广东 广州 510642
2. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
【研究意义】茄子（Solanum melongena L.）是茄科茄属常见的蔬菜作物，起源于东南亚的热带地区，在我国南北各地广泛栽培，其根、茎、叶皆可入药，果实中富含蛋白质、脂肪、维生素、龙葵碱和多种微量元素，既可用作蔬食，又具有降血压、防治胃癌等功效[1]，营养价值与药用价值极高。青枯病是茄子栽培中常见的细菌性土传病害之一，其致病因子是青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），主要从根部侵入寄主植物的维管束部位并迅速扩散到地上部组织，对植株可造成毁灭性的破坏[2]。土温20 ℃左右时为茄子青枯病的发病高峰期，微酸性土壤、连作以及气温急剧上升等都会导致青枯病严重发生[3]。我国茄子青枯病发生较为普遍，发病时严重影响茄子的产量和品质，导致茄子大面积减产减收[3]。但茄子抗青枯病的分子机理十分复杂，涉及多种因子调控，迄今仍未研究清楚。因此，深入开展茄子抗青枯病的相关研究显得尤为重要。
【前人研究进展】植物WRKY转录因子是一种具有多功能调控作用的转录因子，最早是从甘薯〔Dioscorea esculenta（Lour.）Burkill〕的SPF1基因中被鉴定出来的，因参与调控甘薯中的糖信号转导过程而备受关注[4]。之后，陆续从野燕麦（Avena fatua L.）、欧芹〔Petroselinum crispum（Mill.）Hill〕和水稻（Oryza sativa L.）的基因中成功鉴定出相应的WRKY 基因，并详细阐明了其在植物生长发育、信号转导及其抗逆过程中发挥的重要作用[5-7]。近年来，关于WRKY转录因子响应生物胁迫及非生物胁迫相关过程的研究多有报道[8]。研究发现，小麦TaWRKY2 和陆地棉GhWRKY33 基因是响应干旱调节的关键基因，过表达TaWRKY2 和GhWRKY33 基因能够分别增强小麦和转基因拟南芥植株的抗旱性[9-10]；决登伟等[11]发现，玉米ZmWRKY25-like 基因在响应盐胁迫和低温胁迫中上调表达；Sun等[12]认为，山葡萄VaWRKY33 基因在低温胁迫下诱导表达以增强植株的耐寒性。进一步研究发现，WRKY转录因子在调控植物抗病性方面起关键作用。周茜茜等[13]研究发现，苹果MdWRKY40 基因通过介导水杨酸（Salicylic acid，SA）信号途径正向调控苹果对轮纹病菌的抗性；龙琴等[14]认为，过表达CsWRKY61 能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径，增强柑橘对溃疡病的抗性；殷丽华等[15]研究发现，小豆VaWRKY33 基因能够响应豇豆单胞锈菌的诱导上调表达，并明显提高小豆锈病的抗性；在拟南芥抗病性研究中发现，拟南芥AtWRKY61 和AtWRKY70 基因分别正向调控芜菁皱叶病毒和丁香假单胞菌的抗性[16-17]；王丹等[18]研究发现，VqWRKY53 通过促进SA和芪类物质的合成，可增强中国野生毛葡萄植株的抗病性。
【本研究切入点】目前已有研究在茄属植物欧白英（Solanum dulcamara）的基因组中克隆得到WRKY 基因，并对其相应的生物信息学功能进行了分析[19]，但与茄子青枯病抗性相关的研究仍鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究通过克隆与茄子青枯病抗性相关的SmWRKY65 基因，对其进行生物信息学、亚细胞定位及时空表达模式分析，并以清水和pTRV2 空载为对照，构建pTRV2-SmWRKY65 载体，探究SmWRKY65 在茄子抗病植株（E-31）中沉默后对茄子青枯病的响应情况，以期为茄子青枯病抗病机理的相关研究提供理论基础，为茄子青枯病抗性品种的选育提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料茄子抗病材料（S. melongena L. E-31，R）和感病材料（S. melongena L. E-32，S）由曹必好教授提供。青枯菌致病菌株从感病材料中分离得到，VIGS载体构建所需的烟草脆裂病毒载体pTRV-1 和pTRV-2 由华南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室保存，DH5α大肠杆菌转化菌株和GV3101转农杆菌菌株均购自生工生物科技有限公司。
RNA提取试剂盒Trizol购自北京华越洋生物科技有限公司，PCR反应试剂盒2×HiFiTaq PCR StarMix、快速DNA胶回收试剂盒StarPrep和快速质粒小提试剂盒StarPrep均为GenStar产品，反转录试剂盒HiScript®Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR和实时荧光定量PCR试剂盒a SYBR Premix Ex Taq kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 茄子不同组织部位总RNA的提取与cDNA的合成 在茄子幼苗三叶期时分别采集茄子根、茎、叶部位的样品，用锡箔纸包裹并迅速放入液氮中，每个样品3次重复并做好标记，之后采用Trizol试剂盒的方法分别提取茄子根、茎、叶的RNA，并采用HiScript®Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR试剂盒进行逆转录反应合成cDNA，详细步骤参照说明书。cDNA合成PCR反应体系10 μL，反应程序为：25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min。
1.2.2 SmWRKY65 序列的获得与基因克隆 本课题组前期通过转录组测序得到WRKY65 基因序列（登录号：Sme2.5_00423.1_g00013.1）。利用Primer 5.0软件设计引物（SmWRKY65-F、SmWRKY65-R，表 1），以茄子叶片cDNA为模板通过PCR（10 μL体系）扩增得到SmWRKY65基因序列。PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，32个循环；72 ℃延伸5 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的特异性，将条带明亮、大小与预期一致的条带采用StarPrep快速DNA胶回收试剂盒进行纯化。
1.2.3 SmWRKY65 的生物信息分析 利用ExPASy ProtParam tool（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）对SmWRKY65蛋白理化性质进行分析；使用ProtScale（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）和SOPM工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=np-sa_sopma.html）分别预测SmWRKY65蛋白亲/疏水性和二级结构类型；使用NCBI CD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）和PredictProtein工具（http://www.predictprotein.org/）对SmWRKY65蛋白序列进行二级结构的结构域和结合位点预测；通过NCBI Blast在线比对工具，检索SmWRKY65 同源性基因，将相似性较高的同源性序列下载后，利用MEGA 7.0软件UPGMA法构建进化树。
1.2.4 PCR产物的连接与SmWRKY65质粒的提取 将上述1.2.2中的PCR产物连接pMD 19-T载体（pMD 19-T载体: Solution I : 回收产物=0.5 μL : 4.5 μL : 5 μL），之后转化大肠杆菌感受态DH5α，用pMD19-T通用引物检测阳性菌落，委托广州擎科生物技术有限公司进行测序，确定重组子。挑取重组子进行扩摇，采用StarPrep快速质粒小提试剂盒提取SmWRKY65质粒，具体步骤参照说明书。
1.2.5 SmWRKY65 的时空表达模式分析 利用Primer 5.0软件设计SmWRKY65 荧光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表 1），以茄子内参18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表 1）为对照，采用a SYBR Premix Ex Taq Kit试剂盒对茄子根、茎、叶组织进行SmWRKY65 实时荧光定量（qRT-PCR）表达量的测定，详细步骤参照说明书。再分别以茄子抗病和感病植株为材料，在茄子苗3叶期接种青枯病菌以分析SmWRKY65 在茄子抗病和感病植株中的表达情况，并在接种后0、3、6、9 h 4个时间段分别采集抗病、感病植株叶片，以茄子内参18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表 1）为对照，采用SmWRKY65 荧光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表 1）进行qRT-PCR表达量的测定，以分析SmWRKY65 在抗病和感病材料中的表达量差异。qRT-PCR程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸35 s，35个循环。每个样品3次生物学重复，最后取平均值进行分析，基因的相对表达量应用2-ΔΔCt方法进行分析[20]。
1.2.6 构建亚细胞定位载体及转化洋葱 利用Primer 5.0软件设计SmWRKY65 亚细胞定位引物（SmWRKY65-GFP-EB-F、SmWRKY65-GFPEB-R，表 1），通过PCR反应克隆SmWRKY65亚细胞定位目的片段。使用EcoR I和BamH I酶对亚细胞定位载体pC018和目的片段进行双酶切并连接成重组质粒SmWRKY65-GFP，测序后将重组质粒转入农杆菌GV3101，转化洋葱内表皮组织，3 d后在显微镜下观察亚细胞定位结果。
1.2.7 VIGS载体的构建 通过在线工具（vigs. solgenomics.net）寻找特异性的VIGS载体区域，根据pTRV2 载体多克隆位点所包含的酶切位点，设计1对特异性引物（pTRV2-WRKY65-F、pTRV2-WRKY65-R，表 1），以茄子叶片cDNA为模板进行PCR反应获得长度为250 bp左右的特异性PCR产物，用双酶切（EcoR I和BamH I）法将产物片段连接到pTRV2 载体上，之后转入大肠杆菌DH5α，阳性单菌落进行PCR菌落筛选，送广州擎科生物科技有限公司测序，确定重组子。将阳性单菌落进行扩摇，提取重组质粒（pTRV2- SmWRKY65）后转入农杆菌GV3101用于侵染。
1.2.8 农杆菌侵染茄子幼苗 将抗病和感病茄子种子分别播种在含泥炭和珍珠岩的混合基质中，于25 ℃、16 h光照和8 h黑暗的培养室中进行培养。当茄子幼苗长至3~4片真叶时，吸取含有重组质粒（pTRV2-SmWRKY65）的阳性菌落扩摇后配制成侵染液，并将分离到的青枯菌采用伤根断根法对茄子幼苗进行侵染，青枯菌的分离与接种参照曹必好等[21]的方法，每组15株，3次重复，之后在16 ℃、60 % 的相对湿度下暗处理1 d，随后置于培养室中生长。3 d后采用断根法接种青枯病菌，观察其表型变化并拍照，2周后调查统计病情指数，方法参照Chen等[22]，之后通过qRT-PCR法测定pTRV2-SmWRKY65 沉默植株表达量。
试验数据采用SPSS Statistics 17.0进行t 检验，采用Excel 2010制图。
2 结果与分析 2.1 SmWRKY65基因的克隆以茄子叶片cDNA为模板，通过PCR扩增得到948 bp的SmWRKY65 片段，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示目的条带与预期结果一致（图 1），将目的条带切胶回收、纯化、测序。对SmWRKY65 测序序列与WRKY65 原始序列（登录号：Sme2.5_00423.1_g00013.1）在DNAMAN 8.0工具上进行比对，结果显示同源性为88.06%，表明在茄子中成功克隆了SmWRKY65（图 2）。
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| 图 1 SmWRKY65电泳结果 Fig. 1 Electropherogram result of SmWRKY65 M：DNA Marker DL2000；1：SmWRKY65 电泳条带 M: DNA Marker DL2000; 1: SmWRKY65 electrophoresis band |
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| 图 2 SmWRKY65序列比对结果 Fig. 2 Comparison result of SmWRKY65 sequences |
2.2 SmWRKY65蛋白的生物信息学分析
SmWRKY65蛋白理化性质分析结果显示，该基因开放阅读框为834个核苷酸序列，编码277个氨基酸残基，蛋白相对分子量大小为30 155.21 ku，等电点为5.51，分子式为C1304H1998N30O430S13，原子总量为4 115，预测该蛋白属于亲水性蛋白。对SmWRKY65蛋白的二级结构进行预测，结果显示，其主要由不规则盘绕结构（72.92%）、α-螺旋（12.27%）、延伸链（11.91%）和β-转角（2.89%）等结构元件组成（图 3）。预测该蛋白属于WRKY家族，在71~131区域具有1个含60个氨基酸的WRKY保守域，可以特异结合DNA序列（T）（T）TGAC（C/T），具有DNA结合位点3个、蛋白结合位点3个、核苷酸多肽链结合位点2个、大分子结合区域7个，主要多集中在WRKY家族的保守结构域内，预测该基因定位于细胞核中（图 4）。通过NCBI上Blast在线比对工具，将检索到的12条与SmWRKY65 同源性较高的基因进行多序列比对，使用MEGA 7.0.21软件构建进化树，结果表明，茄子SmWRKY65 与马铃薯、番茄的WRKY65同源性最高（图 5）。
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| 图 3 SmWRKY65蛋白二级结构预测 Fig. 3 Secondary structure prediction of SmWRKY65 protein h：α-螺旋；e：延伸链；c：不规则盘绕结构；t：β-转角 h: α-helix; e: Extended strand; c: Random coil structure; t: β-turn |
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| 图 4 SmWRKY65蛋白结合位点和亚细胞定位预测 Fig. 4 Binding sites and subcellular localization prediction of SmWRKY65 protein |
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| 图 5 SmWRKY65同源进化树分析 Fig. 5 Analysis of homologous tree of SmWRKY65 |
2.3 SmWRKY65的时空表达模式和亚细胞定位分析
以茄子叶片cDNA为模板，通过PCR检测SmWRKY65 荧光定量引物的特异性，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在250 bp左右有1条明亮且符合预期的条带（图 6A），说明引物特异性较好，可用于后续试验。对茄子根、茎、叶不同组织部位表达量的分析结果显示，SmWRKY65 在茄子根组织部位中的表达量最高，在叶中的表达量次之，茎中最低（图 6B）。在茄子苗期接种青枯病菌后0、3、6、9 h 4个时间段分别采集抗病、感病植株叶片进行实时荧光定量分析，结果表明，SmWRKY65 在抗病和感病材料中的表达量均随接种时间延长逐渐升高，9 h时达到最高，且在抗病材料中的表达水平明显高于在感病材料中的表达水平（图 6C），说明SmWRKY65 响应茄子青枯病抗性相关基因的表达。
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| 图 6 茄子不同组织及抗感病植株中SmWRKY65的表达分析 Fig. 6 SmWRKY65 expression of different tissues and disease-resistant and disease-susceptible plants of eggplant M：DNA Marker DL2000；1：SmWRKY65 荧光定量 PCR 产物；R：抗病型茄子（E-31）；S：感病型茄子（E-32）；bw：接种青枯病 M: DNA Marker DL2000; 1: Fluorescence quantitative PCR products of SmWRKY65; R: Disease-resistant eggplants（E-31）; S: Disease-susceptible eggplants; bw: Bacterial wilt inoculation |
使用EcoR I和BamH I酶对亚细胞定位载体pC018和亚细胞定位引物成功克隆出的PCR片段进行双酶切，并连接成大小为831 bp的重组质粒SmWRKY65-GFP（图 7A），将重组质粒转化农杆菌后转化洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察到SmWRKY65 定位在细胞核中表达（图 7B），这与预测结果一致。
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| 图 7 SmWRKY65亚细胞定位分析 Fig. 7 Subcellular localization analysis of SmWRKY65 M：DNA Marker DL2000；1：SmWRKY65-GFP 电泳条带 M: DNA Marker DL2000; 1: SmWRKY65-GFP electrophoretic bands |
2.4 SmWRKY6 沉默在抗病茄子中响应青枯病的情况
2.4.1 pTRV2-SmWRKY65 载体构建结果 以茄子叶片为材料提取RNA并通过逆转录反应合成cDNA，再以cDNA为模板，利用构建VIGS载体所设计的特异性引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳显示，获得长度为242 bp的PCR产物（图 8A），将产物片段和pTRV2载体同时用EcoR I和BamH I进行双酶切后成功将SmWRKY65 连接到pTRV2 载体上获得重组质粒，经测序保证连接片段和读码方向正确后转入农杆菌GV3101。从阳性菌落检测结果来看，与pTRV2（图 8B1）空载相比，pTRV2-SmWRKY65（图 8B2）载体构建成功。
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| 图 8 pTRV2-SmWRKY65载体构建 Fig. 8 pTRV2-SmWRKY65 vector construction M：DNA Marker DL2000；A1：SmWRKY65 特异性片段；B1：pTRV2 空载；B2：pTRV2-SmWRKY65 M: DNA Marker DL2000; A1: SmWRKY65 specific fragment; B1: pTRV2 control vector; B2: pTRV2-SmWRKY65 vector |
2.4.2 青枯病菌接种VIGS沉默植株 为了验证pTRV2-WRKY65 沉默植株对茄子青枯病的响应情况，在3~4片真叶时，对茄子抗病植株接种青枯病病原菌。接种7 d后观察到接种清水的叶片均没有表现出明显的萎蔫症状，接种pTRV2 空载的植株仅有1片叶片出现萎蔫，而接种pTRV2- WRKY65 的15株植株几乎全部表现出萎蔫症状；接种2周后，对pTRV2-WRKY65 植株进行病情指数调查，结果（表 2）表明，SmWRKY65 基因被沉默后影响了抗病材料对青枯病的抵御能力，即表现为感病症状。pTRV2-SmWRKY65 实时荧光定量检测结果（图 9）显示，与清水和pTRV2 空载相比，pTRV2-SmWRKY65 表达量明显下降。
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| 图 9 VIGS沉默植株的表型（A）及qRT-PCR分析（B） Fig. 9 Phenotype(A)and qRT-PCR analysis(B)of VIGS silent plants * 表示差异显著 * represents significant difference |
3 讨论
茄子是我国南北各地广泛栽培的夏秋季重要蔬菜之一，在我国的栽培历史悠久，种植面积大，具有较高的营养价值和经济价值。但茄子易受青枯病侵袭，尤其在我国南方地区，其病原菌适应性强、分布广泛、繁殖速度较快，常规方法难以有效防治，而抗病育种可以有效防御病菌的危害，能较大幅度提高茄子的产量和品质[2, 23]。近年来，研究人员在提高茄子青枯病抗性及抗病品种选育方面作了较多努力。邵欣欣[24]在茄子青枯病抗性研究中发现，ERF转录因子参与调控茄子抗青枯病的信号途径；肖熙鸥等[25]研究认为，SA信号途径中MAPK6、MKK2、NPR1、PAD4等基因能够正向调控茄子青枯病的抗性；李威等[26]研究发现，1.5~2.0 mmol/L的硅浓度处理可有效提高快圆茄青枯病的抗性；Qiu等[27]认为，过表达SmMYB44 可诱导茄子中亚精胺相关基因（SmSPDS）的表达，促进亚精胺的合成与积累，从而增加对茄子青枯病的抗性。此外，广州市农业科学研究院经过多年研究选育出的翡翠绿2号青茄新品种在大田抗病性鉴定中表现为中抗青枯病[28]，与广东省农业科学院植物保护研究所联合选育出的紫荣6号和玫瑰紫花茄均为抗青枯病的优质茄子新品种[29-30]。
研究表明，在生物胁迫下，植物体内会通过信号传导途径和防御反应作出应激防卫，而转录因子在这一系列反应中起关键作用[31]。近年来有关WRKY转录因子在植株抗病性上的研究成为一个热门话题[32]。已有研究报道，WRKY转录因子涉及调控与青枯病抗性相关的信号转导过程。王鹏飞等[33]研究发现，野生花生AdWRKY37 基因在受到青枯病菌液胁迫诱导后表达量明显升高，并推测该基因可能通过介导水杨酸（Salicylic acid，SA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途径参与青枯病抗病相关过程的调控；Dang等[34]认为，CaWRKY27转录因子通过调节SA、JA和内皮素（Endothelin，ET）介导的信号通路，可增强烟草对青枯菌的抗性；Liu等[35]发现，在烟草中过表达NtWRKY50 能够促进SA合成，从而增强植株对青枯病的抗性；Dang等[36]在辣椒抗病育种的研究中发现，CaWRKY41转录因子能够提高辣椒对青枯菌的抗性。然而，有关WRKY转录因子在茄子青枯病抗性中的相关研究还鲜见报道。本研究以茄子叶片cDNA为模板成功克隆了SmWRKY65 基因，与茄子数据库中原始WRKY65 序列比对同源性为88.06%，序列差异性的产生可能与PCR扩增过程中单核苷酸碱基变异及引物二聚体的形成有关。实时荧光定量分析结果表明，SmWRKY65 在茄子抗病和感病植株中均响应青枯病的诱导，其表达量在接种青枯病菌后0、3、6、9 h 4个时间点不断升高，且SmWRKY65 在茄子抗病材料中的表达水平明显高于感病材料，说明SmWRKY65 可能涉及茄子青枯病抗病的调节过程。在抗病茄子（E-31）植株中接种青枯菌的分析结果显示，与清水和pTRV2 空载相比，SmWRKY65 沉默植株表现出明显的萎蔫、易感症状，且qT-PCR分析表明SmWRKY65 在茄子中的表达量较清水和pTRV2 空载明显降低，这表明SmWRKY65 沉默后可能抑制了茄子青枯病抗病信号途径中相关基因的表达，从而降低了茄子植株对青枯病原菌的抗性。
4 结论本研究成功克隆了SmWRKY65 基因，与茄子数据库中原始WRKY65 序列的同源性为88.06%，该基因开放阅读框为834个核苷酸序列，编码277个氨基酸残基，在71~131区域包含1个含60个氨基酸的WRKY保守域，定位于细胞核中，与马铃薯、番茄WRKY65 的同源性最高。时空表达分析发现，SmWRKY65 在茄子根组织中的表达量最高，叶中次之，茎中最低。实时荧光定量PCR分析发现，SmWRKY65 在茄子抗病和感病材料中均响应青枯病菌的诱导上调表达，且在抗病材料中的表达水平明显高于感病材料；VIGS结果表明，接种pTRV2-SmWRKY65 植株的叶片表现出明显的萎蔫症状，结合qRT-PCR分析发现，pTRV2-SmWRKY65 表达量较对照明显下降，表明SmWRKY65 沉默后茄子抗青枯病的能力下降，说明SmWRKY65 可能涉及茄子青枯病抗病相关过程的调控。
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