广东农业科学  2021, Vol. 48 Issue (3): 42-52   DOI: 10.16768/j.issn.1004-874X.2021.03.006.
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文章信息

引用本文
刘开, 余炳伟, 李丹丹, 陈娜, 曹必好. 茄子SmWRKY65基因克隆及其对青枯病的抗性分析[J]. 广东农业科学, 2021, 48(3): 42-52.   DOI: 10.16768/j.issn.1004-874X.2021.03.006
LIU Kai, YU Bingwei, LI Dandan, CHEN Na, CAO Bihao. Cloning of SmWRKY65 Gene and Its Resistance to Bacterial Wilt in Eggplant[J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2021, 48(3): 42-52.   DOI: 10.16768/j.issn.1004-874X.2021.03.006

基金项目

国家重点研发计划项目(2017YFD0101904)

作者简介

刘开(1994—),女,在读硕士生,研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术,E-mail:1603591859@qq.com.

通讯作者

曹必好(1970—),男,博士,教授,研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术,E-mail:caobh01@scau.edu.cn.

文章历史

收稿日期:2020-12-24
茄子SmWRKY65基因克隆及其对青枯病的抗性分析
刘开1 , 余炳伟1 , 李丹丹2 , 陈娜1 , 曹必好1     
1. 华南农业大学园艺学院, 广东 广州 510642;
2. 华南农业大学农学院, 广东 广州 510642
摘要:【目的】 通过克隆SmWRKY65Solanum melongena L. WRKY65)基因并分析其生物信息学与功能,以期探究SmWRKY65 对茄子青枯病的响应情况。【方法】 以茄子抗病植株(E-31)为试验材料、叶片cDNA为模板,通过PCR技术获得SmWRKY65 基因,并利用ExPASy ProtParam tool对其进行生物信息学分析。运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的方法对其不同组织部位与抗病、感病材料(E-32)中的响应情况进行分析;通过双酶切法构建亚细胞定位载体;运用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术构建pTRV2-SmWRKY65 载体并侵染茄子抗病植株。【结果】 在茄子中成功克隆了SmWRKY65 基因,该基因开放阅读框为834个核苷酸序列,编码277个氨基酸残基,在71~131区域具有1个含60个氨基酸的WRKY保守域,定位于细胞核中。时空表达分析发现,SmWRKY65 在茄子根组织中的表达量最高,叶中次之,茎中最低;qRT-PCR分析表明,SmWRKY65 在茄子抗病和感病材料中均响应青枯病菌的诱导上调表达;VIGS结果表明,与清水和pTRV2 空载对照相比,接种青枯病菌后,pTRV2-SmWRKY65 沉默植株的叶片表现出明显的萎蔫症状,结合qRT-PCR分析发现,pTRV2-SmWRKY65 表达量较对照组明显下降。【结论】 SmWRKY65在茄子抗病材料中的表达水平明显高于感病材料,且pTRV2-SmWRKY65 植株与对照相比表现为易感症状,说明SmWRKY65 沉默后茄子抗青枯病的能力下降,表明SmWRKY65 可能涉及茄子青枯病抗性相关过程的调控。
关键词茄子    青枯病    WRKY转录因子    实时荧光定量PCR    VIGS    
Cloning of SmWRKY65 Gene and Its Resistance to Bacterial Wilt in Eggplant
LIU Kai1 , YU Bingwei1 , LI Dandan2 , CHEN Na1 , CAO Bihao1     
1. College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
2. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: 【Objective】 The response of SmWRKY65(Solanum melongena L. WRKY65)to bacterial wilt of eggplant was explored by cloning SmWRKY65 gene and analyzing its bio-information and function. 【Method】 The eggplant disease-resistant plants(E-31)and cDNA from its leaves were used as tested materials and template, respectively. The SmWRKY65 was obtained by PCR technology and bioinformatics analysis was constructed by ExPASy ProtParam tool. The expression analysis of different tissue sites and disease-resistant and susceptible materials(E-32)was performed by quantitative real-time PCR(qRT-PCR)method. Subcellular localization vector was constructed by double digestion method. The pTRV2-SmWRKY65 vector was constructed by virus induced gene silencing(VIGS)technology and the disease-resistant eggplant plants were infected. 【Result】 The SmWRKY65 gene was successfully cloned in eggplant. The gene contains 834 bp nucleotide sequences, codes 277 amino acid residues in its open reading frame, and concludes a WRKY conserved domain containing 60 amino acid in the regions of 71-131. The analysis of subcellular localization showed that SmWRKY65-GFP fusion protein was found in the cell nucleus. The expression analysis of different tissues revealed that SmWRKY65 had highest expression in eggplant roots, followed by leaves and stems. The qRT-PCR analysis testified that SmWRKY65 was up-regulated in response to the induction of bacterial wilt in eggplant resistant and susceptible plants. The VIGS results showed that the leaves of pTRV2-SmWRKY65 silent plants was observed clear wilting symptoms when compared with water and pTRV2 control vector. By qRT-PCR profiling, it was observed that pTRV2-SmWRKY65 expression was obviously decreased when compared with control groups. 【Conclusion】 The expression level in disease-resistant eggplant materials was significantly higher than that in susceptible materials, and the pTRV2-SmWRKY65 plants showed more symptoms of susceptibility when compared with control groups, indicating that the silence of SmWRKY65 reduced the resistance to bacterial wilt of eggplants and SmWRKY65 was possibly related to the process regulation of eggplant resistance to bacterial wilt.
Key words: eggplant    bacterial wilt    WRKY transcription factor    real-time fluorescence quantitative PCR    virus induced gene silencing(VIGS)    

【研究意义】茄子(Solanum melongena L.)是茄科茄属常见的蔬菜作物,起源于东南亚的热带地区,在我国南北各地广泛栽培,其根、茎、叶皆可入药,果实中富含蛋白质、脂肪、维生素、龙葵碱和多种微量元素,既可用作蔬食,又具有降血压、防治胃癌等功效[1],营养价值与药用价值极高。青枯病是茄子栽培中常见的细菌性土传病害之一,其致病因子是青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum),主要从根部侵入寄主植物的维管束部位并迅速扩散到地上部组织,对植株可造成毁灭性的破坏[2]。土温20 ℃左右时为茄子青枯病的发病高峰期,微酸性土壤、连作以及气温急剧上升等都会导致青枯病严重发生[3]。我国茄子青枯病发生较为普遍,发病时严重影响茄子的产量和品质,导致茄子大面积减产减收[3]。但茄子抗青枯病的分子机理十分复杂,涉及多种因子调控,迄今仍未研究清楚。因此,深入开展茄子抗青枯病的相关研究显得尤为重要。

【前人研究进展】植物WRKY转录因子是一种具有多功能调控作用的转录因子,最早是从甘薯〔Dioscorea esculenta(Lour.)Burkill〕的SPF1基因中被鉴定出来的,因参与调控甘薯中的糖信号转导过程而备受关注[4]。之后,陆续从野燕麦(Avena fatua L.)、欧芹〔Petroselinum crispum(Mill.)Hill〕和水稻(Oryza sativa L.)的基因中成功鉴定出相应的WRKY 基因,并详细阐明了其在植物生长发育、信号转导及其抗逆过程中发挥的重要作用[5-7]。近年来,关于WRKY转录因子响应生物胁迫及非生物胁迫相关过程的研究多有报道[8]。研究发现,小麦TaWRKY2 和陆地棉GhWRKY33 基因是响应干旱调节的关键基因,过表达TaWRKY2GhWRKY33 基因能够分别增强小麦和转基因拟南芥植株的抗旱性[9-10];决登伟等[11]发现,玉米ZmWRKY25-like 基因在响应盐胁迫和低温胁迫中上调表达;Sun等[12]认为,山葡萄VaWRKY33 基因在低温胁迫下诱导表达以增强植株的耐寒性。进一步研究发现,WRKY转录因子在调控植物抗病性方面起关键作用。周茜茜等[13]研究发现,苹果MdWRKY40 基因通过介导水杨酸(Salicylic acid,SA)信号途径正向调控苹果对轮纹病菌的抗性;龙琴等[14]认为,过表达CsWRKY61 能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径,增强柑橘对溃疡病的抗性;殷丽华等[15]研究发现,小豆VaWRKY33 基因能够响应豇豆单胞锈菌的诱导上调表达,并明显提高小豆锈病的抗性;在拟南芥抗病性研究中发现,拟南芥AtWRKY61AtWRKY70 基因分别正向调控芜菁皱叶病毒和丁香假单胞菌的抗性[16-17];王丹等[18]研究发现,VqWRKY53 通过促进SA和芪类物质的合成,可增强中国野生毛葡萄植株的抗病性。

【本研究切入点】目前已有研究在茄属植物欧白英(Solanum dulcamara)的基因组中克隆得到WRKY 基因,并对其相应的生物信息学功能进行了分析[19],但与茄子青枯病抗性相关的研究仍鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究通过克隆与茄子青枯病抗性相关的SmWRKY65 基因,对其进行生物信息学、亚细胞定位及时空表达模式分析,并以清水和pTRV2 空载为对照,构建pTRV2-SmWRKY65 载体,探究SmWRKY65 在茄子抗病植株(E-31)中沉默后对茄子青枯病的响应情况,以期为茄子青枯病抗病机理的相关研究提供理论基础,为茄子青枯病抗性品种的选育提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

茄子抗病材料(S. melongena L. E-31,R)和感病材料(S. melongena L. E-32,S)由曹必好教授提供。青枯菌致病菌株从感病材料中分离得到,VIGS载体构建所需的烟草脆裂病毒载体pTRV-1pTRV-2 由华南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室保存,DH5α大肠杆菌转化菌株和GV3101转农杆菌菌株均购自生工生物科技有限公司。

RNA提取试剂盒Trizol购自北京华越洋生物科技有限公司,PCR反应试剂盒2×HiFiTaq PCR StarMix、快速DNA胶回收试剂盒StarPrep和快速质粒小提试剂盒StarPrep均为GenStar产品,反转录试剂盒HiScript®Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR和实时荧光定量PCR试剂盒a SYBR Premix Ex Taq kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 茄子不同组织部位总RNA的提取与cDNA的合成 在茄子幼苗三叶期时分别采集茄子根、茎、叶部位的样品,用锡箔纸包裹并迅速放入液氮中,每个样品3次重复并做好标记,之后采用Trizol试剂盒的方法分别提取茄子根、茎、叶的RNA,并采用HiScript®Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR试剂盒进行逆转录反应合成cDNA,详细步骤参照说明书。cDNA合成PCR反应体系10 μL,反应程序为:25 ℃,10 min;50 ℃,30 min;85 ℃,5 min。

1.2.2 SmWRKY65 序列的获得与基因克隆 本课题组前期通过转录组测序得到WRKY65 基因序列(登录号:Sme2.5_00423.1_g00013.1)。利用Primer 5.0软件设计引物(SmWRKY65-F、SmWRKY65-R,表 1),以茄子叶片cDNA为模板通过PCR(10 μL体系)扩增得到SmWRKY65基因序列。PCR反应程序:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s,32个循环;72 ℃延伸5 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的特异性,将条带明亮、大小与预期一致的条带采用StarPrep快速DNA胶回收试剂盒进行纯化。

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences

1.2.3 SmWRKY65 的生物信息分析 利用ExPASy ProtParam tool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)对SmWRKY65蛋白理化性质进行分析;使用ProtScale(http://ca.expasy.org/tools/protscale.html)和SOPM工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=np-sa_sopma.html)分别预测SmWRKY65蛋白亲/疏水性和二级结构类型;使用NCBI CD Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi)和PredictProtein工具(http://www.predictprotein.org/)对SmWRKY65蛋白序列进行二级结构的结构域和结合位点预测;通过NCBI Blast在线比对工具,检索SmWRKY65 同源性基因,将相似性较高的同源性序列下载后,利用MEGA 7.0软件UPGMA法构建进化树。

1.2.4 PCR产物的连接与SmWRKY65质粒的提取 将上述1.2.2中的PCR产物连接pMD 19-T载体(pMD 19-T载体: Solution I : 回收产物=0.5 μL : 4.5 μL : 5 μL),之后转化大肠杆菌感受态DH5α,用pMD19-T通用引物检测阳性菌落,委托广州擎科生物技术有限公司进行测序,确定重组子。挑取重组子进行扩摇,采用StarPrep快速质粒小提试剂盒提取SmWRKY65质粒,具体步骤参照说明书。

1.2.5 SmWRKY65 的时空表达模式分析 利用Primer 5.0软件设计SmWRKY65 荧光定量引物(q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R,表 1),以茄子内参18S rRNA(18S rRNA-F、18S rRNA-R,表 1)为对照,采用a SYBR Premix Ex Taq Kit试剂盒对茄子根、茎、叶组织进行SmWRKY65 实时荧光定量(qRT-PCR)表达量的测定,详细步骤参照说明书。再分别以茄子抗病和感病植株为材料,在茄子苗3叶期接种青枯病菌以分析SmWRKY65 在茄子抗病和感病植株中的表达情况,并在接种后0、3、6、9 h 4个时间段分别采集抗病、感病植株叶片,以茄子内参18S rRNA(18S rRNA-F、18S rRNA-R,表 1)为对照,采用SmWRKY65 荧光定量引物(q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R,表 1)进行qRT-PCR表达量的测定,以分析SmWRKY65 在抗病和感病材料中的表达量差异。qRT-PCR程序为:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸35 s,35个循环。每个样品3次生物学重复,最后取平均值进行分析,基因的相对表达量应用2-ΔΔCt方法进行分析[20]

1.2.6 构建亚细胞定位载体及转化洋葱 利用Primer 5.0软件设计SmWRKY65 亚细胞定位引物(SmWRKY65-GFP-EB-F、SmWRKY65-GFPEB-R,表 1),通过PCR反应克隆SmWRKY65亚细胞定位目的片段。使用EcoR I和BamH I酶对亚细胞定位载体pC018和目的片段进行双酶切并连接成重组质粒SmWRKY65-GFP,测序后将重组质粒转入农杆菌GV3101,转化洋葱内表皮组织,3 d后在显微镜下观察亚细胞定位结果。

1.2.7 VIGS载体的构建 通过在线工具(vigs. solgenomics.net)寻找特异性的VIGS载体区域,根据pTRV2 载体多克隆位点所包含的酶切位点,设计1对特异性引物(pTRV2-WRKY65-F、pTRV2-WRKY65-R,表 1),以茄子叶片cDNA为模板进行PCR反应获得长度为250 bp左右的特异性PCR产物,用双酶切(EcoR I和BamH I)法将产物片段连接到pTRV2 载体上,之后转入大肠杆菌DH5α,阳性单菌落进行PCR菌落筛选,送广州擎科生物科技有限公司测序,确定重组子。将阳性单菌落进行扩摇,提取重组质粒(pTRV2- SmWRKY65)后转入农杆菌GV3101用于侵染。

1.2.8 农杆菌侵染茄子幼苗 将抗病和感病茄子种子分别播种在含泥炭和珍珠岩的混合基质中,于25 ℃、16 h光照和8 h黑暗的培养室中进行培养。当茄子幼苗长至3~4片真叶时,吸取含有重组质粒(pTRV2-SmWRKY65)的阳性菌落扩摇后配制成侵染液,并将分离到的青枯菌采用伤根断根法对茄子幼苗进行侵染,青枯菌的分离与接种参照曹必好等[21]的方法,每组15株,3次重复,之后在16 ℃、60 % 的相对湿度下暗处理1 d,随后置于培养室中生长。3 d后采用断根法接种青枯病菌,观察其表型变化并拍照,2周后调查统计病情指数,方法参照Chen等[22],之后通过qRT-PCR法测定pTRV2-SmWRKY65 沉默植株表达量。

试验数据采用SPSS Statistics 17.0进行t 检验,采用Excel 2010制图。

2 结果与分析 2.1 SmWRKY65基因的克隆

以茄子叶片cDNA为模板,通过PCR扩增得到948 bp的SmWRKY65 片段,经1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示目的条带与预期结果一致(图 1),将目的条带切胶回收、纯化、测序。对SmWRKY65 测序序列与WRKY65 原始序列(登录号:Sme2.5_00423.1_g00013.1)在DNAMAN 8.0工具上进行比对,结果显示同源性为88.06%,表明在茄子中成功克隆了SmWRKY65图 2)。

图 1 SmWRKY65电泳结果 Fig. 1 Electropherogram result of SmWRKY65 M:DNA Marker DL2000;1:SmWRKY65 电泳条带 M: DNA Marker DL2000; 1: SmWRKY65 electrophoresis band

图 2 SmWRKY65序列比对结果 Fig. 2 Comparison result of SmWRKY65 sequences

2.2 SmWRKY65蛋白的生物信息学分析

SmWRKY65蛋白理化性质分析结果显示,该基因开放阅读框为834个核苷酸序列,编码277个氨基酸残基,蛋白相对分子量大小为30 155.21 ku,等电点为5.51,分子式为C1304H1998N30O430S13,原子总量为4 115,预测该蛋白属于亲水性蛋白。对SmWRKY65蛋白的二级结构进行预测,结果显示,其主要由不规则盘绕结构(72.92%)、α-螺旋(12.27%)、延伸链(11.91%)和β-转角(2.89%)等结构元件组成(图 3)。预测该蛋白属于WRKY家族,在71~131区域具有1个含60个氨基酸的WRKY保守域,可以特异结合DNA序列(T)(T)TGAC(C/T),具有DNA结合位点3个、蛋白结合位点3个、核苷酸多肽链结合位点2个、大分子结合区域7个,主要多集中在WRKY家族的保守结构域内,预测该基因定位于细胞核中(图 4)。通过NCBI上Blast在线比对工具,将检索到的12条与SmWRKY65 同源性较高的基因进行多序列比对,使用MEGA 7.0.21软件构建进化树,结果表明,茄子SmWRKY65 与马铃薯、番茄的WRKY65同源性最高(图 5)。

图 3 SmWRKY65蛋白二级结构预测 Fig. 3 Secondary structure prediction of SmWRKY65 protein h:α-螺旋;e:延伸链;c:不规则盘绕结构;t:β-转角 h: α-helix; e: Extended strand; c: Random coil structure; t: β-turn

图 4 SmWRKY65蛋白结合位点和亚细胞定位预测 Fig. 4 Binding sites and subcellular localization prediction of SmWRKY65 protein

图 5 SmWRKY65同源进化树分析 Fig. 5 Analysis of homologous tree of SmWRKY65

2.3 SmWRKY65的时空表达模式和亚细胞定位分析

以茄子叶片cDNA为模板,通过PCR检测SmWRKY65 荧光定量引物的特异性,经1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示在250 bp左右有1条明亮且符合预期的条带(图 6A),说明引物特异性较好,可用于后续试验。对茄子根、茎、叶不同组织部位表达量的分析结果显示,SmWRKY65 在茄子根组织部位中的表达量最高,在叶中的表达量次之,茎中最低(图 6B)。在茄子苗期接种青枯病菌后0、3、6、9 h 4个时间段分别采集抗病、感病植株叶片进行实时荧光定量分析,结果表明,SmWRKY65 在抗病和感病材料中的表达量均随接种时间延长逐渐升高,9 h时达到最高,且在抗病材料中的表达水平明显高于在感病材料中的表达水平(图 6C),说明SmWRKY65 响应茄子青枯病抗性相关基因的表达。

图 6 茄子不同组织及抗感病植株中SmWRKY65的表达分析 Fig. 6 SmWRKY65 expression of different tissues and disease-resistant and disease-susceptible plants of eggplant M:DNA Marker DL2000;1:SmWRKY65 荧光定量 PCR 产物;R:抗病型茄子(E-31);S:感病型茄子(E-32);bw:接种青枯病 M: DNA Marker DL2000; 1: Fluorescence quantitative PCR products of SmWRKY65; R: Disease-resistant eggplants(E-31); S: Disease-susceptible eggplants; bw: Bacterial wilt inoculation

使用EcoR I和BamH I酶对亚细胞定位载体pC018和亚细胞定位引物成功克隆出的PCR片段进行双酶切,并连接成大小为831 bp的重组质粒SmWRKY65-GFP图 7A),将重组质粒转化农杆菌后转化洋葱表皮细胞,在共聚焦显微镜下观察到SmWRKY65 定位在细胞核中表达(图 7B),这与预测结果一致。

图 7 SmWRKY65亚细胞定位分析 Fig. 7 Subcellular localization analysis of SmWRKY65 M:DNA Marker DL2000;1:SmWRKY65-GFP 电泳条带 M: DNA Marker DL2000; 1: SmWRKY65-GFP electrophoretic bands

2.4 SmWRKY6 沉默在抗病茄子中响应青枯病的情况

2.4.1 pTRV2-SmWRKY65 载体构建结果 以茄子叶片为材料提取RNA并通过逆转录反应合成cDNA,再以cDNA为模板,利用构建VIGS载体所设计的特异性引物进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳显示,获得长度为242 bp的PCR产物(图 8A),将产物片段和pTRV2载体同时用EcoR I和BamH I进行双酶切后成功将SmWRKY65 连接到pTRV2 载体上获得重组质粒,经测序保证连接片段和读码方向正确后转入农杆菌GV3101。从阳性菌落检测结果来看,与pTRV2图 8B1)空载相比,pTRV2-SmWRKY65图 8B2)载体构建成功。

图 8 pTRV2-SmWRKY65载体构建 Fig. 8 pTRV2-SmWRKY65 vector construction M:DNA Marker DL2000;A1:SmWRKY65 特异性片段;B1:pTRV2 空载;B2:pTRV2-SmWRKY65 M: DNA Marker DL2000; A1: SmWRKY65 specific fragment; B1: pTRV2 control vector; B2: pTRV2-SmWRKY65 vector

2.4.2 青枯病菌接种VIGS沉默植株 为了验证pTRV2-WRKY65 沉默植株对茄子青枯病的响应情况,在3~4片真叶时,对茄子抗病植株接种青枯病病原菌。接种7 d后观察到接种清水的叶片均没有表现出明显的萎蔫症状,接种pTRV2 空载的植株仅有1片叶片出现萎蔫,而接种pTRV2- WRKY65 的15株植株几乎全部表现出萎蔫症状;接种2周后,对pTRV2-WRKY65 植株进行病情指数调查,结果(表 2)表明,SmWRKY65 基因被沉默后影响了抗病材料对青枯病的抵御能力,即表现为感病症状。pTRV2-SmWRKY65 实时荧光定量检测结果(图 9)显示,与清水和pTRV2 空载相比,pTRV2-SmWRKY65 表达量明显下降。

表 2 VIGS沉默植株的病情指数统计 Table 2 Statistics of disease index of VIGS silent plants

图 9 VIGS沉默植株的表型(A)及qRT-PCR分析(B) Fig. 9 Phenotype(A)and qRT-PCR analysis(B)of VIGS silent plants * 表示差异显著 * represents significant difference

3 讨论

茄子是我国南北各地广泛栽培的夏秋季重要蔬菜之一,在我国的栽培历史悠久,种植面积大,具有较高的营养价值和经济价值。但茄子易受青枯病侵袭,尤其在我国南方地区,其病原菌适应性强、分布广泛、繁殖速度较快,常规方法难以有效防治,而抗病育种可以有效防御病菌的危害,能较大幅度提高茄子的产量和品质[2, 23]。近年来,研究人员在提高茄子青枯病抗性及抗病品种选育方面作了较多努力。邵欣欣[24]在茄子青枯病抗性研究中发现,ERF转录因子参与调控茄子抗青枯病的信号途径;肖熙鸥等[25]研究认为,SA信号途径中MAPK6MKK2NPR1PAD4等基因能够正向调控茄子青枯病的抗性;李威等[26]研究发现,1.5~2.0 mmol/L的硅浓度处理可有效提高快圆茄青枯病的抗性;Qiu等[27]认为,过表达SmMYB44 可诱导茄子中亚精胺相关基因(SmSPDS)的表达,促进亚精胺的合成与积累,从而增加对茄子青枯病的抗性。此外,广州市农业科学研究院经过多年研究选育出的翡翠绿2号青茄新品种在大田抗病性鉴定中表现为中抗青枯病[28],与广东省农业科学院植物保护研究所联合选育出的紫荣6号和玫瑰紫花茄均为抗青枯病的优质茄子新品种[29-30]

研究表明,在生物胁迫下,植物体内会通过信号传导途径和防御反应作出应激防卫,而转录因子在这一系列反应中起关键作用[31]。近年来有关WRKY转录因子在植株抗病性上的研究成为一个热门话题[32]。已有研究报道,WRKY转录因子涉及调控与青枯病抗性相关的信号转导过程。王鹏飞等[33]研究发现,野生花生AdWRKY37 基因在受到青枯病菌液胁迫诱导后表达量明显升高,并推测该基因可能通过介导水杨酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸(Jasmonic acid,JA)途径参与青枯病抗病相关过程的调控;Dang等[34]认为,CaWRKY27转录因子通过调节SA、JA和内皮素(Endothelin,ET)介导的信号通路,可增强烟草对青枯菌的抗性;Liu等[35]发现,在烟草中过表达NtWRKY50 能够促进SA合成,从而增强植株对青枯病的抗性;Dang等[36]在辣椒抗病育种的研究中发现,CaWRKY41转录因子能够提高辣椒对青枯菌的抗性。然而,有关WRKY转录因子在茄子青枯病抗性中的相关研究还鲜见报道。本研究以茄子叶片cDNA为模板成功克隆了SmWRKY65 基因,与茄子数据库中原始WRKY65 序列比对同源性为88.06%,序列差异性的产生可能与PCR扩增过程中单核苷酸碱基变异及引物二聚体的形成有关。实时荧光定量分析结果表明,SmWRKY65 在茄子抗病和感病植株中均响应青枯病的诱导,其表达量在接种青枯病菌后0、3、6、9 h 4个时间点不断升高,且SmWRKY65 在茄子抗病材料中的表达水平明显高于感病材料,说明SmWRKY65 可能涉及茄子青枯病抗病的调节过程。在抗病茄子(E-31)植株中接种青枯菌的分析结果显示,与清水和pTRV2 空载相比,SmWRKY65 沉默植株表现出明显的萎蔫、易感症状,且qT-PCR分析表明SmWRKY65 在茄子中的表达量较清水和pTRV2 空载明显降低,这表明SmWRKY65 沉默后可能抑制了茄子青枯病抗病信号途径中相关基因的表达,从而降低了茄子植株对青枯病原菌的抗性。

4 结论

本研究成功克隆了SmWRKY65 基因,与茄子数据库中原始WRKY65 序列的同源性为88.06%,该基因开放阅读框为834个核苷酸序列,编码277个氨基酸残基,在71~131区域包含1个含60个氨基酸的WRKY保守域,定位于细胞核中,与马铃薯、番茄WRKY65 的同源性最高。时空表达分析发现,SmWRKY65 在茄子根组织中的表达量最高,叶中次之,茎中最低。实时荧光定量PCR分析发现,SmWRKY65 在茄子抗病和感病材料中均响应青枯病菌的诱导上调表达,且在抗病材料中的表达水平明显高于感病材料;VIGS结果表明,接种pTRV2-SmWRKY65 植株的叶片表现出明显的萎蔫症状,结合qRT-PCR分析发现,pTRV2-SmWRKY65 表达量较对照明显下降,表明SmWRKY65 沉默后茄子抗青枯病的能力下降,说明SmWRKY65 可能涉及茄子青枯病抗病相关过程的调控。

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(责任编辑  崔建勋)