2021, Vol. 48文章信息
引用本文 |
基金项目
- 佛山市财政专项资金-2019年度共建广东农业科技示范市项目; 广东省重点领域研发计划项目(2020B020225005);广东省农业科学院乡村振兴地方分院驻点工作项目(2020驻点46-02)
作者简介
- 周东来（1989—），男，博士，助理研究员，研究方向为水产健康养殖技术和蚕桑资源综合利用，E-mail：zhoudonglai.2007@163.com.
通讯作者
- 邝哲师（1964—），男，硕士，研究员，研究方向为微生物制剂和发酵饲料，E-mail: kzs1234@163.com.
文章历史
- 收稿日期：2021-01-23
2. 佛山市顺德区丰信生物技术科技有限公司，广东 佛山 528318
2. Foshan Shunde Fengxin Bio-technology Co., Ltd, Foshan 528318, China
【研究意义】草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国养殖规模最大的淡水经济鱼类，主要分布于长江、珠江和黑龙江三大水系。据统计，2019年我国草鱼养殖产量达5.53×106 t，居我国淡水鱼养殖之首[1]。草鱼因味道鲜美、营养丰富且价格低廉而深受广大消费者喜爱。但近年来，工农业废水的排放以及大规模、高密度养殖导致养殖水体恶化、病害频发，出现渔药、抗生素严重超标使用的问题。此外，养殖过程中片面追求高产量和高生长速度而大量使用配合饲料，从而大大降低了草鱼的肉质风味及食用安全性[2-4]。农业农村部第194号公告已明确规定，饲料生产企业从2020年7月1日起停止生产含有促生长类药物的商品饲料。因此，亟需开发新型绿色饲料添加剂，以替代抗生素并提高草鱼品质、促进渔业健康可持续发展。【前人研究进展】桑树（Morus alba L.）是桑科多年生落叶木本植物，抗逆性强，在我国有很大的种植面积。桑叶是桑树的主要产物，每年可以采摘多次，产量极为丰富[5]。桑叶中富含蛋白质、维生素和矿物质等营养元素，以及桑叶多糖、桑叶黄酮和生物碱等生物活性成分，具有降血糖、抗炎和抗病毒等多种生理功能，可提高畜禽水产动物的免疫力，在健康养殖方面具有巨大的发展潜力[6-11]。目前，桑叶已经在猪[12-14]、家禽[15-18]、反刍动物[19-21]等动物饲料中进行了大量应用研究，结果表明，虽然桑叶对不同动物的生长性能影响不同，但桑叶中的生物活性成分能够调节动物体内的营养物质代谢，对提高肌肉品质、改善肉质风味具有一定效果。【本研究切入点】研究发现，在罗非鱼饲料中添加10% 的桑叶不会影响其生长性能，但对调节体内的脂质代谢和改善肌肉品质具有一定效果[22]；发酵桑叶替代适宜水平鱼粉不会影响大口黑鲈的生长，但对大口黑鲈的脂质代谢和机体抗氧化能力有明显改善作用[23]。目前将桑叶粉应用于草鱼饲料中的研究报道还较少。【拟解决的关键问题】本研究通过比较饲料中添加不同比例的桑叶粉对草鱼生长性能、肌肉质构、营养组成和肉质风味等方面的影响，旨在获取不同桑叶粉添加量在草鱼养殖中的应用效果，为桑叶粉作为草鱼饲料添加剂的应用开发提供理论支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试基础饲料的主要蛋白来源为豆粕和菜籽粕，并添加少量蛹肽蛋白（广东丰信生物科技有限公司提供），脂肪以豆油和鱼油为主，并添加少量矿物质元素和维生素配制而成。在基础饲料中分别添加0（CK）、5%、10%、15% 和20% 的桑叶粉（mulberry leaf powder, MLP, 含粗蛋白15.24%、粗脂肪3.23%、粗灰分13.64%）以替代部分麦芽根、菜籽粕和小麦等，从而配成5种等氮等脂（含蛋白质25.55%、脂肪3.25%）的试验饲料。试验饲料营养水平是根据原料营养组成和添加比例通过公式计算获得，5种日粮配方及常规营养水平（干物质）如表 1所示。
1.2 试验设计及饲养管理
试验鱼塘0.67 hm2，位于佛山市三水区（青岐）现代渔业产业园内，鱼塘内放置24个大小均一、排列整齐的网箱，每个网箱大小为6 m×6 m。于2020年5月5日清塘，用鲜石灰进行全池泼洒消毒，消毒完毕后进水15 d左右，再次用ClO2消毒杀菌。5月22日，从市场购买初始体质量为1 112.06（±83.19）g的草鱼苗约1 500尾，随机平均分配到15个网箱中，每个网箱约100尾。为使草鱼苗适应试验条件，预试验用基础日粮按1% 的投喂量饲喂2周。正式试验设5个处理，分别投喂基础日粮（对照）、5% 桑叶粉、10% 桑叶粉、15% 桑叶粉和20% 桑叶粉，每个处理3个重复，共15个网箱。试验期为8周，每天投喂饲料2次（8:00—9:00、15:00—16:00），投喂量为鱼体质量的3%~5%，并根据鱼的摄食情况和水温变化及时调整每次的投喂量，以草鱼饱食无残饵为宜。养殖期间水温为26~30 ℃，pH值为7.5~8.0，溶氧质量浓度大于5 mg/L，氨氮质量浓度小于0.05 mg/L。
1.3 样品采集及指标测定预试验结束后，将每个网箱的鱼全部取出称重，计算初始体质量；在正式试验养殖8周后采集样品，采集前对草鱼禁食24 h，每个网箱随机取6尾鱼，用MS-222麻醉后进行体长、体重、胸围的测量，然后将草鱼进行解剖，分离出内脏、肝胰脏和肠道并测定对应的组织质量。同时，用手术刀将草鱼的背部白肌切下，其中一侧肌肉样品用于肉质分析，另一侧肌肉用液氮处理后保存于−80 ℃冰箱，用于后续生化分析。
1.3.1 生长及形体指标测定 计算增重率（weight gain rate, WGR）、特定生长率（specific growth rate, SGR）、饲料系数（feed conversion ratio, FCR）、肥满度（condition factor, CF）、肝体指数（hepatopancreas somatic index, HSI）、脏体指数（viscera somatic index, VSI）和存活率（survival rate, SR）等相关指标：
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式中，Wt、W0分别为供试草鱼的终末体质量（final body weight, FBW，g）和初始体质量（initial body weight, IBW，g），t为养殖天数（d），F为饲料摄入量（g），N0、Nt分别为试验开始和结束时草鱼的尾数，L为鱼体长（cm），Wv为内脏质量（g），Wh为肝胰脏质量（g）。
1.3.2 肌肉营养成分测定 草鱼背肌常规营养成分测定参照食品安全国家标准中的蛋白质（GB 5009.5-2016）、水分（GB 5009.3-2016）、灰分（GB 5009.4-2016）、脂肪（GB 5009.6-2016）、氨基酸（GB 5009.124-2016）和脂肪酸（GB 5009.168- 2016）标准进行。
1.3.3 饲料营养成分测定 桑叶粉中常规营养成分测定参照饲料国家标准中的粗蛋白（GB/T 6432-2018）、粗脂肪（GB/T 6433-2006）、水分（GB/ T 6435-2014）和粗灰分（GB/T 6438-2007）标准进行。
1.3.4 肌肉肌苷酸的测定 草鱼背肌中肌苷酸的测定参照文献[24]的方法进行。其中，色谱条件为：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱（5 μm，Φ4.6 mm×250 mm）；流动相为50 mmol/L、pH6.5的甲酸铵缓冲溶液（含5% 甲醇）；流速为1 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为5 μL；紫外检测波长为250 nm；标准工作液运行时间为4 min，样品提取液运行时间为11 min。
1.3.5 肌肉质构特性测定 参照文献[4]的方法进行肌肉质构特性测定。其中，质构测定采用TA. XT. plus型物性测试仪（英国Stable Micro System公司），探头为圆柱形的P/50探头，每个样品进行2次质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）测试，测试条件为：测试前速度、测试速度和测试后速度均为2 mm/s，压缩比为60%，测定停留间隔时间为5 s，触发力为5 g，数据获得速率为200 pps，测试温度为常温。每个平行取6尾鱼，每尾鱼分别取3块肌肉进行测定。
对试验数据进行统计分析，差异显著性分析采用SPSS22.0软件，分别进行单因素ANOVA检验和Duncan's多重比较检验。
2 结果与分析 2.1 不同添加比例桑叶粉对草鱼生长性能的影响从表 2可见，与对照相比，饲料中添加不同比例的桑叶粉对草鱼的终末体均重、增重率、特定生长率、饲料系数和存活率等均无显著影响，但添加5%、10%、15% 和20% 的桑叶粉，草鱼的增重率分别提高了10.7%、3.4%、3.8% 和8.8%，而其对应的饲料系数则分别下降了15.3%、17.1%、5.1% 和20.7%。
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2.2 不同添加比例桑叶粉对草鱼形体指标的影响
从表 3可见，与对照相比，饲料中添加不同比例的桑叶粉对草鱼的体长、体重、胸围、肝体指数和肥满度均无显著影响；添加10% 的桑叶粉使草鱼的脏体指数显著高于对照和15% 桑叶粉添加组。
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2.3 不同添加比例桑叶粉对草鱼肌肉品质的影响
从表 4可见，与对照相比，饲料中添加5% 的桑叶粉能够显著提高草鱼背肌的硬度、黏性、咀嚼力和回复性，但对肌肉弹性、内聚力和剪切力无显著影响；而饲料中添加10% 和15% 的桑叶粉能够显著降低草鱼背肌的内聚力，但对肌肉硬度、弹性、黏性、咀嚼力、回复性和剪切力均无显著影响；而饲料中添加20% 的桑叶粉能够显著降低草鱼背肌的内聚力和回复性，但对肌肉硬度、弹性、黏性、咀嚼力和剪切力无显著影响。
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2.4 不同添加比例桑叶粉对草鱼肌肉常规营养成分的影响
从表 5可见，与对照相比，饲料中添加5%、10% 和20% 的桑叶粉都能够显著提高草鱼肌肉中的蛋白质含量，其蛋白质含量分别提高了5.8%、4.5% 和3.9%，而添加15% 的桑叶粉对草鱼肌肉中的蛋白质含量无显著影响；饲料中添加10% 和15% 的桑叶粉能够显著提高草鱼肌肉中的脂肪含量，其脂肪含量分别提高了35.8% 和15.4%，而添加20% 的桑叶粉则显著降低肌肉中的脂肪含量，添加5% 的桑叶粉对肌肉中的脂肪含量无显著影响。
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2.5 不同添加比例桑叶粉对草鱼肌肉中风味物质含量的影响
本研究从草鱼肌肉中共检测出16种常见氨基酸（表 6），其中，人体必需氨基酸7种（EAA，Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe和Lys），半必需氨基酸2种（HEAA，His和Arg），非必需氨基酸7种（NEAA，Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Tyr和Pro）。此外，16种常见氨基酸中有4种鲜味氨基酸（DAA，Asp、Glu、Gly和Ala）和5种呈味氨基酸（FAA，Asp、Thr、Ser、Gly和Ala）。从表 6可见，与对照相比，饲料中添加10%、15% 和20% 的桑叶粉都能够显著提高草鱼肌肉中鲜味氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸、半必需氨基酸和总氨基酸的含量，而添加5% 的桑叶粉仅显著提高半必需氨基酸的含量，对肌肉中鲜味氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸和总氨基酸的含量无显著影响。其中，添加15% 的桑叶粉对肌肉中鲜味氨基酸、呈味氨基酸和总氨基酸含量提高最多，分别达到7.0%、7.3% 和5.8%，而添加20% 的桑叶粉对肌肉中必需氨基酸和半必需氨基酸含量提高最多，分别达到5.2% 和5.7%。但各试验处理和对照之间，EAA/TAA比值均在40% 左右，没有显著差异。除了15% 桑叶粉添加处理有显著差异外，其他处理与对照相比，EAA/ NEAA没有显著差异。同时，各试验处理EAA/ NEAA比值均超过80%。此外，饲料中添加5%、10% 和20% 的桑叶粉都能够显著提高草鱼肌肉中肌苷酸（IMP）的含量，分别提高72.3%、176.8% 和82.8%，但添加15% 的桑叶粉显著降低草鱼肌肉中肌苷酸的含量。
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2.6 不同添加比例桑叶粉对草鱼肌肉中不饱和脂肪酸含量的影响
本研究从草鱼肌肉中共检测出15种不饱和脂肪酸（UFA），其中单不饱和脂肪酸（MUFA）有6种，多不饱和酸（PUFAs）有9种（表 7）。MUFA中含量最高的为油酸（C18 ∶ 1）；PUFA中含量最高的为亚油酸（C18 ∶ 2），其次为花生四烯酸（C20 ∶ 4）和二十二碳五烯酸（C22 ∶ 5）。从表 7可见，饲料中添加不同比例的桑叶粉都能显著提高草鱼肌肉中总的单不饱和脂肪酸含量，特别是油酸，在5%、10%、15% 和20% 桑叶粉添加组中分别提高了4.2%、17.8%、18.6% 和13.4%；虽然添加10%、15% 和20% 的桑叶粉都能显著降低草鱼肌肉中总的多不饱和脂肪酸的含量，添加5% 比例的桑叶粉对草鱼肌肉中总的多不饱和脂肪酸含量无显著影响，但是添加不同比例的桑叶粉都能显著提高亚油酸（C18 ∶ 2）和亚麻酸（C18 ∶ 3）的含量；添加5%、10% 和15% 的桑叶粉能显著提高草鱼肌肉中总的不饱和脂肪酸含量，而添加20% 的桑叶粉能显著降低草鱼肌肉中总的不饱和脂肪酸含量。
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3 讨论 3.1 桑叶粉对草鱼生长性能的影响
目前，研究人员对水产饲料中用植物蛋白替代鱼粉进行了大量探究，发现植物蛋白的替代比例因供试鱼种、规格和食性的不同而有所差异[25]。李法见等[22]研究发现，在饲料中添加5% 和10% 桑叶粉对罗非鱼的末重、SGR、PER和FCR均无显著影响，这与本研究发现的饲料中添加5%、10%、15% 和20% 桑叶粉不会影响草鱼的生长性能结果相一致。徐韬等[23]在大口黑鲈中研究发现，利用发酵桑叶替代15% 的鱼粉对大口黑鲈的生长性能不会产生影响，但用30% 的发酵桑叶替代鱼粉会抑制大口黑鲈的生长。同样，在胭脂鱼的研究中发现少量添加桑叶粉对胭脂鱼的生长性能没有显著影响，但添加量达到9% 后，可明显降低鱼体的生长指标，提高饵料系数[26]。同样，在杂交鳢高脂饲料中添加低水平（7.5%）的发酵桑叶不会影响其特定生长率、蛋白质效率和饲料系数，但添加高水平（15%）发酵桑叶会抑制杂交鳢的生长[27]。以上研究结果表明，不同种属的鱼，对桑叶粉的添加比例具有特异性，这可能是由于不同种属的鱼类对桑叶中单宁和植酸等抗营养因子的耐受能力不同，而发酵可以有效降低桑叶中抗营养因子的含量，能提高不同鱼类对桑叶营养物质的利用程度。本研究结果表明，饲料中添加不超过20% 的桑叶粉不影响中规格草鱼的生长性能。
3.2 桑叶粉对草鱼肌肉品质的影响肌肉是鱼体的主要营养部位，肌肉中蛋白质和脂肪的含量是衡量其品质的重要参数。研究表明，饲料中添加5% 和10% 桑叶粉对罗非鱼的粗蛋白和粗脂肪含量无显著影响[22]。用发酵桑叶粉替代15% 和30% 的鱼粉后对大口黑鲈全鱼粗蛋白和粗脂肪没有显著影响[23]。但对印度囊鳃鲇的研究表明，只有添加适量的桑叶粉才能显著提高肌肉中粗蛋白和粗脂肪的含量，但添加量过高或过低对肌肉蛋白质和脂肪含量无影响[28]。同样，在巴塔野鲮[29]和南亚野鲮[30]的研究中也发现，只有添加适量的桑叶粉才能显著提高肌肉中粗蛋白和粗脂肪的含量。本研究发现，在饲料中添加10% 的桑叶粉能显著提高草鱼肌肉中的蛋白质和脂肪含量；而添加5% 的桑叶粉能显著提高草鱼肌肉中的蛋白质含量，但对脂肪的含量无显著影响；添加15% 的桑叶粉对草鱼肌肉中的蛋白质含量无显著影响，但能显著提高脂肪含量；添加20% 的桑叶粉能显著提高草鱼肌肉中的蛋白质含量，但显著降低脂肪含量。这表明不同鱼类对于桑叶的耐受能力存在差异，不同的桑叶粉添加比例对草鱼肌肉的营养成分也会有不同影响。
根据联合国粮农组织/ 世界卫生组织（FAO/ WHO）提出的标准，优质蛋白质中EAA/TAA比值约为40%，而EAA/NEAA比值应大于60%[31]。本研究发现，各试验处理和对照草鱼之间，EAA/TAA比值均在40% 左右，没有显著差异。除了15% 桑叶粉添加组草鱼有显著差异外，其他处理与对照相比，EAA/NEAA没有显著差异。同时，不同试验处理草鱼的EAA/NEAA比值都超过80%。此外，饲料中添加10%、15% 和20% 的桑叶粉，草鱼肌肉中呈味氨基酸、必需氨基酸、半必需氨基酸和总氨基酸的含量均显著高于对照。可见，添加桑叶粉的试验处理草鱼肌肉中的氨基酸组成符合WHO/FAO提出的优质蛋白质标准，是营养价值很高的动物蛋白源。
鱼类肌肉品质还可以通过质构特性进行分析和评价[32-33]。本研究采用质地剖面分析法（TPA）模拟人的口腔咀嚼运动对草鱼背肌进行质地测定，从而获得硬度、弹性、咀嚼力等质构特性参数[34]。胡芬等[35]对淡水鱼肉的质构指标进行主成分分析，发现硬度和弹性是影响肌肉品质的主要质构指标。一般来说，鱼肉的肉质变硬，弹性增强，品尝的口感会更好[35]。目前，水产饲料中添加桑叶粉后对鱼类肌肉质构特性的影响尚未见报道。但在畜禽研究中发现，发酵桑叶能有效提高杂交牛的肌肉嫩度[21]；在育肥猪中研究表明，饲粮中添加桑叶粉能够改善肌肉中的大理石纹，并且降低肌肉中的总胆固醇含量，从而提高肌肉品质[14]；在胡须鸡日粮中添加桑叶和发酵桑叶均可提高胡须鸡的肌肉嫩度，改善鸡肉品质[16]。本研究发现，与对照相比，饲料中添加5% 的桑叶粉能显著提高草鱼背肌的硬度、黏性、咀嚼力和回复性，但对肌肉弹性、内聚力和剪切力无显著影响；而添加10%、15% 和20% 的桑叶粉对肌肉硬度、弹性、黏性、咀嚼力、回复性和剪切力等均无显著影响，仅对内聚力等个别指标有显著影响。可见，在饲料中添加低水平（5%）的桑叶粉对草鱼肌肉质构特性的改善作用更明显。
3.3 桑叶粉对草鱼肉质风味的影响研究表明，肌肉中游离氨基酸和脂肪酸的含量是鱼肉风味的主要影响因素，特别是鲜味氨基酸的含量[36]。其中，天冬氨酸和谷氨酸为鲜味特征性氨基酸；而甘氨酸和丙氨酸为甘味特征性氨基酸[37]。谷氨酸对鱼的风味作用最重要，其次是甘氨酸[38]。本研究发现，饲料中添加10%、15% 和20% 的桑叶粉均可显著提高草鱼肌肉中鲜味氨基酸的含量。其中，谷氨酸和甘氨酸的含量均显著高于对照。谷氨酸含量最高，各试验处理都超过2.72%，其次是天冬氨酸和赖氨酸。谷氨酸不仅能够改善风味，还参与多种生理活性物质的合成，是脑组织生化代谢中的重要氨基酸[39]。有研究表明，鱼类肌肉中鲜味氨基酸的合成是通过调节相关酶的合成，从而改变三羧酸循环以及糖酵解等途径来实现[39]，而桑叶中的黄酮[40]和1- 脱氧野尻霉素（DNJ）[41]能够调控小鼠肝脏中糖酵解途径中酶的合成。因此，饲料中添加的桑叶粉可能通过其活性成分调控鱼体相关酶的合成，进而促进鲜味氨基酸的合成。
肌苷酸是一种在核糖核酸（RNA）中发现的核苷酸。研究表明，肌苷酸是畜禽肌肉中产生鲜味的重要物质，对提升肉质鲜味具有重要作用[42-43]。肌苷酸也是鱼肉中重要的呈鲜味物质[44]，能提供核糖参与美拉德反应，是重要的风味前体物质[45]。本研究发现，饲料中添加5%、10% 和20% 的桑叶粉都能够显著提高草鱼肌肉中肌苷酸的含量，分别提高72.3%、176.8% 和82.8%，但添加15% 的桑叶粉显著降低草鱼肌肉中肌苷酸的含量，该结果与黄传书等[46]在草鱼中的研究结果基本一致。这说明在饲料中添加适量的桑叶粉有助于提高草鱼肌肉肌苷酸的含量，改善其肉质风味。
此外，肌肉中脂肪酸的含量与组成也会影响其风味和嫩度等[47]。鱼肉中普遍含有较高比例的MUFA和PUFA[48]。MUFA中具有代表性的是油酸（C18 ∶ 1），它具有降低低密度脂蛋白胆固醇的效果，能预防动脉硬化[49]。PUFA具有广泛的生物功能，主要包括亚油酸（C18 ∶ 2）、亚麻酸（C18 ∶ 3）和花生四烯酸（C20 ∶ 4）等[49]。本研究发现，饲料中添加5%、10%、15% 和20% 的桑叶粉都能够显著提高草鱼肌肉中单不饱和脂肪酸的含量，特别是油酸，分别提高了4.2%、17.8%、18.6% 和13.4%，同时显著提高亚油酸（C18 ∶ 2）和亚麻酸（C18 ∶ 3）等多不饱和脂肪酸的含量。该结果与黄传书等[46]在草鱼中的研究结果一致。目前许多研究表明，不饱和脂肪酸具有多种保健功能，能够明显地降低血脂和血压，也具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤和免疫调节作用，还能够显著降低心血管疾病的发病率[50]。因此，在草鱼饲料中添加适量桑叶粉能提高草鱼肌肉中的不饱和脂肪酸含量，使其具有更高的食用价值和保健功能。
4 结论本研究探究了饲料中添加不同比例桑叶粉对草鱼中鱼的生长性能、肌肉品质和肉质风味的影响。结果显示，饲料中添加5%、10%、15% 和20% 的桑叶粉不影响中规格草鱼的生长性能，但与对照相比，能够显著提高草鱼肌肉中蛋白质、肌苷酸、风味氨基酸和不饱和脂肪酸等的含量，改善其肉质风味。尤其是添加10% 的桑叶粉，对提高肌肉中蛋白质、肌苷酸、鲜味氨基酸和不饱和脂肪酸等营养物质和风味物质含量的作用最明显。
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