【研究意义】兰花为兰科兰属植物，是中国十大名花之一，素有“国香”“君子之花”的美誉，在我国已有近2 000年的栽培历史，并形成了极具中国特色的兰花文化^[1]。因具有独特的文化和观赏价值，兰花历来是文人墨客喜爱的对象，在市场上具有良好的经济价值。孔子称国兰为“王者之香”，其香气为国兰的精髓和灵魂，是体现国兰观赏、文化及经济价值的重要性状，历来是人们用来评估和鉴定兰花品种优劣的重要条件之一。墨兰（Cymbidium sinense）又名报岁兰，适宜生长在半阴、温暖、湿润的环境中，主要分布于东南沿海地区的广东、广西、福建，以及西南地区的云贵川等地，品种丰富^[2-3]，在广东国兰交易市场中最常见也最受欢迎。墨兰叶形优美，花香清新幽远，解郁提神，沁人心脾^[4]，为优质香料物质，可在化妆品等领域进行良好应用。但有关兰花精油的应用及相关产品的开发相对较少，针对墨兰精油的开发和研究更为少见。因此，本研究开展墨兰精油提取工艺的研究并对提取的精油进行成分测定，以期为墨兰精油的开发应用提供技术及理论基础，进而提升墨兰的产业价值，促使墨兰产业链的延伸。【前人研究进展】研究表明，植物精油是一类从植物中提取的含芳香气味^[5]的物质，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化以及保护心血管等作用^[6]，可以作为天然抗氧化剂有效延缓食品变质、提升食用油和肉类的货架期。植物精油主要由萜类化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫类化合物等组成^[7]，其中萜类化合物被认为是植物精油的主要成分^[8]。李杰同时采用蒸馏法和萃取法提取了‘企黑’ ^[9]和‘小香’ ^[10]墨兰精油，并对精油组分进行了初步分析，发现墨兰精油主要含有棕榈酸、二十五烷、二十三烷、二十七烷、二十四烷醇等。近年来，越来越多方法被应用于提取植物精油，包括溶剂浸提法、水蒸气蒸馏法、超声波辅助萃取法、超临界CO₂萃取法等^[11-14]。其中，微波辅助萃取法所需设备简单，操作方便，萃取范围宽泛，出油率高，适合常规工业的工艺提取，因而广泛应用于天然植物有效成分的提取。【本研究切入点】墨兰香气清新优雅，但目前关于墨兰精油的产业应用几乎为空白。本研究采用新育成的‘迎春素’墨兰作为研究对象，采取超声辅助萃取法提取墨兰精油，通过单因素和正交试验优化墨兰精油提取工艺，并采用顶空固相微萃取- 气相色谱- 质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）对墨兰精油的香气成分进行测定。【拟解决的关键问题】通过优化超声辅助萃取法提取墨兰精油的工艺，筛选墨兰精油提取的最适条件。结合墨兰精油成分的分析，为墨兰精油在食品、化妆品、医药以及农业环保领域中的应用提供科学依据，为墨兰资源产业的发展提供理论参考。

1　材料与方法 1.1　试验材料

供试墨兰品种为‘迎春素’，采于广东省农业科学院环境园艺研究所国兰种质资源圃内。将采摘后的‘迎春素’墨兰花朵用液氮冷冻，收集包装在不透气性聚乙烯袋中，带回实验室保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

试验有机溶剂有正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95% 乙醇等，均为国产分析纯；试验主要仪器包括RE212-B旋转蒸发器（日本Yamato公司）、BS 2000S型电子天平（德国赛多利斯公司）、7980A-5975C气相质谱联用仪（美国安捷伦公司）、SPME进样器（瑞士CTC Analytics公司）、MC202231DF- Ⅱ数显集热式磁力搅拌器（常州爱华仪器制造有限公司）。

1.2　试验方法

1.2.1 超声辅助萃取　将墨兰花朵在60 ℃下烘干处理24 h，烘干后用粉碎机粉碎，过孔径380 μm的筛。称取20 g粉末样品，装入锥形瓶中，加入有机溶剂，待其混合均匀后，将墨兰料液置于超声波处理器中处理，设置超声波的频率、时间和温度进行超声波浸提^[15]。超声作用后静置，将料液进行分离，再进行抽滤，将提取液与滤渣分离。对抽滤得到的提取液在旋转蒸发仪上进行浓缩（转速100 r/min，温度调至20 ℃，待温度稳定后再调至60 ℃），将滤渣重复萃取3次，收集3次萃取液，用旋转蒸发器分离有机溶剂，提取液中加入适量无水Na₂SO₄脱水干燥，称重，计算墨兰精油的提取率，平行试验3次。

1.2.2 墨兰精油提取工艺优化　（1）单因素试验：以墨兰粉末为材料，选取不同的提取溶剂（95 % 乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚）、料液比（1 ∶ 6、1 ∶ 7、1 ∶ 8、1 ∶ 9、1 ∶ 10，g/mL）、提取时间（35、40、45、50、55 min）、提取温度（45、50、55、60、65 ℃）进行墨兰精油提取单因素试验，计算墨兰精油的得率。

（2）正交试验：以墨兰精油得率为指标，选取提取温度、提取时间、料液比作为影响因素，通过正交试验法L₉（3³）确定有机溶剂提取墨兰精油的最佳工艺条件（表 1）。

1.2.3 精油得率计算　

式中，M₁为瓶子和墨兰精油的质量（g），M₂为瓶子质量（g），M为墨兰质量（g），W为墨兰精油的提取率（%）。

1.2.4 顶空固相微萃取　取5 mL提取的墨兰精油于20 mL隔垫密封样品瓶中，加入转子置于磁力搅拌器上加热。将50/30 μm DVB/CAR/PDMS型号萃取头在GC/MS进样口250 ℃下老化5 min后，插入顶空样品瓶进行悬空富集一定时间后取出萃取头，于GC/MS中解析、检测。

1.2.5 GC-MS定性定量分析　墨兰精油的GC-MS测定条件：选用HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气，流速：1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，进样量1 mL，分流比50 ∶ 1；程序升温条件：初始柱温度40 ℃，以2 ℃ /min升至90 ℃，再以4 ℃ /min升至140 ℃，最后以7 ℃ /min升至250 ℃。

质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，溶剂延迟3 min，离子源温度230 ℃，四级杆温度150℃，扫描质量范围为30~550 amu^[16]。利用Wiley275.L和NIST98.L两个谱库对采集到质谱图中的香气成分串联检索，确定墨兰精油的香气成分。总离子流图用峰面积归一法计算各组分的相对百分含量，确定墨兰精油的组成成分。

试验数据使用SPSS 20.0软件进行统计和方差分析。利用软件Origin 8.5进行结果处理并作图。

2　结果与分析 2.1　单因素试验结果与分析

2.1.1 不同有机溶剂对墨兰精油得率的影响　称取10 g墨兰样品，选择石油醚、正己烷、95% 乙醇、乙酸乙酯4种有机溶剂为萃取剂，按料液比1 ∶ 9，在45 ℃条件下提取45 min，墨兰精油得率见表 2。

由表 2可知，4种有机溶剂中，使用95% 乙醇提取得到的墨兰精油产率最高、为1.92%。不同的有机溶剂对墨兰精油的得率、颜色和香味都会产生不同程度的影响。95% 乙醇作为萃取剂，精油色泽比较理想，墨兰的特征香味浓郁，风味佳；石油醚作为萃取剂，精油得率虽然较高，但颜色呈墨绿色较混浊，而且香味淡薄，风味一般；正己烷作为萃取剂，精油得率不高，颜色为深墨绿色，香味淡薄，风味较好；乙酸乙酯作为萃取剂，精油得率较低，颜色为浑浊的墨绿色，香味淡薄，风味差。因此，95% 乙醇是较好的有机溶剂提取剂，从价格、产率以及安全性等方面来考虑，选择95% 乙醇为提取剂较为适宜。而石油醚、正己烷、乙酸乙酯提取得到的精油无论颜色还是香气都不太理想，不适宜作为墨兰精油的提取剂。

2.1.2 不同料液比对墨兰精油得率的影响　称取20 g墨兰样品，以95% 乙醇作为萃取剂，选择不同料液比（1 ∶ 6、1 ∶ 7、1 ∶ 8、1 ∶ 9、1 ∶ 10）45 ℃萃取45 min，墨兰精油得率变化见图 1。由图 1可知，在不同的液料比下萃取墨兰精油的精油得率不同。在料液比为1 ∶ 6~9范围内，随着液料比的增加，墨兰精油得率呈现增加趋势，液料比为1 ∶ 9时精油得率最高；料液比再增加时呈现下降趋势。在料液比较少的情况下，物料墨兰与有机溶剂接触的表面积比越大^[17]，固液浓度差就会相应增加，溶解度和渗透压也会变大，加快了95% 乙醇与墨兰油脂分子的扩散速率，有利于油脂从墨兰细胞组织中脱离出来，墨兰油脂分子扩散速率的增加^[18]，同时提高了墨兰精油的得率。但当有机溶剂的量过高，液料比超过1 ∶ 9时，不仅会增加试验成本，还会使墨兰精油得率降低。因此，从节约能源、降低成本、便于溶剂回收等综合因素考虑，最佳的液料比为1 ∶ 9。

2.1.3 不同提取时间对墨兰精油得率的影响　称取20 g墨兰样品，以95% 乙醇作为萃取剂，料液比为1 ∶ 8，45 ℃下分别提取35、40、45、50、55 min，墨兰精油得率变化见图 2。由图 2可知，超声波提取时间由35 min增加到40 min时，墨兰精油得率大幅度增加；但是提取时间由40 min延长到55 min的过程中，墨兰精油得率反而呈现下降趋势。这是由于提取的初始阶段，物料中精油含量较高，固液间浓度差较大，溶解度和渗透压也变大，墨兰精油扩散速率较大，墨兰精油的油脂分子会不断扩散到95% 乙醇的有机溶剂中，精油萃取率就不断增加；这可能是由于随着超声时间的延长，超声能转化成热能，同时溶质中的小分子相互碰撞导致精油溶液温度升高，使墨兰精油挥发严重，精油的得率反而下降，因此进一步延长超声作用时间对墨兰精油得率的提高无促进作用，有机溶剂中的油脂量趋于饱和，溶液体系渗透压趋于平衡^[19]，得率不再增加，同时提取精油时间过长还会造成能耗的增加以及工序时间的延长，因此墨兰精油提取工艺最佳提取时间为40 min。

2.1.4 不同提取温度对墨兰精油得率的影响　称取20 g墨兰样品，以95% 乙醇作为萃取剂，料液比为1 ∶ 8，分别于45、50、55、60、65℃下萃取45min，墨兰精油得率变化见图 3。由图 3可知，提取温度在45~50 ℃之间，随着温度的升高，墨兰精油得率呈现上升趋势，当温度增加到50 ℃时，墨兰精油得率为2.81%，显著高于其他提取温度下的精油得率；随着超声提取温度的进一步升高，墨兰精油得率呈现下降趋势。这是因为温度的升高增加了分子之间的扩散作用，促进溶剂分子渗透到物料细胞内部，增加了溶剂分子和油脂分子的活动动能，加剧溶剂分子的挥发和扩散，从而萃取率增加^[20]。此外，温度升高以及随着提取时间的延长沸腾剧烈，导致95% 乙醇的挥发加剧，减少了95% 乙醇与墨兰的有效作用，不利于墨兰精油的萃取，因此当温度高于50 ℃时，墨兰精油得率出现下降现象。

2.2　正交试验结果与分析

选取料液比、超声提取时间、超声提取温度作为影响因素，以墨兰精油得率为指标，采用L₉（3³）正交试验进一步优化墨兰精油提取工艺。由表 3的R值可知，超声提取温度、超声提取时间、料液比3个因素对墨兰精油得率的影响次序为：A液料比＞B超声提取时间＞C超声提取温度，根据3个k值的最大值组合，确定最优工艺条件为A₂B₁C₁，即料液比1 ∶ 9、超声提取时间35 min、超声提取温度45 ℃。在此条件下进行3次验证试验，墨兰精油平均得率为2.96%，精油香味较浓郁，风味佳。

2.3　墨兰精油香气成分分析

墨兰‘迎春素’的精油成分总离子流如图 4所示。经GC-MS分析，测得该精油的78种组分（表 4），含量占精油成分总量的94.36%，相对含量在1% 以上的组分有20种，分别为异戊醛、2- 己烯醛、己酸乙酯、罗勒烯、1, 2, 3, 4- 四氢萘、壬醛、辛酸乙酯、紫罗兰酮、（E, E）-2, 4- 庚二烯醛、茶螺烷、L- 芳樟醇、苯乙醛、乙二醇油酸酯、正十五烷酸、二氢紫罗兰酮、β- 紫罗兰酮、棕榈酸、十八碳二烯酸甲酯、二十四烷、二十五烷。这20种精油组分的相对含量达到了80.37%，其中，棕榈酸相对含量最高、为17.37%，其次为壬醛、正十五烷酸、二十四烷、合金欢醇，相对含量分别为10.57%、8.69、4.65% 和4.03%。

将鉴定出的墨兰精油成分划分为醛类、醇类、芳香族类、酮类、烷烃类、烯烃类、羧酸类、酯类、其他类呋喃和酰胺共9类化合物。从图 5可以看出，‘迎春素’精油中羟酸类、醛类、烷烃类、醇类最多，分别占化合物总数的26.21%、26.01%、11.59% 和10.58%，这4类化合物已达化合物总数的74.39%；酯类、酮类化合物相对少些，两者所占比重相近，分别为9.64% 和9.25%；而芳香族类和烯烃类最少，占比3.77% 和2.62%。

3　讨论 3.1　超声辅助萃取对墨兰精油提取的影响

与采用水蒸馏法提取墨兰精油的方法相比^[9-10]，本研究采用超声辅助萃取法的加热温度低，所需时间较短，可以防止墨兰精油中的热敏成分和易水解成分分解，最大限度地保留了精油中的特征香气成分。传统方法提取的精油得率仅为1% 左右，而本研究采用超声辅助萃取法经优化后可获得较高的精油得率（2.9% 左右），精油得率得到了大大提高。

不同溶剂会影响精油得率，选择有效的有机溶剂对精油提取有重要影响。王海波等^[21]研究表明，利用不同有机溶剂提取的桂花精油，在形态、气味和颜色上有所区别，其中获得精油效果较好的为石油醚。而从价格、产率以及安全性等方面考虑，本研究选择乙醇作为提取剂较为适宜，所得到精油品质较好。

在影响超声波辅助提取精油的因素中，料液比通过影响固液浓度差、溶解度和渗透压等，改变有机溶剂与精油分子从植物细胞组织脱离的扩散速率；超声波提取时间和提取温度影响精油分子与有机溶剂的结合程度，从而影响精油得率。本研究认为料液比是影响精油得率的主要因素，与吴晓菊等^[22]研究神香草精油工艺的结论相一致，而且从节约能源、降低成本、便于溶剂回收等方面综合考虑，通过优化料液比、提取时间和提取温度的工艺条件可获得较高的精油得率。

3.2　墨兰精油的香气成分分析

本研对墨兰‘迎春素’精油的香气成分进行测定，检测到78种成分，香气成分较多且大部分以羟酸类、醛类、烷烃类、醇类为主。通过分析对比得出墨兰精油中的特征香气成分主要为棕榈酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金欢醇等，其中棕榈酸成分含量最高（17.37%），可以作为食品用的香料，也可添加到化妆品中滋润皮肤。而在文殊兰精油中检测到棕榈酸的相对含量为15.77%^[23]，墨兰‘迎春素’精油的棕榈酸相对含量更多，而且这类芳香精油大多具有抑菌功能，推测墨兰‘迎春素’精油也可能具有抑菌活性。墨兰‘迎春素’精油的壬醛含量也较高，具有强烈的油脂气味和甜橙气息，其稀乙醇溶液有香草醛的香调，可用作食品添加剂，也可用于调制玫瑰、橙花、香紫罗兰、香味等香精。此外，墨兰中的合金欢醇物质具有青香韵的铃兰花香气，并有青香和木香香韵，这些特征香气可在今后应用于食品、化工和化妆品领域等。

4　结论

本研究以墨兰‘迎春素’为原料，采用超声波辅助萃取法提取墨兰精油，通过单因素试验和正交试验得到最佳的工艺参数如下：以95% 乙醇作为萃取剂，料液比1 ∶ 9（g/mL），超声提取温度45 ℃，超声提取时间35 min，在此条件下墨兰精油得率为2.96%，精油墨绿色透亮，香味较浓郁，风味佳。料液比、超声提取时间、超声提取温度对墨兰精油得率的影响顺序为：液料比＞超声提取时间＞超声提取温度。通过顶空固相微萃取-GC-MS联用技术分析鉴定了墨兰‘迎春素’精油的化学成分，共鉴定出78种化合物，其中主要成分为棕榈酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金欢醇等物质。