【研究意义】油菜是我国主要的经济作物之一，其中芥菜型油菜（Brassica juncea L.）具有较高的经济价值，主要用于食用油的开发。自然界中存在多种芥菜类蔬菜变种，其风味独特，是各地的名特优产品，既可以鲜食（如大叶芥菜、笋子芥、儿菜等），还可以用于加工（如榨菜、酸菜^[1]、梅干菜、芥末油^[2]等）。芥菜型油菜是遗传学研究的材料，利用芥菜型油菜与甘蓝型油菜等近缘物种之间的种间杂交来进行遗传物质的交流和基因组进化^[3]的研究，以及在筛选优良杂种后代方面^[4-5]均具有一定意义。因此，研究芥菜型油菜种子的休眠和活力与种子保存年限的关系对芥菜型油菜种子的保存具有一定意义，而且研究低温与其种子休眠和萌发的关系也有利于芥菜型种子的处理技术在农业生产上的推广。【前人研究进展】种子寿命受到物种、基因和环境的综合调控^[6]，种子活力是衡量种子质量的一个关键因素，而种子老化是一个正常的生理变化^[7]，有不少研究发现多种作物中存在种子抗老化的相关多基因位点^[8]，在水稻中存在与种子活力和老化相关的代谢标志物^[9]。近年来研究发现，种子的寿命受氧化胁迫和种皮发育相关基因^[10]以及过氧化物酶及其调控基因COG1的调控^[11]，同时还受保存年限和保存方法的影响^[12-15]。不同保存年限和保存方法，尤其是不同含水量对小麦种子、灰芥种子的寿命变化^[13-14]和毛地黄种子活力的维持^[12]具有明显影响，拟南芥种子长时间保存后NADP-ME1影响了种子的萌发^[15]，而吸胀引发后的番茄种子在热激处理后却能延长寿命^[16]。种子的休眠与种子的寿命具有一定的关联性^{[13, 17]}。种子的休眠是一个受多种因素调控的过程，受到外界不同环境、内在激素及其代谢路径以及特异休眠基因（染色质因子）的协同调控^[18-20]，种子的后熟作用受到多对基因的调控，而种皮限制和含水量也是影响休眠的因素之一^[20]。近年来，研究发现很多激素与休眠的诱导和维持有关，如OsDOG1L-3^[21]、FLOWERING LOCUS T^[22]和AtPER1^[23]等都通过与ABA或GA激素路径相关来调控休眠。此外，活性氧ROS也与休眠和老化相关^[24]。在解除休眠的机制和方法方面也有一定研究，但分子机制仍不清楚，主要是利用层积（水分吸胀）、激素处理和一些化学物质来发挥作用^{[18, 20]}。有研究通过比较芥菜型蔬菜在不同条件下萌发，发现一段时间的低温和变温处理有利于打破休眠^[25]，而小白菜则需要通过GA和1%硝酸钾来打破休眠^[26]。【本研究切入点】种子在保存过程中会发生休眠，而且保存年限过长会影响种子的活力，芥菜型油菜种子在收获后会有一定程度的后熟休眠，而低温处理往往是打破休眠的一种方法，本研究立足于种子活力，分析芥菜型油菜适宜的保存时间和打破休眠的较佳处理方式。【拟解决的关键问题】本试验利用2个年份收获的芥菜型油菜种子，采用3个温度3个时长的处理，研究不同温度处理对芥菜型油菜种子活力和休眠的影响，以期获得芥菜型种子适宜的保存时间以及打破休眠促进发芽的适宜温度处理，为芥菜型蔬菜种子的保存和发芽提供一定依据。

1　材料与方法 1.1　试验材料

供试材料为2017年和2020年5月份收获的芥菜型油菜种子，材料来源于华中农业大学油菜研究室。所有种子收获后经过分选和晒种后保存于常温阴凉干燥的条件下。本试验于2020年9—12月在肇庆学院生物园油菜试验基地进行。

1.2　试验方法

两个年份的芥菜型油菜种子分别进行筛选和晒种后，挑选饱满且生长一致的种子，分别置于25℃、4℃和-10℃条件下进行低温预处理，每个温度条件下均设置处理24、48、72 h，处理过程中种子处于密闭环境并保持干燥。每次预处理完成后进行水培实验，在水培播种前，所有种子用75%酒精消毒1 min，用双蒸水漂洗3次约10 min。将不同时间处理的种子分别置于15 cm×15 cm的发芽盒中进行发芽试验。发芽盒中放置2层医用纱布，加入水培营养液，在播种后3 d内，将发芽盒覆盖防止盒子中水分蒸发过快，待种子长出幼根后打开盖子，整个过程纱布保持湿润。整个发芽和生长过程置于光照培养箱中进行，设置温度为25℃、光照时间16 h、黑暗时间8 h。各处理供试种子均为100粒，3次重复。

1.3　测定指标及方法

为测定芥菜型油菜种子的活力与休眠情况，分别记录种子发芽率、发芽势和每天出苗率，同时统计平均发芽时间、发芽指数和幼苗活力指数。发芽率的计算以芽长大于2 mm为标准，成苗数统计以幼茎直立、子叶平展、子叶由淡黄转为绿色为标准（大于1 cm），发芽势取播种后3 d的数据。

式中，Gt代表第t天发芽种子数，Dt代表播种后第t天^[27-28]；幼苗总长＝苗高+ 根长，一般以发芽终期（7~10 d）为调查时间。

利用Excel 2010和SPSS软件对数据进行整理、分析及作图，同时利用Photoshop和GraphPad Prism 5进行部分图片制作。

2　结果与分析 2.1　不同温度处理对芥菜型油菜种子萌发的影响

为研究种子萌发情况与温度处理的关系，对2017、2020年两个年份收获的芥菜型油菜种子分别进行4℃和-10℃的低温处理，以25℃为对照。结果发现，不同温度处理同一年份收获的种子的萌发和幼苗生长具有一定差异，但是同一温度不同时间处理对种子的萌发影响较小；而两个年份的种子萌发情况具有明显差异。由图 1可知，2017年收获种子的萌发情况较差，水培第10天的幼苗整体较弱、发芽数量很少，低温处理后种子萌发情况与25℃（CK）相比没有明显改变，不同处理时间对种子萌发也没有明显影响，仅4℃低温处理24 h对幼苗子叶伸展有一定促进作用，但萌发数量没有明显差异。

相比之下，2020年收获种子的萌发情况比2017年收获种子明显要好。由图 2可知，2020年收获种子萌发幼苗的生长情况良好，子叶伸展较好。值得注意的是，4℃处理72 h的幼苗长势优于24、48 h处理幼苗，而-10℃处理幼苗长势更优于25℃（CK）和4℃处理幼苗，尤其是幼苗根部更长。

2.2　不同温度处理对芥菜型油菜种子发芽活力的影响

2.2.1 2017年收获种子发芽率与休眠分析　2017年收获的芥菜型油菜种子由于存放时间较久，种子的发芽率整体水平较低、在20%以下（图 3A~图 3C），虽然同一温度处理的不同时间下会有显著差异，但是这种差异可能是随机取样误差（图 3A）；4℃和-10℃低温处理并不能显著提高种子的发芽率，发芽势也没有明显改变，我们推测在种子已经失去活力的情况下，无法通过低温处理改变其生理状态，因此，本研究认为芥菜型油菜种子经长时间常温保存后可能会失去活力，而并非进入休眠状态。

2.2.2 2020年收获种子发芽率与休眠分析　图 4显示，2020年收获芥菜型油菜种子的发芽率大多高于50%、明显高于2017年收获种子，且发芽势也极显著提高。2020年收获种子经4℃低温处理后，尤其是24 h较短时间处理后，其发芽受到明显抑制，随着处理时间延长，发芽率有所提高；图 4还表明，2020年收获种子在-10℃低温处理下，发芽率和发芽势都极显著高于25℃和4℃处理，处理后第2天超过60%发芽。可见，2020年收获种子活力比较旺盛，但是也存在休眠现象，-10℃处理可以打破休眠。

2.2.3 不同收获年份种子发芽指数与平均发芽时间比较　2017年收获芥菜型油菜种子与2020年收获种子的平均发芽时间和发芽指数均有显著区别，就发芽指数而言，2020年不同温度处理种子之间也有显著差异。表 1显示，2017年和2020年收获种子的平均发芽时间有一定差异，前者需约8 d发芽，而后者在处理后第6天就开始发芽，低温处理并不能显著改变种子发芽指数和发芽时间。

由表 1还可知，2017年和2020年收获芥菜型油菜种子的发芽指数差异极显著，且受低温处理影响较大。2017年收获种子的发芽指数整体上低于10，而2020年收获种子的发芽指数均在80以上。4 ℃处理条件下，2017年和2020年收获种子的发芽指数均较低、明显低于25℃（CK）和-10℃处理，而2020年收获种子-10℃处理的发芽指数明显提高。可见，2020年收获种子的活力明显高于2017年种子，且-10℃低温可以促进发芽，4℃有一定抑制作用。

2.3　不同温度处理对芥菜型油菜幼苗生长和活力的影响

同一年份收获的芥菜型油菜种子不同温度处理下，幼苗生长状况有所不同。2017年收获种子的成苗数较少、在15个以下，部分种子成苗数少于发芽数，是因为有些种子发芽后没有发育成壮苗。尽管25℃（CK）3个时间处理之间存在随机抽样误差，但是不同温度处理方式幼苗数还是表现出一定差异，尤其是4℃ 24 h处理成苗数极显著减少；2020年收获种子4℃处理成苗数极显著减少，-10℃处理成苗数却显著增加。

幼苗活力指数是反映幼苗长度和发芽率的综合指标。从图 5可以看出，2017年和2020年收获芥菜型油菜种子萌发产生的幼苗长度和活力指数具有较大差异，同一年份不同处理方式种子萌发产生的幼苗长度和活力指数也存在较大差异。2020年收获种子萌发产生的幼苗长度和活力指数极显著高于2017年收获种子；-10℃较短时间（24 h）处理有利于促进种子萌发产生的幼苗长度和活力指数的提高；4℃处理降低了2020年收获种子的幼苗活力指数，4℃ 24 h处理也降低了2017年种子的幼苗活力指数。可见，幼苗长度和活力指数受保存年限和低温处理的影响较明显。

3　讨论 3.1　2017年收获芥菜型油菜种子活力降低明显

本试验中，两个收获年份的芥菜型油菜种子的活力差异较大，保存年限越长，种子活力越低。研究发现，不同年份收获的小麦种子萌发率存在明显差异^[14]；毛地黄种子的发芽率不仅随着贮存时间的延长而降低，还与种子含水量呈负相关关系^[12]；灰芥种子在高温高湿环境中贮藏30 d后活力基本丧失，在干燥环境中放置400 d虽然活力下降但发芽率仍达50%^[13]。本研究结果与前人研究基本吻合，2017年收获种子的发芽率和成苗率等活力相关指标明显低于2020年收获种子，表明常温干燥保存的种子活力在3年后基本丧失。

3.2　芥菜型油菜种子收获后存在休眠现象

白菜^[26]、甘蓝^[29]、油菜^[30]和芥菜^[31]种子均存在一定的休眠机制。研究认为芥菜型油菜种子由于存在一定的生理后熟作用，因此存在一定的休眠，而这种休眠会随着干种子贮藏的时间而逐渐消除^{[25, 31]}。本研究发现，芥菜型油菜种子在收获后表现出一定的休眠现象。一方面，2020年收获的种子发芽率-10℃处理显著高于25℃对照，表明2020年收获的种子还未完全解除休眠，低温可以适当打破休眠；另一方面，2017年收获的种子不同温度处理发芽率和成苗数并未提高，所以本研究认为2017年收获种子没有进入休眠状态且种子活力基本丧失。

3.3　4℃短时间处理不利于提高芥菜型油菜种子活力

本研究发现，芥菜型油菜种子在4℃低温下的短时间处理不利于种子活力提高和幼苗生长。研究发现，低温层积（吸胀）作用可以在一定程度上打破休眠，主要是通过抑制转录因子SPT来解除其对赤霉素路径关键基因的抑制作用^[20]，而较长时间（4~7 d）的4℃低温处理有利于打破芥菜种子的休眠和提高种子活力^[25]。本试验中，24 h短时间4℃低温处理后，2017年和2020年收获种子的发芽率均显著降低，特别是2017年种子的成苗数和活力指数显著降低，2020年种子萌发产生的幼苗长度显著减少；随着4℃处理时间的适当延长，以上指标又恢复或超过25℃（CK）水平。因此，本研究认为在一定程度上（考虑到抽样误差的可能性），短时间4℃低温处理不利于芥菜型油菜种子的萌发和幼苗的生长，延长时间可能会消除副作用，推测可能是种子适应低温冷害并产生生理抵抗。

3.4　-10℃冷冻处理有利于芥菜型油菜种子打破休眠

本研究中，-10℃冷冻处理可能有利于打破2020年收获种子的休眠作用。2020年收获种子-10℃处理发芽率、幼苗长度和幼苗活力指数等均显著提高，关于-10℃对芥菜种子活力和打破休眠的研究较少，本研究推测可能是由于冷冻处理激发了种子内部某些代谢（激素）路径或生理指标的升高，或者抑制了休眠基因的表达等，产生的一些次级代谢产物或酶类有利于打破休眠和提高种子、幼苗的活力。2020年收获种子-10℃处理24、48、72 h有利于发芽率、幼苗活力指数和幼苗长度的增加，因此，本研究推测2020年收获种子存在休眠现象，且经-10℃低温处理可以有效打破种子休眠、提高种子活力。最终，本试验基本确定芥菜型油菜种子的休眠现象和保存年限，比较几种处理方式间的差异，对芥菜型蔬菜的育苗和种子生产具有一定的实践意义。

4　结论

芥菜型油菜种子收获后存在一定的后熟休眠现象，经过-10℃干燥条件下的冷冻处理后，发芽率从原来的65%提高至80%，幼苗长度和幼苗活力指数相应提高。但是在4℃短时间处理下，种子发芽率和幼苗活力受到一定程度的抑制，随着处理时间的适当延长，抑制作用减弱。相对于2020年收获种子而言，2017年收获种子的各项指标均显著下降。建议常温干燥条件下的芥菜型油菜种子保存年限在1年以内。