【研究意义】停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）是一种革兰氏阳性菌，呈链状或双球状，属于链球菌科（Streptococcaceae）链球菌属（Streptococcus）。停乳链球菌有两个亚种，即停乳链球菌类马亚种（Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis，SDSE）和停乳链球菌停乳亚种（Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae）^[1]。自2005年我国四川省暴发人感染猪链球菌病疫情以来，猪链球菌作为人兽共患病病原，引起公共卫生和科学研究领域的极大关注^[2-5]。而停乳链球菌被认为致病力不强，报道较少。但近年来越来越多的研究表明，猪的SDSE感染可引致仔猪关节炎、心内膜炎或脑膜炎，从而导致养猪业生产力下降^[6-10]。因此，对SDSE临床菌株进行研究，将有助于解决养猪生产实践中相似病例。【前人研究进展】猪、奶牛和山羊等动物感染停乳链球菌能引起菌血症、心内膜炎、关节炎，以及呼吸道和皮肤疾病等^[11-12]，大熊猫^[13]和狐狸^[14]等野生动物也有相关报道。Kasuya等^[6]报道，SDSE感染引起18周龄约克夏种母猪发生严重的散播性化脓性脑膜炎。Oh等^[8]报道，SDSE引起仔猪化脓性关节炎、脑炎、肾和心脏多灶脓肿。幸文定等^[7]报道，SDSE引起江西某猪场仔猪被毛粗乱、跛行和关节肿大。陈楠楠等^[9]报道，停乳链球菌停乳亚种引起东北民猪仔猪关节肿大、跛行，后期无法站立。【本研究切入点】目前对猪源停乳链球菌的相关报道仍然较少，在华南地区尚未有关于SDSE导致猪群患病的报道。2022年3月广东省肇庆市某规模化猪场的哺乳仔猪出现精神萎靡、关节肿大和跛行等症状，经剖检发现关节滑膜肿胀、充血和关节液浑浊，有必要对该病例进行深入分析。【拟解决的关键问题】本研究通过病原菌分离培养、形态和培养特性观察、16S rDNA扩增和测序、生化试验等鉴定方法，确定分离菌株为停乳链球菌类马亚种，并对分离菌株进行药敏试验、致病性试验及毒力基因鉴定，为临床猪源停乳链球菌病的防治提供参考。

1　材料与方法 1.1　试验材料

1.1.1 病料　2022年3月广东省肇庆市某规模化猪场有10余头哺乳仔猪出现精神萎靡、关节肿大和跛行现象。对病死仔猪进行剖检，并无菌采取2头发病仔猪的关节液。本研究相关试验在广东省农业科学院动物卫生研究所进行。

1.1.2 培养基及主要试剂　血琼脂平板、革兰氏染色试剂盒、生化鉴定管和其他培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司，抗菌药物药敏纸片和营养肉汤培养基购自杭州微生物试剂有限公司；基因组DNA提取试剂盒GeneJet Genomic DNA Purification Kit和DNA凝胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，PreMix ExTaq DNA聚合酶和DNA分子量标准为TaKaRa产品，PCR扩增引物由广州擎科生物有限公司合成。

1.1.3 试验动物　20只SPF级小鼠（体重约20 g）购于珠海百事通生物科技有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1 细菌分离及革兰氏染色镜检　无菌挑取病猪的关节液，接种于血琼脂平板上，37 ℃恒温培养24 h，次日观察菌落大小和形态。对分离到的细菌进行纯化培养，挑单个菌落接种到血琼脂平板上，并进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 16S rDNA鉴定　在血琼脂平板上无菌挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基中，37 ℃培养24 h后取2 mL菌液，用试剂盒提取细菌基因组DNA，采用扩增细菌16S rDNA的通用引物^[15]进行PCR反应（表 1）。PCR反应体系：2.5 μL 10×Buffer缓冲液，1 μL dNTP，上、下引物各0.25 μL，ExTaq DNA聚合酶0.3 μL，无菌去离子水24 μL，裂解产物1 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。用DNA凝胶回收试剂盒将PCR产物回收后，送广州擎科生物技术有限公司进行测序，所得序列在NCBI上利用BLAST在线工具进行分析。

1.2.3 细菌生化鉴定　挑取待检菌落接种于营养肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，取50 μL培养后的菌液接种于生化鉴定管中，分别进行过氧化氢酶（CAT）、VP、马尿酸盐水解酶、乳糖、甘露醇、蔗糖、水杨素、D-核糖、精氨酸双水解酶等系统的生化特性测定，生化鉴定管置于37 ℃培养24 h后观察结果。

1.2.4 毒力基因鉴定　以分离菌株的基因组DNA为模板，分别进行针对16SrDNA和毒力基因的PCR鉴定（表 1）。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、退火30 s（具体退火温度见表 1）、72 ℃ 60~90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳，用DNA凝胶回收试剂盒将PCR产物回收后，送广州擎科生物技术有限公司进行测序，所得序列在NCBI上利用BLAST在线工具分析比对。

1.2.5 药敏试验　按标准纸片琼脂扩散法进行操作，挑取分离菌株接入营养肉汤培养基中，37 ℃摇床培养24 h后，吸取100 μL菌液均匀涂布到血琼脂平板上，待平板上的液体完全吸收后，用无菌镊子将药敏纸片平贴于平板表面，在37 ℃培养箱中倒置培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。以变异链球菌（Streptococcus mutans，ATCC25175）作为质控菌株。

1.2.6 动物致病性试验　在正式试验前将小鼠饲养观察5 d，确定其健康状况良好。将20只健康小鼠随机分成对照组与攻毒组，每组10只。攻毒组小鼠经腹腔注射分离菌菌液，每只剂量为0.2 mL（3.0×10⁹ CFU/mL），对照组小鼠经腹腔注射等体积的TSB培养液（含10% 新生牛血清）。每天观察小鼠发病情况，对死亡小鼠立即剖检，无菌取心、肝和脾等脏器进行涂片和革兰氏染色，在显微镜下观察结果。未死亡的小鼠于第7天进行剖检。

2　结果与分析 2.1　临床剖检结果

病猪临床症状表现为倦怠无力、关节肿大及跛行，出现明显的运动障碍。剖检发现，其关节滑膜肿胀、充血，关节腔内关节液呈黄色粘稠状，肝脏、肾脏、肺脏均有淤血（图 1）。

2.2　分离菌株形态与培养特性

分离菌株在血琼脂平板上37 ℃恒温倒置培养24 h后，生长菌落呈灰白色，针尖大小，表面光滑，边缘整齐，菌落周围形成2~4 mm宽的透明溶血环（图 2），表现为β型溶血特征，与α型溶血的绿色溶血环有显著区别。对菌落进行革兰氏染色镜检，细菌为革兰氏阳性球菌，呈链状或双个形式存在^[1]（图 3）。

2.3　16S rDNA序列比对分析

将分离菌株的16S rDNA基因序列与GenBank中的已知核酸序列进行在线BLAST比对，结果表明，分离菌株的16S rDNA基因序列与分离自日本熊本市的SDSE序列AB537922相似性达到100%，与源自日本的AB104840和CP053074的相似性分别为99.29%^[18]和99.21%^[19]。

2.4　细菌生化特性鉴定结果

分离菌株在10 ℃和45 ℃下均不生长；VP试验、过氧化氢酶（CAT）检测均为阴性；不能利用乳糖、甘露醇，可利用蔗糖、水杨素、D-核糖、马尿酸盐，不能水解精氨酸。以上结果与停乳链球菌的生化特性相符。

综上，结合16S rDNA序列比对分析、溶血类型和生化特性鉴定结果，将该分离菌株鉴定为SDSE。

2.5　毒力基因鉴定结果

针对SDSE的8种常见毒力基因进行PCR鉴定，结果（图 4）表明，分离菌株 eno、napr、lmb、scpB和 cyl基因的PCR检测均获得单一的特异性条带；BLAST分析表明，测序序列与NCBI报道的停乳链球菌相应基因序列完全一致；cfb、bca和 bac基因的PCR检测结果为阴性。

2.6　药敏试验结果

对分离菌株进行药敏试验，结果表明，该菌株对头孢曲松、头孢克洛、青霉素G、头孢氨苄、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺异恶唑、大观霉素、恩诺沙星较敏感，对丁胺卡那、多西环素、多粘菌素B、诺氟沙星、氨苄西林次敏感，而对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、林可霉素、阿莫西林表现出耐药性（表 2）。

选用分离菌株的敏感药物头孢氨苄和环丙沙星对发病仔猪进行治疗，仔猪关节肿大、跛行等运动障碍得到有效控制。

2.7　动物致病性试验结果

10只攻毒组小鼠接种后4 h，均出现精神萎靡、被毛粗乱、蜷缩扎堆等现象；24 h内3只小鼠死亡（表 3），经剖检发现，死亡小鼠肺脏明显出血并伴有坏死点，肝脾肿大且颜色变暗；其余7只小鼠均出现一定程度的肝脏肿大和肺部病变。对照组小鼠无死亡，剖检未见明显异常。

用死亡小鼠病变组织涂片后进行革兰氏染色镜检，发现存在大量革兰氏阳性球菌。对死亡小鼠病变组织进行优势菌分离和16S rDNA扩增测序，得到的序列与原分离菌株完全一致。

3　讨论

1984年，Farrow等^[20]证实停乳链球菌，类马链球菌和兰氏C群、G群和L群链球菌为同一种属。1998年，Vieira等^[21]利用多位点酶切电泳分型技术，将兰氏C群的α型溶血和不溶血的停乳链球菌命名为停乳链球菌停乳亚种，将兰氏C群、G群和L群的β型溶血链球菌命名为停乳链球菌类马亚种（SDSE）。由于停乳链球菌在猪病临床上未受重视，因此我国对猪源停乳链球菌的报道较少，已有的研究也常混淆停乳链球菌的分类，如把停乳链球菌全部归为兰氏C群^{[7, 10]}。实际上，1985—1994年分离到的猪停乳链球菌中，45.8% 属于兰氏C群，25.3% 属于兰氏L群，6.5% 属于兰氏G群^[22]。本研究从发病猪关节中分离优势菌，结合16S rDNA序列比对分析、溶血类型观察和生化特性鉴定结果，将该分离菌株确定为SDSE，是华南地区首次关于致病性猪源停乳链球菌的报道。

人类源性SDSE经常引起咽喉、皮肤和软组织的感染，甚至可能侵入血液系统并广泛传播到心内膜等深层组织部位，引起危及生命的侵袭性感染^[23-25]。人类源性SDSE感染以上呼吸道症状为主，主要通过空气飞沫和食物传播，且有SDSE引起群体性发热的报道^[26]。尽管许多研究报道动物源性SDSE与人类源性SDSE不同，但多项研究表明，SDSE相关的人类链球菌病可能是一种人畜共患病^[27-29]。因此，SDSE在兽医临床上不可忽视，而且其还具有公共卫生意义。

napr和 eno基因编码的结合宿主纤溶酶原蛋白，有助于感染和定殖宿主^[12]，纤溶酶原向细菌表面汇聚是促进细菌粘附细胞表面的关键致病机制。lmb基因编码的层胶结合蛋白在促进与宿主层胶粘连中起关键作用，已在人分离的停乳链球菌中检测到^[30]。cyl基因编码的β-溶血素主要增强细菌对宿主的侵袭^[31]。scpB基因可以编码表面酶scpB，这是一种C5a肽酶，可以阻碍中性粒细胞聚集，并与纤维连接蛋白结合，促进细菌对上皮细胞的侵袭。scpB基因的表达是B型链球菌引起新生儿严重感染的主要决定因素之一^[12]。本研究对分离的SDSE进行毒力基因鉴定，确定分离菌株的基因型为 eno + napr + cfb - lmb + bca - bac - scpB + cyl+。小鼠致病性试验结果表明，分离菌株可引起小鼠内脏病变和死亡，表现显著的致病性。本研究通过药敏试验选用分离菌株的敏感药物可有效控制临床症状，为猪停乳链球菌病的临床治疗提供参考。

4　结论

本研究从规模化猪场发病仔猪的关节液中分离到优势菌株，根据分离菌株的形态特征、生化特性，结合16S rDNA序列测定及在线BLAST分析结果，确定为链球菌属的SDSE。毒力基因PCR鉴定结果表明，该菌株的基因型为 eno+ napr+cfb-lmb+bca-bac-scpB+cyl+。小鼠致病性试验结果表明，分离菌株导致小鼠内脏病变和死亡，表现出显著的致病性。抗生素敏感性试验结果表明，分离菌株对头孢曲松、头孢克洛、青霉素G、头孢氨苄、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺异恶唑、大观霉素、恩诺沙星敏感，对丁胺卡那、多西环素、多粘菌素B、诺氟沙星、氨苄西林次敏感，而对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、林可霉素、阿莫西林表现出耐药性。