【研究意义】辣椒是世界上栽培最广泛的蔬菜作物之一，广泛应用于蔬菜、香料、食品添加剂和化工提取等行业^[1]。中国辣椒（Capsicum chinense）是辣椒的5个主要栽培种之一，种内大部分品种具浓郁果香。果香能使人精神愉悦，是很有价值的商品性状^[2]。中国辣椒果实中呈现果香的物质主要为支链酯类物质^[3]。醇酰基转移酶（Alcohol acyl-CoA transferase，AAT）催化支链酯类合成的最后一步反应，是影响支链酯类含量的重要因素^[4]。开展AAT基因家族的鉴定及表达分析，能为进一步研究其功能、探究中国辣椒果实香气合成机理提供理论基础。【前人研究进展】 AAT属于酰基转移酶（BAHD）家族，催化酰基基团从酰基CoA供体转移至醇类受体分子，形成酯类物质^[5]，含有2个保守基序，分别是HxxxD基序和DFGWG基序，其中HxxxD基序与催化作用相关，相关研究推测DFGWG基序仅起结构作用^[6]。AAT基因家族的鉴定、表达分析及功能验证工作已在多种植物中展开。温思为等^[7]从蔷薇科植物中鉴定出多个AAT基因（苹果7个、梨4个、杜梨6个、桃8个、凤梨草莓7个）。曹香梅^[8]在桃子中筛选出28个AAT基因，其中PpAAT1转录本数量最多，进一步研究发现，PpAAT1可催化挥发物质γ-癸内酯的合成，通过与PpCXE1协同作用，共同调控酯类物质代谢。在茄科作物中，番茄的SlAAT1能直接影响番茄果实的酯类物质含量变化^[9]，通过底物测试发现SlAAT1对1-戊醇底物有极强的特异性偏好。Souleyre等^[10]从苹果中鉴定到MdAAT1并证明其为酯类物质合成的关键基因。在成熟前期，苹果果肉组织中的AAT基因表达量和相关酶活性显著提高，同时酯类物质合成增加。Li等^[11]发现苹果中转录因子MdMYB1和MdMYB6结合后激活MdAAT2启动子，调控苹果酯类物质的合成。PpNAC1或PpNAC2转录因子与桃PpAAT1基因的启动子结合后可激活其表达^[12]。猕猴桃转录因子AcNAC4可直接调节AcAAT10的表达，参与丁酸乙酯和丁酸甲酯的合成积累^[13]。草莓SAAT基因编码的蛋白具有催化支链酯类形成的能力^[14]。原核表达功能验证发现哈密瓜CM-AAT1编码的蛋白质具有合成酯类物质的功能^[15]。Shalit等^[16]在月季花EST数据库中发现3个与BAHD醇酰基转移酶相似的基因。【本研究切入点】AAT是影响呈果香的支链酯类物质含量的重要酶，但目前辣椒中还未有对其相关基因家族的系统研究。【拟解决的关键问题】本研究拟通过对中国辣椒AAT基因家族的生物信息学鉴定和表达模式分析，明确中国辣椒基因组中AAT基因的数目及分布并获得其时空表达特征，为辣椒支链酯类物质代谢机理研究提供理论支持。

1　材料与方法 1.1　试验材料

供试材料为中国辣椒品种‘金田1号’，2022年7月播种，8月定植于广东省农业科学院白云基地。在植株出现首花后第5周，分别取植株距离地面5 cm处的地下侧根、嫩茎、顶端幼叶、花和花后第1~5周的果实，采集后放入液氮速冻，转入-80 ℃超低温冰箱待用，设3个生物学重复。

1.2　试验方法

1.2.1 中国辣椒AAT家族基因的鉴定　基于下载自NCBI的中国辣椒基因组数据^[17]和已报道的其他物种AAT蛋白序列，在Pfam网站（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）下载AAT（PF07247）的hmm文件，使用HMMER（V3.3.1）软件和TBtools（V1.09876）软件对蛋白质的氨基酸序列进行比对（E-value < 1×10^-5，其余参数默认）。通过在线BLAST、hmmsearch及hmmbuild和hmmsearch联用的方法对辣椒AAT基因家族成员进行鉴定后，使用MEGA与植物中已鉴定的AAT基因相应的蛋白序列共同绘制进化树。已报道的其他物种AAT基因信息见表 1。

1.2.2 中国辣椒AAT蛋白的理化性质、亚细胞定位、结构预测和系统进化分析　使用在线工具ExPASy（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）对中国辣椒AAT蛋白序列进行理化性质分析，包括分子质量、氨基酸数、等电点、不稳定指数、平均亲水系数、脂肪族指数等。利用Plant-mPLoc网站（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）进行亚细胞定位预测。使用在线工具SOPMA (https://swissmodel.expasy.org) 对蛋白的二级结构进行预测, 使用SWISS-MODEL（http://alternate.meme-suite.org/tools/meme）构建中国辣椒AAT蛋白的三维结构模型。使用邻接法对中国辣椒与其他已鉴定物种的AAT蛋白序列进行比对分析，利用MAGA软件构建进化树。

1.2.3 中国辣椒AAT基因家族的染色体定位、保守基序和基因结构分析　从中国辣椒基因组注释文件中筛选出AAT基因的染色体定位数据，利用MapChart软件制作AAT基因的染色体定位图，分析各AAT基因在染色体上的分布情况。通过MEME数据库（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析蛋白基序，Motif搜索数为20；利用基因结构GSDS 2.0（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析软件，对AAT基因序列进行内含子和外显子结构分析。利用PlantCARE（10.7666/d.d143420）分析网站，对AAT基因家族成员启动子区的顺式作用元件进行预测分析，结合TBtools进行可视化分析。

1.2.4 中国辣椒AAT家族基因时空表达分析　使用RNA提取试剂盒（全式金，北京）提取辣椒根、茎、叶、花和各个时期果实的总RNA；使用反转录试剂盒（TaKaRa，大连）进行反转录，操作方法参照说明书进行。使用荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM（TaKaRa，大连）进行基因表达量分析，荧光定量PCR采用25 μL体系，扩增程序为95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线绘制程序为：65~95 ℃之间每0.5 ℃依次读板，每个样品设3个生物学重复，每组生物学重复设3个技术重复。目标基因相对表达量计算使用2^-ΔΔCT法。荧光定量PCR引物信息见表 2。

2　结果与分析 2.1　中国辣椒AAT基因鉴定及理化性质分析

通过隐马尔可夫模型、AAT保守结构域和BLAST 3种方法筛选获得中国辣椒10个AAT基因，分别命名为CcAAT1-10。

生物信息学分析结果（表 3）显示，中国辣椒AAT蛋白编码的氨基酸平均数为386.4 aa，最大值为683 aa，最小值为256 aa。筛选出的分子质量范围为29~77 kDa，等电点范围为5.34~8.79。平均亲水系数均小于0，说明该类基因所表达的蛋白质为亲水性蛋白。不稳定指数在23.76~51.02之间，CcAAT6、CcAAT9、CcAAT10蛋白性质稳定性较好，CcAAT5和CcAAT7的蛋白质稳定性较差，其余蛋白不稳定指数在40左右、相对稳定。根据亚细胞定位预测可了解到，所筛选出中国辣椒AAT均定位于细胞质中。

2.2　中国辣椒AAT蛋白结构预测

对AAT基因家族编码的蛋白结构预测结果显示，其编码的蛋白由α螺旋、延伸链、β-转角和无规卷曲4种元件组成。其中，α-螺旋和无规则卷曲的含量相对较高(表 4)。在CcAAT2、CcAAT6和CcAAT9中，α- 螺旋所占比例最高，为41.23%~47.27%；而在CcAAT4、CcAAT5和CcAAT7中，无规则卷曲所占比例最高，为45.86%~46.90%。利用SWISS-MODEL构建蛋白的三维结构模型，发现10种AAT蛋白三维结构差异明显（图 1）。所有的蛋白结构中均有不少于4个的β- 转角结构，说明中国辣椒AAT在功能上可能存在分化，又具有一定的保守性。

2.3　中国辣椒AAT蛋白系统进化树分析

将筛选获得的中国辣椒AAT蛋白序列与其他物种AAT蛋白进行序列比对分析，并构建进化树。结果（图 2）显示，CcAAT2、CcAAT3、CcAAT5、CcAAT8位于同一分支，与草莓的SAAT、甜瓜的CmAAT4、月季的RhAAT1亲缘关系较近，CcAAT7与CcAAT4位于同一分支，与康乃馨中的DcAAT亲缘关系较接近，CcAAT9与猕猴桃中的AdAAT1亲缘关系较近，CcAAT6、CcAAT10与番茄中的SIAAT1关系比较接近。

2.4　AAT家族基因的染色体定位、保守基序和基因结构分析

通过MapChart制作的染色体定位图（图 3）可见，CcAAT1、CcAAT2位于1号染色体，CcAAT3、CcAAT4位于3号染色体，CcAAT5位于5号染色体，CcAAT6位于7号染色体，CcAAT7位于9号染色体，CcAAT8位于11号染色体。CcAAT9和CcAAT10则暂无明确的染色体定位信息。

将中国辣椒AAT蛋白序列提交到MEME网站进行保守基序分析，结果（图 4）显示，CcAAT成员共包含12个保守基序，CcAAT1、CcAAT3~5、CcAAT8、CcAAT10具有相对保守的基序8、4和基序1、5共同组成的结构。聚类结果显示其亲缘关系较接近，位于同一分支的序列之间有较强保守性。

基因结构对基因的表达有重要影响^[18]。为探索AAT家族基因的结构多样性，本研究对其外显子、内含子和非编码区进行分析。结果（图 5）显示，CcAAT6、CcAAT8和CcAAT9基因为连续基因，无内含子；CcAAT1、CcAAT2含2个内含子，CcAAT4、CcAAT5、CcAAT7含有1个内含子，CcAAT3含有6个内含子。在进化树上处于同一个分支的成员具有相似的基因结构。由于CcAAT10来自直接提交的序列，因此无法进行基因结构和启动子区域顺式作用元件的分析。

使用Plant CARE数据库对CcAAT1-9的5’端上游2 000 bp进行了顺式作用元件分析（图 6）。共发现16种顺式作用元件，其中激素响应相关原件最多，主要包括脱落酸响应元件、赤霉素响应元件、生长素响应元件、茉莉酸响应元件和水杨酸响应元件。其次是光响应相关元件，它们在所有基因的启动子区域都存在。低温响应元件和厌氧诱导相关元件存在于部分家族基因的启动子中。以上结果表明，中国辣椒AAT家族成员可能具有差异化的生物学功能，主要受到植物激素和光照调控。

2.5　AAT基因家族成员时空表达分析

使用实时荧光定量PCR分析CcAAT1-10的时空表达情况，结果（图 7）显示，CcAAT5和CcAAT6未检测到表达，CcAAT1、2、8在根中不表达，CcAAT8在茎中不表达，CcAAT8、9在叶片中不表达，CcAAT9在果实中未检测到表达，剩余基因在植株各部分均检测到表达。CcAAT10和CcAAT8分别在花和果实中具有较高的相对表达量。CcAAT1在叶片中检测到较高的表达。CcAAT2在果实发育的第一个时期表达量较高。CcAAT3和CcAAT4在果实中表达量较低。CcAAT1、3、4、10在果实中检测到持续的表达，其中CcAAT1在果实发育过程中表达呈上升趋势，CcAAT10呈先升后降趋势，CcAAT3和CcAAT4呈先降后升趋势。

3　讨论

支链酯类是中国辣椒果实中的重要香气成分，AAT是催化支链酯类合成中最后一步反应的关键酶。对AAT基因家族的鉴定和分析可为AAT功能研究打下理论基础，助力辣椒果实香气形成机理研究及品质育种。本研究通过生物信息学分析在中国辣椒基因组中鉴定到10个AAT基因。已报道的AAT基因还有10种蔷薇科果树中64个^[7]、甜瓜中3个^[15]、番茄中5个^[19]、月季中3个^[16]等。与已报道的物种相比，中国辣椒中的AAT基因相对校多，这也暗示其果香物质的合成调控机理可能更加复杂。在甜瓜^[20]、苹果^[21]、草莓^[22]中均已对AAT功能展开研究，其在辣椒中的功能有待进一步验证。

顺式作用调节元件可以通过与特定转录因子结合，在生物或非生物胁迫、植物激素响应和生长进程等多种过程中参与转录调控^[23]。在AAT基因家族顺式元件分析中，除了核心启动子元件外，共发现16种顺式调控元件，与生长发育调节相关的元件有9个，分别与脱落酸响应、茉莉酸响应、赤霉素响应、低温响应、生长素响应、水杨酸响应、玉米醇溶蛋白代谢调节、昼夜规律调节、细胞周期调节相关。5个防御相关的元件，包括光响应、防御和应激、缺氧诱导、厌氧调控，以及干旱诱导调控相关的元件。光响应元件和脱落酸响应元件出现在所有基因中，其余大部分元件分布在不同基因上，由此可推测出，AAT基因家族多数基因参与中国辣椒生长发育调控和胁迫响应，并有可能参与中国辣椒的各个不同生理调节，说明AAT基因广泛参与调节中国辣椒的各项生命活动。这与当前的苹果^[24]、梨^[25]、番茄^[26]等研究结果相似。

基因时空表达在一定程度上能够反映出该基因的功能特性^[27]。本研究的表达分析结果显示，在不同的组织部位和果实不同生长发育时期，AAT的表达量存在差异。本次测定的10个AAT基因有8个在中国辣椒植株中表达，2个不表达。根据其在不同时期的表达量可以推测出AAT基因家族成员基本参与了辣椒生长发育、开花结果等多项生理过程。不同的AAT基因家族成员参与调节着植物体多个不同生理活动，如King^[28]等研究发现矮牵牛中AAT与其花瓣表皮覆盖的阻断水分流失的蜡酯合成有关。本研究发现，CcAAT8基因在花和果实中特异性表达，其表达量随着果实成熟先增加后下降。这种表达模式与‘金田1号’辣椒果实中的支链酯类物质变化趋势相似^[2]。此结果说明该基因有可能参与辣椒酯类香气的合成。CcAAT8在‘金田1号’中的时空表达结果与梨^[29]、葡萄^[30]和草莓^[31]中的AAT基因表达模式相似。这一现象暗示CcAAT8可能是影响辣椒果实支链酯类物质合成的重要基因。要明确其具体功能及调控模式，后续还需开展功能验证及调控机理研究。

4　结论

通过生物信息学的方法鉴定出中国辣椒基因组中10个AAT基因，分析了其蛋白质理化性质、二级结构、三级结构、活性位点和作用位置。预测到10个基因分布于6条染色体上，其启动子区域包含16种顺式调控元件，主要为激素响应元件。时空表达分析显示，鉴定到的10个基因家族成员中，除CcAAT5和CcAAT6以外，都能在中国辣椒植株中检测到表达。CcAAT8在花和果实中特异表达，且表达量变化趋势与果实支链酯类物质含量变化趋势一致，可能是影响辣椒果实支链酯类物质合成的重要基因。本研究结果为辣椒AAT基因家族功能和辣椒香气物质合成机理提供了理论基础。