【研究意义】我国海域辽阔，海藻资源丰富，具有经济价值的大型海藻有100多种^[1]。海藻富含多种营养物质，能够有效改善土壤并对植物生长产生积极作用，且获取方便、成本低廉，是一种优良的肥料原料^[2-3]。但当前海藻肥产品质量参差不齐、市场占有率低，限制了其在农业上的应用。海藻肥的品质不仅受到原料和剂型的影响，还易受到制备工艺的影响。研究海藻肥的发酵工艺条件及其对作物生长的影响，对提高海藻肥产品质量、加速其在农业上的推广使用有重要意义。【前人研究进展】生物法制备海藻肥因其反应温和、简单可控且能最大程度维持海藻中的生物活性而备受推崇^[4]。马尾藻（Sargassum）是一类常见的热带亚热带海洋大型褐藻，广泛分布于热带和亚热带海域的近岸低潮带和潮下带^[5-6]利用马尾藻制备的海藻肥，富含大量非含氮有机物及钾、钙、镁、铁等40余种矿物元素和丰富的维生素，其特有的海藻多糖、海藻酸和多种天然植物生长调节剂，可刺激植物体内活性因子的产生、调节内源激素的平衡、促进植物生长、提高植物品质和抗逆性，且具有无毒、无污染、易降解等特点，在发展环境友好型农作物种植方面发挥着重要作用^[7-10]。Sivasankari等^[11]从马尾藻提取物中检测出磷、铁、氯、锌等植物生长所需的营养元素。王明鹏等^[12]利用混合菌群发酵马尾藻制备的海藻肥料可促进小麦种子萌发及根生长。王旭承等^[13]在铁皮石斛幼苗的人工栽培中通过喷施适宜浓度的海藻肥提高了植株的抗低温能力。肖毓淼等^[14]用海藻肥处理低温胁迫下的杂交兰，发现海藻肥可缓解丙二醛积累及叶绿素降解，同时也增强了过氧化物酶活性。【本研究切入点】辣椒（Capsicum annuum L.）为茄科辣椒属植物，是海南省重要的冬季果菜作物。辣椒在生长发育过程中如遇15 ℃以下低温会对辣椒造成危害。海南虽地处热带，但冬季仍受北方冷空气影响，低温是限制海南省辣椒生长的重要因素之一^[15-17]。而已有研究表明，海藻有机肥可提高植物的非生物逆境胁迫（如低温、干旱等）^[18]。【拟解决的关键问题】对马尾藻进行固态发酵制备海藻肥并研究其对辣椒抗寒性的影响，为马尾藻在农业上的应用提供依据，进一步推广海藻肥在农业上的使用。

1　材料与方法 1.1　试验材料

试验于2016年12月至2017年4月在中国热带农业科学院热带生物技术所植物栽培室开展。供试孤囊马尾藻（Sargassum oligocystum）采自海南省文昌市海域，经淡水清洗去盐后，自然条件下晒干并粉碎、包装待用（以下简称马尾藻）。供试发酵菌株（枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌）为实验室保存。鸡粪、椰糠和桐子饼购自海口吉盛隆农业开发有限公司，市售有机肥（尧喜有机园艺有限公司）为尧喜鸡粪发酵有机肥，玉米和辣椒的种子购自合肥市合丰种业有限公司。

1.2　发酵原料的成分检测

马尾藻有机肥发酵原料为马尾藻（成分见表 1）、鸡粪、椰糠和桐子饼，其中鸡粪、椰糠和桐子饼有机质含量分别为72.16%、76.03%、87.36%；全氮含量分别为1.03%、0.55%、3.66%；全磷含量分别为1.66%、0.37%、1.58%；全钾含量分别为1.26%、1.38%、3.00%；含水量分别为41.15%、66.10%、9.36%；碳氮比分别为40.64、80.18、13.85；pH分别为8.15、7.61、7.56；以上指标均以干基计。发酵原料成分检测委托海南省农业科学院农业环境与土壤研究所农业化学分析测试中心进行。

1.3　发酵菌剂制备与发酵堆体处理

对枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌3株菌进行分别发酵（活性均≥ 400 u/mL）。菌种活化培养基：葡萄糖5.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母粉1.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7；发酵培养基：褐藻酸钠5.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母粉1.0 g、NaCl 10.0 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7。121 ℃灭菌20 min。3株菌的发酵菌液按体积比1∶1∶1混合制成发酵菌剂（有效活菌数≥ 3×10⁸ CUF/mL）。

发酵堆体直径约1.0 m、髙0.7 m，堆体上覆盖塑料薄膜进行发酵。每3 d充分均匀的翻堆1次，堆体中心温度＞65 ℃时加翻1次。发酵周期为20 d，每天测定堆体温度（重复3次取平均值），并定期观察堆体颜色、气味和蓬松度，堆体温度越高且高温持续时间越长，对发酵越有利。

1.4　马尾藻有机肥发酵工艺优化

1.4.1 碳氮比　根据发酵原料成分设置3个发酵碳氮比水平∶碳氮比20∶1（马尾藻10%、鸡粪45%、桐子饼35%），碳氮比25∶1（马尾藻10%、鸡粪55%、桐子饼25%），碳氮比30∶1（马尾藻10%、鸡粪65%、桐子饼15%）。依据发酵原料的含水量情况调整发酵堆体初始含水量至50%左右，添加发酵菌剂（接种量2%，w/w）后，充分混合。以堆体温度为指标，确定发酵最佳碳氮比。

1.4.2 初始含水量　在最佳碳氮比的基础上，分别调节各发酵堆体的初始含水量约至40%、50%、60%。添加发酵菌剂（接种量2%，w/w），以堆体温度为指标，确定发酵的初始含水量。

1.4.3 发酵菌剂　通过试验得出最优碳氮比和起始含水量后，进行添加发酵菌剂（接种量2%，w/w）和不添加菌剂的试验，验证添加发酵菌剂对有机肥发酵的影响（前期预试验得出接种量2%最佳）。

1.5　马尾藻有机肥的品质评价

马尾藻有机肥成分检测委托海南省农业科学院农业环境与土壤研究所农业化学分析测试中心进行，其中有机质、全氮、全磷、全钾、pH、含水量的测定按NY/T 525-2021操作，蛔虫卵的测定按GB8172操作，粪大肠杆菌群的测定按GB4789操作，重金属砷、汞、铅、镉的测定采用GB18877-2002的规定，海藻酸检测依据HGT5050-2016。

种子发芽率测定：设置蒸馏水（CK）、市售有机肥、马尾藻有机肥3个处理，每个处理3次重复。将马尾藻有机肥风干并粉碎，以固液比1∶10浸提，取浸提液8 mL置于垫有滤纸的培养皿内，放置饱满玉米种子50粒，培养箱25 ℃培养96 h，计算种子发芽率：发芽率（%）=发芽种子粒数/种植总粒数×100。

1.6　马尾藻有机肥对辣椒抗寒性影响

选取饱满、整齐的辣椒种子50粒，55 ℃温水浸种4 h后，置于30 ℃恒温箱内催芽72 h，选择出芽一致的种子播种于32孔穴盘中（规格：4×8 ＝ 32孔），每穴1株，育苗期间按常规方法管理。选择长势一致的辣椒幼苗移植入花盆（直径18 cm，高10 cm）进行不同施肥处理：空白（CK）、市售有机肥、马尾藻有机肥，每个处理3次重复，每个重复10株辣椒幼苗。其中，空白处理土壤为基质土，市售有机肥处理土壤为市售有机肥: 基质土＝ 1∶2，马尾藻有机肥处理为马尾藻有机肥: 基质土＝ 1∶2。自然条件下生长3 d后，置于人工智能气候箱低温胁迫处理：昼温/夜温为15 ℃ /10 ℃、光照强度8 000 lx、光周期12 h/12 h下预处理1 d，再于昼温/夜温为10 ℃ /5 ℃、光照强度8 000 lx、光周期为12 h/12 h下连续处理5 d，随机剪取不同处理幼苗的3片叶测定相关生理指标。通过对辣椒低温胁迫处理前后的冷害指数^[22]、可溶性糖质量^[23]、丙二醛^[24]、脯氨酸^[23]质量指标来判断马尾藻有机肥对辣椒抗寒性的影响。

1.7　数据分析

使用Microsoft Excel 2016进行平均值、标准差数据处理。使用SPSS 2022进行显著性分析。

2　结果与分析 2.1　碳氮比对马尾藻有机肥发酵的影响

由图 1可知，随着不同条件变化，马尾藻有机肥固态发酵的温度变化亦不同。碳氮比为20∶1时，温度上升缓慢，第6 d上升至55 ℃左右并保持3~4 d，最高温度为60 ℃，第14 d降至40 ℃左右并保持平稳；碳氮比为25∶1时，第3 d上升至55 ℃并保持8~9 d，最高温度为69 ℃，第16 d温度降至40 ℃左右，并保持平稳；碳氮比为30∶1时，第3 d上升至55 ℃并保持6~7 d，最高温度为63 ℃，第15 d下降至接近40 ℃并保持平稳。根据高温持续时间可知，碳氮比为25∶1时对马尾藻有机肥发酵最有利。

2.2　初始含水量对马尾藻有机肥发酵的影响

最佳碳氮比（即25∶1）的基础上，初始含水量为40%、50%、60%时对马尾藻有机肥发酵的影响如图 2所示。3个处理的发酵周期均为20 d左右，且温度变化趋势基本相同，但最高温度和高温持续时间不同。初始含水量40%时，最高温度达65 ℃，55 ℃以上保持5~6 d；含水量50%时，最高温度达69 ℃，55 ℃以上保持6~7 d；初始含水量60%时最低，最高温度为61 ℃，55 ℃以上保持5~6 d。3个处理的堆体温度在第14 d下降至40 ℃左右并开始保持平稳。整个发酵周期内，最初含水量为50%时，温度保持较高水平且持续时间最长，因此初始含水量为50%时马尾藻的发酵效果最优。

2.3　添加发酵菌剂对马尾藻有机肥发酵的影响

在最优发酵条件（碳氮比为25∶1，含水量为50%）下，使用发酵菌剂进行马尾藻有机肥发酵试验。从图 3可知，添加菌剂的发酵堆体温度在第3 d显著升高，最高温度为68 ℃，55 ℃以上维持6~7 d；未添加菌剂的发酵堆体温度在第4 d升高，但最高温度仅56 ℃，50 ℃以上仅维持4 d。且均在第15 d时温度基本降至环境温度，后期保持稳定。上述结果表明，马尾藻有机肥发酵过程中，添加发酵菌剂时，初期温度升温迅速，温度较高且高温维持时间长，发酵效果优于不添加菌剂。

2.4　马尾藻有机肥的品质评价

2.4.1 成分检测及外观特征　本试验研究的马尾藻有机肥腐熟后颜色为褐色或黑褐色，无恶臭气味，组织状态柔软腐烂、捏拉易碎。如表 2中的数据显示，发酵产物的总养分质量分数为5.42%（干基计）、有机质质量分数为72.46%（干基计）远远高于标准规定，水分（鲜样）的质量分数低于30%，pH为7.5，重金属元素、粪大肠杆菌群个数均明显低于国家标准（NY/T 525-2021），蛔虫卵杀灭率达到99%。因此，经过高温发酵处理后的马尾藻有机肥符合国家标准。

2.4.2 种子发芽率检测　有研究表明，发酵产物不影响种子的发芽，若发酵有机肥中含有植物毒性物质，将对植物的生长萌发产生抑制作用。表 3中数据显示，添加马尾藻有机肥浸提液对玉米种子发芽率有一定提高、达88%，显著优于对照组，表明发酵制备的马尾藻有机肥对作物发芽安全无害。

2.5　马尾藻有机肥对辣椒抗寒性的影响

施用马尾藻有机肥对提高辣椒幼苗抗寒性效果明显（表 4），与对照相比，冷害指数降低了20.70%、丙二醛质量分数降低了23.41%、可溶性糖和脯氨酸质量分数分别提高了27.96%、15.49%；比市售有机肥相比，冷害指数降低了13.49%、丙二醛质量分数降低了14.18%、可溶性糖和脯氨酸质量分数分别提高了21.94%、9.01%。结果表明马尾藻有机肥可有效提高辣椒幼苗的抗寒性。

3　讨论

有机肥发酵中的微生物代谢活动受温度的密切影响，发酵初期堆体温度上升迅速，同时微生物开始剧烈活动，使温度超55 ℃且维持一段时间，并且在高温期间杀死了堆体中的虫卵等有害体^[25]。随着易分解的蛋白质、脂肪、单糖等物质逐渐消耗殆尽，微生物活动开始受阻，进入内源呼吸状态，堆体温度开始逐渐降低。本研究通过对不同碳氮比（20∶1、25∶1、30∶1）堆体发酵温度变化比较，发现碳氮比为25∶1时，堆体初期升温更快且维持时间长，最高可达69 ℃，这可能是由于合理的碳氮比为微生物的生长提供了优异的环境。碳氮比20∶1时升温缓慢分析认为是因为添加鸡粪辅料减少、碳源不足导致；碳氮比30∶1时，因氮源不足，微生物生命力较弱，导致高温维持时间短、升温低^[26]。有研究表明，碳氮比为25∶1时发酵处理效果最好，堆体升温最快，高温持续时间最长^[27]，这与本研究结果一致。初始含水量40%、50%、60%的堆体温度变化趋势虽然基本相同，但3个处理组的最高温和高温维持时间不同。这可能是由于初始含水量过低，堆体无法充分溶解有机物，微生物摄取的溶解性养料不足，使得发酵高温维持时间短，而过高的初始含水量造成内部游离空隙被水膜填充，造成供氧不足限制微生物活动，并且堆体水分蒸发带走热量，导致堆体达不到适宜高温^[28]。添加发酵菌剂使马尾藻堆体中有机物充分降解，促进腐熟，升温快且高温维持时间长，刘艳婷等^[29]研究发现添加不同配比的微生物菌剂能促进发酵的效果。

发酵马尾藻有机肥品质检测各项指标均符合有机肥国家标准NY/T 525-2021，玉米种子萌发实验初步验证马尾藻有机肥的无毒性。本研究中，马尾藻有机肥浸提液处理组比对照组和市售有机肥处理组种子萌发率较高，表明有机肥发酵过程确实将马尾藻中的营养成分转换为有利于植物吸收的物质。丙二醛是膜脂过氧化的产物之一，是细胞膜损伤的结果^[30]。植物在受到低温胁迫时导致产生大量活性氧，而体内的抗氧化酶起着清除活性氧的作用，可防止膜脂过氧化^[31-32]。本试验中，相比空白组和对照组，马尾藻有机肥处理组的丙二醛质量分数分别降低了23.41%和14.18%，表明马尾藻有机肥处理组防止了膜脂过氧化加剧，使冷害对辣椒幼苗的伤害减小。可溶性糖和脯氨酸是重要的渗透调节物质^[33-34]，可反映植物抗寒性的能力。出于自我保护反应，植物在冷害下会积累两种物质。与对照相比，本试验中马尾藻有机肥处理组的可溶性糖和脯氨酸质量分数分别提高了27.96%和15.49%；与市售有机肥相比，分别提高了21.94%和9.01%，表明马尾藻有机肥处理组辣椒体内大量积累渗透调节物质（可溶性糖、脯氨酸）来抵御低温伤害，而且马尾藻有机肥处理组的冷害指数明显降低。

4　结论

本研究得出马尾藻有机肥发酵最适条件为碳氮比25∶1、含水量50%、菌剂添加量2%，此条件下发酵制备的马尾藻有机肥符合有机肥国家标准NY/T 525-2021。与对照相比，经马尾藻有机肥浸提液处理的玉米种子发芽率提高了14.10%；施加马尾藻有机肥的辣椒幼苗冷害指数、丙二醛质量分数分别降低20.70%、23.41%，可溶性糖质量分数和脯氨酸质量分数分别提高27.96%、15.49%。表明上述工艺条件下发酵制备的马尾藻有机肥能够提高玉米种子的萌发率、激发辣椒苗抗寒性的防御活性，该发酵工艺具有一定参考性。