【研究意义】云南地处热带和亚热带地区，具有红米、紫米、软米等丰富的稻种资源^[1-3]，八宝米、墨江紫米、卧龙谷香软米、勐海香米、遮放贡米、元阳梯田红米被评为“云南六大名米”，涵盖了籼型软米、香米、紫米、红米等高原特色名米产品，这些品种由于米质好、饭香浓郁、冷后不回生、商品性好，深受消费者好评和企业青睐。近年来，“六大名米”的优质常规稻品种种植面积不断扩大，其中云恢290、滇屯502是云南省标志性的优质米品种，也是云南省卧龙谷香软米等“六大名米”企业开发高档米产品的支撑性品种，这些品种育成年代久远，已在生产上推广20余年，由于连年留种，品种混杂、种性退化已成为制约优质稻品种发展和优质米开发的瓶颈问题，加之优质米品牌价值提升，市面上出现了不少假冒产品。因此，对优质稻种进行提纯复壮保持种性，构建优质稻品种的标准样品数据库尤为重要。农户、稻米生产加工企业和农业管理部门通过查询此数据库，可以了解优质稻品种的详细信息，育种专家通过查询此数据库并深入分析，可以了解优质稻育种现状和趋势。

【前人研究进展】品种特征特性的描述主要用于判定品种的DUS(特异性、一致性和稳定性) 特性、品种质量判定参照、品种维权、市场监管等，是品种规范化管理的重要技术之一^[4]。近年来，通过DNA分子标记鉴定不同品种之间的基因型差异已广泛应用于不同领域^[5-6]，其中SSR标记因具有多态性高、重复性好、共显性遗传和易于检测等优点，可以准确、有效地鉴定品种真实性，从而被广泛地用于指纹图谱构建、制作分子身份证、种子纯度鉴定和种子真伪检测等方面^[7-8]。姚栋萍等^[8]以19对SSR引物构建了90份常用水稻品种的指纹图谱；陈越等^[9]利用SSR分子标记构建了中国南方地区100份水稻资源的SSR指纹图谱身份证并进行遗传分析；陆徐忠等^[10]、颜静宛等^[11]利用SSR标记分别构建了水稻杂交种或亲本材料的分子身份证。随着社会经济发展和生活水平的提高，人们对稻米食味品质的要求也越来越高，食味品质成为育种专家的重要育种目标，在水稻食味育种及生产过程中食味品质的鉴定变得极其重要，通过多年的发展，从传统感官评价法、理化性质评价法到近红外光谱分析法、食味计法多种检测技术的综合利用提高了食味鉴定的准确性^[12-14]。这些研究对水稻品种资源评价、利用和保护等起到了重要作用。

【本研究切入点】很多老品种及地方特色品种品质优良，但由于育成年代久远而没有纳入植物新品种保护的范围，为了进一步促进优质老品种的利用，保持其优异特性，防止混杂、退化、假冒，需要对这些品种进行标准样品数据的采集，为提纯复壮及真实性判定、打假提供标准。【拟解决的关键问题】本研究以云恢290、滇屯502的原种及生产用种为研究材料，采用品种农艺性状调查、SSR分子标记构建指纹图谱、稻米品质检测等技术探索构建优质稻标准样品数据库的方法及其应用。

1　材料与方法 1.1　试验材料

试验材料为云恢290、滇屯502原种和生产用种。生产用种用于提纯复壮，采用刘驰等^[15]方法，通过穗选、系圃繁殖“三年三圃”制进行提纯复壮。原种作为对照，与提纯后种子一起种植用于农艺性状比较及指纹图谱数据采集。

1.2　试验方法

2021—2022年分别于玉溪市云南省省农业科学院小街基地对云恢290、滇屯502原种和生产用种进行田间表型鉴定。试验设置2次重复，每小区种植200株，株距16 cm、行距20 cm，田间管理按照大田常规管理方法。性状调查方案严格按照GB/T 19557.7《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 水稻》 ^[16]执行。在苗期，分别取原种及生产用种的单株叶片，采用简易CTAB法从叶片中提取基因组DNA，经0.8% 琼脂糖电泳及分光光度计检测后，将浓度调至50 ng/μL备用。

1.3　优质稻标准样品数据采集

以水稻品种的DNA指纹信息、品种特征特性、图片，以及品种的基本商品信息, 作为构建优质稻标准样品数据库的基本内容。

1.3.1 品种指纹图谱构建方法　(1) SSR分子标记检测。参照NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定DNA指纹方法》 ^[17]推荐的第Ⅰ组引物序列，订购引物。利用12对分布在水稻12条染色体上的核心标记(表 1)采集原种及生产用种的指纹图谱，并进行一致性检测。

PCR反应体系为10 µL，包括2×mix混合液5 µL、5 µmol/L正向引物0.6 µL、5 µmol/L反向引物0.6 µL，样品DNA1 µL，超纯水2.8 µL。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物在毛细管荧光电泳系统AB 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems，USA) 上检测。用GeneMapper Ver.3.7(Applied Biosystems，USA)对原始数据进行统计和校正，读出每个位点每个样品的等位变异片段大小数据。

(2) 一致性检测。对试验材料随机抽取48个单株进行基因型一致性鉴定。一致性鉴定的扩增产物经8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(北京六一仪器厂DYCZ-30C型电泳仪及DYY-6C型电源)，银染检测。一致性分析参考王凤格等^[18]的方法，单个位点的一致性比率用r表示，r=1- 杂株数/总株数；每个品种所有位点的平均一致性比率用R表示，，r_i表示第i个位点的一致性比率。

1.3.2 品种特征特性描述　按照GB/T 19557.7《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 水稻》 ^[16]中的测试方法调查品种的特征特性，并给各性状状态赋值，得到各品种表型性状的原始数据矩阵。

1.3.3 品种图片描述　按照GB/T 19557.7《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 水稻》 ^[16]的要求，采集小区、植株、穗、籽粒照片，作为品种图片描述。

1.3.4 品种品质描述　依据NY/T 593—2021《食用稻品种品质》标准^[19]，对优质稻原种及生产用种进行糙米率、整精米率、垩白度、透明度等项目进行检测，判定优质稻原原种米质等级。

1.3.5 品种基本商品信息　包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、生产经营者名称、审定区域和审定的年份。

2　结果与分析 2.1　品种指纹图谱检测

利用12对分布在水稻12条染色体上的核心标记采集原种及生产用种的指纹图谱。云恢290和滇屯502原种及生产用种在12个位点上的条带均为纯合的单一主带，且带形无差异。图 1A、B是云恢290的原种及生产用种两个样本在RM71位点上的扩增条带，图 1C、D是滇屯502的原种及生产用种两个样本在RM71位点上的扩增产物条带，带形无差异，DNA扩增产物的相对数量即峰值差异不显著。结果表明云恢290和滇屯502的生产用种和原种检测到的扩增产物均无差异，可用于云恢290和滇屯502的指纹图谱描述。

云恢290的指纹图谱见图 2，滇屯502的指纹图谱见图 3，图中分别展示了12对引物扩增产物毛细管电泳图谱，图中所有的SSR位点只有1条主带，表明这两个品种纯合度较高，后续繁种不易产生分离，影响生产品质和产量。

读取优质稻品种12个SSR标记的指纹数据，按标记所在染色体由小到大排序，即按照引物RM583、RM71、RM85、RM471、RM274、RM190、RM336、RM72、RM219、RM311、RM209、RM19的顺序依次排列。由表 2可知，云恢290的扩增产物在毛细管荧光电泳系统检测得到的片段大小(bp)分别为191/191、151/151、83/83、107/107、162/162、108/108、125/125、162/162、214/214、181/181、152/152、244/244(水稻为二倍体, SSR扩增只有1条主带时，须重复记录1次)，云恢滇屯502的扩增产物在毛细管荧光电泳系统检测得到的片段大小(bp)分别为191/191、124/124、98/98、118/118、162/162、108/108、145/145、161/161、239/239、181/181、152/152、244/244。以按顺序排列的片段大小作为品种的分子指纹信息，形成指纹图谱库。

2.2　品种一致性分析

12个核心标记对原种及生产用种随机抽取48个单株进行基因型一致性鉴定。云恢290原种、生产用种12个标记的扩增产物大小一致，无异型株；滇屯502原种整齐一致、无异型株，生产用种有2个标记出现异带，由引物RM85的图谱(图 4)发现，有2个植株与其他植株带型不一致，因此判定为异型株，r值为95.8%，综合判断R值为99.65%。

2.3　品种特征特性及图片描述

按照GB/T 19557.7《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 水稻》 ^[16]中的测试方法调查59个水稻品种的39个必测性状，得到表型性状的原始数据矩阵。利用SPSS 26.0软件对原始数据矩阵进行标准化，将39个性状的向量矩阵用于性状间的主成分分析，求出各个主成分的特征值、方差贡献率和累计方差贡献率(表 3、表 4)，特征值表示主成分影响力度大小。由表 3主成分分析结果可知，前11个成分特征值分别为8.434、4.535、3.941、2.630、2.212、2.096、1.930、1.504、1.385、1.200、1.175，方差贡献率分别为21.62%、11.62%、10.10%、6.74%、5.67%、5.37%、4.94%、3.85%、3.55%、3.07%、3.01%，累计方差贡献率为79.59%，代表了水稻表型性状的大部分信息。第一主成分是最重要的主成分，其中倒二叶叶片、倒二叶叶耳花青甙显色、小穗外颖颖尖花青甙显色强度(初期)、小穗柱头颜色、茎秆节花青甙显色、小穗外颖颖尖花青甙显色强度(后期)的特征向量绝对值较大；第二主成分主要由谷粒长度、谷粒形状、糙米长度、糙米形状等性状决定；第三主成分主要由倒二叶叶片茸毛密度、茎秆长度、穗粒数等性状决定；第四主成分主要由谷粒外颖颜色、谷粒千粒重、糙米颜色决定；第五主成分主要由糙米宽度等性状决定；第六主成分主要由穗长度决定；第七主成分主要由茎秆: 基部茎节包露、剑叶姿态(后期)决定；第八主成分主要由剑叶叶片宽度决定；第九主成分主要由茎秆基部茎节包露决定；第十主成分主要由剑叶姿态(初期)决定；第十一主成分主要由穗结实率决定。

贡献率较大的形态学性状是造成品种之间表型差异的主要因素，而在GB/T 19557.7《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 水稻》 ^[16]中标注“*”的性状为(植物新品种保护联盟UPOV)用于统一描述所需要的重要性状，所有UPOV成员都应使用这些性状，包括：倒二叶叶耳花青苷显色、抽穗期、剑叶姿态(初期)、小穗外颖颖尖花青甙显色强度(初期)小穗柱头颜色、茎秆长度(不包括穗)、茎秆节花青甙显色、穗芒分布、小穗外颖茸毛密度、剑叶姿态(后期)、穗姿态、穗分枝姿态、穗长度、糙米长度、糙米形状、糙米颜色、糙米香味。

综合考虑主成分分析及带“*”的性状两个因素，选择倒二叶叶片花青甙显色等18个性状对优质稻品种进行品种特征特性描述，用于构建优质稻品种表型数据库(表 5)。

按照余汉勇等^[20]的方法，采集优质稻滇屯502、云恢290主要形态特征照片，包括植株、花序、穗、籽粒，如图 5所示。

2.4　品种品质描述

依据NY/T 593—2021《食用稻品种品质》标准，对优质稻原种及生产用种的糙米率、整精米率、垩白度、透明度等项目进行检测，判定优质稻品种米质等级，构建优质稻品种米质数据库(表 6)。

2.5　品种基本商品信息

收集整理优质稻的基本商品信息，包括品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、生产经营者名称、审定区域和审定年份(表 7)。

2.6　优质稻标准样品数据的应用

SSR指纹图谱数据库的建立可以从基因水平上有效解决早期育成品种及地方稻品种应用过程中同种异名或同名异种等品种混乱现象，有利于水稻种质资源的鉴定、保护及育种研究，提高我国稻种资源的利用效率。

一个优良水稻品种经多年种植出现混杂、退化，主要原因是收获、脱粒、浸种、催芽、播种、插秧、运输、保管、晒种等生产过程中造成的机械混杂，以及常规稻本身存在的天然异交(2%~4%)或由环境引起的自然突变，主要表现为生长不整齐、容易倒伏、穗变小、抗病力减弱、易落粒、成熟度不一致、米质变差、出米率减少等，总的趋势是产量降低，品质变劣，稻米的香味基因丧失。这些变化势必影响稻种生产的产量和质量，同时易发生用种纠纷。本研究中，采用12对SSR引物对原种及生产用种进行一致性分析，发现生产用种一致性明显低于原种，可快速区分异型株。因此，对稻种进行提纯复壮、保持种性尤为重要，SSR分子标记分析品种一致性方法可应用于提纯复壮，加速提纯复壮进程。

品种特征特性、图像描述、品质描述及商品信息可以直接明了地展示品种特征特性，便于农户、稻米生产加工企业和农业管理部门了解和获得优质稻品种，也是市场部门对稻米品质监管的有利工具。

3　讨论

云南省内多样化的地理、生态环境等因素以及在水稻种植过程中由于人工选择等原因，形成了大量具有地方特色的农家品种，同时也育成了大量优质稻品种，积累了丰富的遗传变异，为水稻产业发展提供了珍贵的种质资源。我国从1999年加入UPOV组织，开启了对水稻品种的保护，对于一些育成时间久的品种、地方品种等优质稻种资源须加强系统的描述及保护。本研究以SSR标记构建优质稻品种的分子指纹图谱，采集品种特征特性及图片，对稻米品质进行检测，再加上优质稻品种的基本商品信息构成了优质稻标准样品数据库基础数据。优质稻标准样品数据库的建立可以从基因水平上、品种特征特性及外观对该品种进行系统的描述。

水稻种质资源是水稻育种的重要物质基础，水稻优良品种选育的关键在于其丰富的遗传多样性，世界上主要水稻种植国家与相关科研机构都十分重视水稻种质资源的收集保护与研究利用。我国由于早期缺乏对水稻资源完善有效的鉴定方法，致使出现水稻同种异名和同名异种等混乱现象，给水稻资源利用造成了极大的阻碍。近年来，以SSR分子标记技术构建水稻指纹图谱数据库用于品种真实性鉴定的报道越来越多。此外，也有基于互联网构建的数据库，如胡忠孝等^[21]构建了基于Web的中国超级稻品种数据库。在这些数据库中，有的仅由DNA指纹数据构成，有的仅有品种的特征特性描述，都不能全面直观描述品种。本研究致力于收集品种的各方面基础数据，从基因水平上、品种特征特性、外观及商品信息上展示品种，为育种专家、农业管理部门和农户提供一个查询优质稻品种的平台。

SSR指纹图谱分子身份证是一种随着DNA分子标记技术的发展而建立起来的对作物资源鉴定方法，具有高度的特异性和环境稳定性，每个水稻资源的指纹图谱代码都具有专属性和唯一性^[9]。本研究采用SSR标记构建优质稻的指纹图谱，为节省成本及提高效率，采用了NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程SSR分子标记法》推荐的第Ⅰ组12对核心引物进行指纹图谱的构建，随着品种数量的增加，若该套引物无法对之进行区分，可增加其他引物用于指纹图谱构建。

本研究仅对数据库的基础数据采集方法及应用前景进行分析，对数据库的应用，如何实现其他研究人员、企业、农户在线查询访问等问题仍需进一步研究，完善数据库架构，使之能真正服务于社会。

4　结论

本研究以云南优质稻品种云恢290及滇屯502为例，探讨了构建优质稻品种标准样品数据库的必要性及数据采集方法。数据库包括了分子指纹图谱、品种特征特性、图片、品质特征及基本商品信息等5大部分，分别采用DUS测试技术采集品种18个农艺性状数据和4张植株部位图片，用12个SSR分子标记构建指纹图谱，用稻米品质检测技术描述品种品质性状。数据库的建立可以从基因水平上、品种特征特性及外观对品种进行系统描述，为优质稻品种的真实性鉴定及提纯复壮提供技术支撑。