2023, Vol. 50文章信息
引用本文 |
基金项目
- 国家重点研发计划（2022YFD1801000）；“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目（2022SDZG02）；广东省基础与应用基础研究基金（2022A1515110737）；云南省廖明专家工作站项目（202105AF150077）
作者简介
- 曾庆航（1996—）男，在读硕士生，研究方向为H9N2亚型禽流感防控，E-mail：zengqinghangyy@163.com.
通讯作者
- 廖明（1968—），男，博士，教授，研究方向为禽流感等家禽重大疾病防控，E-mail：mliao@scau.edu.cn.
文章历史
- 收稿日期：2023-03-03
2. 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室，广东 广州 510640
2. Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province/Key Laboratory for Prevention and Control of Avian Influenza and Other Major Poultry Diseases, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510640, China
【研究意义】H9N2亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）是目前家禽养殖中最常见的病毒之一，极易发生基因突变和基因重组，导致免疫逃逸而造成免疫失败。该病毒感染性强，传播速度快，易感染雏鸡和青年鸡群，主要侵害机体上呼吸道，可引起机体的免疫抑制，引发混合感染或继发感染，导致鸡群生长缓慢、蛋品质和产蛋量下降。由于其致病性低，导致H9N2亚型AIV在许多国家未被良好监测和有效控制，现已在全球家禽中流行；其流行广泛，危害持久，难以清除，给养禽业构成严重威胁并造成了巨大经济损失。因此，研究H9N2亚型AIV的遗传进化和生物学特征，为我国H9N2亚型AIV防控提供参考数据具有重要意义。【前人研究进展】 H9N2亚型AIV最早于1966年在美国威斯康星州北部的火鸡上发现，我国则于1992年在广东省的鸡群中首次发现该病毒，随后该病毒在我国多地出现并蔓延，经历了BJ94-like→F98-like→Y280-like的演化，当前国内流行毒株均属于h9.4.2.5分支（Y280-like）[1-3]。自1999年首次发现人感染H9N2亚型AIV以来，截至2022年3月30日全球共发现110例，我国发生97例（占比88.18%），主要集中在我国南方，而广东省报道最多[4-7]。据多项研究报道，H9N2已取代H5N6和H7N9成为在禽类中流行的优势亚型，且其作为病毒基因库为H3N8、H5N1、H5N6、H7N9、H10N8等亚型AIV提供内部基因进行基因重组，被认为可能引起下一次流感大流行[8-15]。【本研究切入点】AIV属于正黏病毒科甲型流感病毒属，基因组由8个长度在890~2 341个核苷酸的单链负义RNA片段组成，可编码病毒的17种结构蛋白，其中以HA和NA变异最大，是AIV最主要的保护性抗原，因此HA和NA基因常作为基因变异依据用于AIV遗传进化和生物学特征分析[16]。【拟解决的关键问题】本研究通过对2022年广东地区3株H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行遗传进化和生物学特征分析，为我国H9N2亚型AIV的进化分析和防控提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 供试毒株 H9N2亚型AIV毒株A/Chicken/Guangdong/JY01/2022、A/Chicken/Guangdong/FS03/2022、A/Chicken/Guangdong/KP03/2022（表 1），由广东省农业科学院动物卫生研究所分离鉴定和纯化保存。
1.1.2 引物 设计合成AIV-12bp随机引物、HA和NA基因PCR通用引物（表 2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.1.3 主要试剂 病毒DNA/RNA提取试剂盒（磁珠法）购自西安天隆科技有限公司，2×Taq Master Mix和DL2000 DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，PrimeScriptTM RT Master Mix、pMD19-T载体和DH5α感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒提取纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 HA和NA基因扩增、克隆及测序 对病毒液进行总RNA提取，根据PrimeScriptTM RT Master Mix说明书，使用AIV-12bp随机引物进行反转录获得cDNA；使用HA和NA基因通用引物进行PCR扩增，将目的基因纯化回收，与pMD19-T载体连接并转入DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序。
1.2.2 HA和NA基因遗传进化及氨基酸关键位点分析 采用SeqMan、Editseq、PhyloSuite软件对核苷酸序列进行拼接，并进行氨基酸关键位点比对分析；运用Megalign软件对核苷酸序列进行同源性分析；利用MEGA11软件采用ML法绘制HA、NA基因遗传进化树；使用NetNGlyc 1.0 Server软件对氨基酸序列N-糖基化位点进行分析。
2 结果与分析 2.1 HA和NA基因PCR扩增和测序结果3株H9N2亚型AIV的HA和NA基因PCR扩增产物分别在1 683 bp和1 401 bp的位置（图 1）。测序结果与预期大小一致，3株病毒的HA基因完整开放阅读框（ORF）各含有1 683个核苷酸，NA基因完整ORF各含有1 401个核苷酸（图 2）。
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| M：DL2000 Marker；P：阳性对照；N：阴性对照；J、K、F：PCR产物 M: DL-2 000 Marker; N: Negative control; P: Positive control; J, K, F: PCR product 图 1 HA（A）、NA（B）基因的PCR产物 Fig. 1 PCR products of HA(A) and NA(B) genes |
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| 图 2 3株H9N2亚型AIV的HA、NA基因ORF测序结果 Fig. 2 ORF sequencing results of HA and NA genes of three H9N2 AIV strains |
2.2 HA和NA基因系统发育树分析结果
基因系统发育树分析结果显示，HA基因属于当前国内流行的h9.4.2.5分支，与经典株A/Chicken/Guangxi/55/200的遗传距离较远，已进化成新的亚群，命名为h9.4.2.5c分支（图 3A）；NA基因仍属于1分支，与早期流行的经典株A/Duck/Hong Kong/Y280/97遗传距离较远，在近几年形成了一个相对稳定的新的亚分支，命名为1.2分支（图 3B）。
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| 图 3 3株H9N2亚型AIV的HA（A）、NA（B）基因系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of HA(A) and NA(B) genes of three H9N2 AIV strains |
2.3 HA和NA基因核苷酸序列同源性分析结果
核苷酸序列比对分析结果（表 3）显示，3株H9N2亚型AIV之间HA基因核苷酸序列同源性为97.6%~98.3%，与h9.4.2.5分支经典代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005的同源性最高，介于91.3%~91.7%之间；与h9.4.2.4分支经典代表株A/Duck/Hong Kong/Y280/97的同源性最低，介于81.6%~81.9%之间。3株H9N2亚型AIV之间NA基因核苷酸序列同源性为97.2%~98%，与h9.4.2.3分支疫苗株A/Chicken/Guangdong/SS/94的同源性最高，介于89.4%~89.8%之间；与h9.4.2.5经典分支代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005同源性最低，介于86.0%~86.8%之间。
2.4 HA氨基酸序列关键位点分析结果
3株H9N2亚型AIV的HA基因序列完整的ORF均由1 683个核苷酸组成，编码560个氨基酸；HA裂解位点均为PSRSSR ↓ GLF，符合低致病性特征；受体结合位点均发生了I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M突变；潜在糖基化位点均只有7个，218位由NRT突变为NRI，变成非糖基化位点，313位由NCP突变为NCS，新增糖基化位点（表 4）。
2.5 NA氨基酸序列关键位点分析结果
3株H9N2亚型AIV的NA基因序列完整的ORF均由1 401个核苷酸组成，共编码466个氨基酸；与参考株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Duck/Hong Kong/Y280/97相比，在茎部均缺失187~195位9个核苷酸（ACAGAGATA），导致NA蛋白缺失63~65位3个氨基酸（TEI），这与A/Duck/Hong Kong/Y280/97株为代表的国内流行毒株一致。1.2分支NA蛋白的红细胞结合位点（Hemadsorbing site，HB）366~373位产生K/E/S368N、D369N突变；与NA蛋白活性、抗流感药物奥司他韦和扎那米韦耐药性相关的E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371位点均未发生突变（表 5）。
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3 讨论
禽流感病毒属于RNA病毒，在免疫压力和外界因素影响下易发生基因突变和基因重组，进化出新的基因型。我国自1992年首次报道H9N2亚型AIV已有30年的流行历史，期间经历了BJ94-like→F98-like→Y280-like的演化，1997年报道A/Duck/Hong Kong/Y280/97毒株后，以Y280-like为代表的毒株成为我国流行的优势毒株，均属于h9.4.2.5分支[17-18]。我国于1998年开始在鸡群中使用灭活疫苗来控制该病毒引起的疾病，在家禽疫苗接种计划后，H9N2亚型AIV的演变速度加快[19-21]。AIV NA基因的0分支以A/Chicken/Hong Kong/G9/97株为代表，主要在1997—2011年流行；1分支则在1994—2006年流行，以A/Chicken/Beijing/1/94和A/Duck/Hong Kong/Y280/97株为代表；2007—2013年开始演变出稳定的1.1和1.2亚分支并流行至今[22]。本研究3株H9N2亚型AIV的基因遗传进化分析结果显示，HA、NA基因与早期的经典株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangxi/55/2005和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Chicken/Guangdong/SS/94等的遗传距离较远，核苷酸同源性分别仅为81.6%~91.7%和88.2%~91.2%，已经进化成新的亚群[6-9]。因此，持续跟踪、系统分析，及时掌握流行变异情况，对H9N2亚型AIV的防控具有重要意义。
流感病毒侵染细胞的先决条件是HA裂解为HA1和HA2，HA2暴露出疏水端，HA蛋白发生融膜[23]。LPAIV HA裂解位点一般为R-S-S-R结构，只含1个或2个连续碱性氨基酸，只有精氨酸特异蛋白酶能识别并裂解这种结构，因此一般只引起局部感染。本研究3株H9N2亚型AIV HA蛋白酶解位点序列为PSRSSR ↓ GLF，符合低致病性特征。与A/Chicken/Guangxi/55/2005经典株等相比，3个分离株HA蛋白裂解位点的第334位均由A变为S，而研究表明该突变会增强病毒对家禽的致病性[24]。
流感病毒的适应性突变主要发生于病毒表面膜蛋白，包括HA蛋白受体位点的改变、糖基化修饰位点的分布和NA蛋白茎部的缺失[25]。有研究报道，HA蛋白受体结合位点155、183、190、212、226、227位与人源唾液酸受体结合的亲和力有关，I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M突变会增强与人源唾液酸受体结合的亲和力，其中190V具有高度亲和力，其次是190T[26-28]。本研究中，3个分离株HA蛋白受体结合位点分析显示，均发生I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M突变，提示表现出人源唾液酸受体结合特性。另有研究表明，HA蛋白218N突变为非糖基化位点，同时313N新增为糖基化位点，会增强病毒与受体的结合能力，阻止同源抗血清对病毒的中和作用，以及增强病毒对细胞的感染能力和在细胞中的复制能力[29-30]。本研究3个分离株HA蛋白糖基化位点分析显示，218由NRT突变为NRI成为非糖基化位点，同时313位由NCP突变为NCS，新增为糖基化位点，与前期研究相符，提示该突变同时提高了该3株病毒的致病性及改变了其抗原性。
NA蛋白头部有酶活性中心和抗原位点，茎部与蛋白锚定有关[23]，茎部缺失是流感病毒毒力增强的标志[31]。本研究3株H9N2亚型AIV的NA基因序列分析显示，与参考株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Duck/Hong Kong/Y280/97相比，分离株的茎部均缺失187~195位9个核苷酸（ACAGAGATA），导致NA蛋白缺失63~65位3个氨基酸（TEI），这与A/Duck/Hong Kong/Y280/97株为代表的国内流行毒株一致。茎部缺失使病毒更易脱离细胞，增强毒力、扩大宿主范围[32]。流感病毒NA蛋白上E119A/D/G/V、D151E、R152K、R224K、E276D、R292K、R371K位点突变会改变蛋白活性和增强对抗流感病毒药物奥司他韦、扎那米韦的耐药性[33-34]。本研究3株H9N2亚型AIV的以上位点均未发生此突变。研究报道，NA蛋白的红细胞结合位点366~373、399~404和431~433分别形成3个环状结构，唾液酸和氨基酸直接结合在环状结构中[35]。本研究观察到HB结合位点产生K/E/S368N、D369N的变化，该突变是否会影响唾液酸和氨基酸结合有待进一步探究。
4 结论2022年从广东部分地区分离的3株H9N2亚型AIV的HA和NA基因分别属于h9.4.2.5c和1.2分支，与以A/Chicken/Beijing/1/94为代表的经典株和A/Chicken/Guangdong/SS/94等疫苗株的遗传距离较远，核苷酸序列同源性分别仅为81.6%~91.7%和88.2%~91.2%，已经进化成新的亚群；HA氨基酸序列均发生I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M突变，218N去糖基化的同时313N糖基化，以及NA氨基酸序列63~65位（TEI）缺失，表明目前广东地区流行的H9N2亚型AIV可能增强了对哺乳动物的适应性，且其抗原性发生改变；同时，NA氨基酸序列E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371均未发生突变，表明其尚未获得对奥司他韦和扎那米韦等抗流感病毒药物的耐药性。本研究结果表明3株H9N2亚型AIV的HA和NA部分关键氨基酸序列已发生不同程度变异，建议持续对H9N2亚型AIV的流行情况进行监测。本研究结果明确了广东省H9N2亚型AIV的感染现状及流行毒株的分子流行病学特点、遗传演化情况，可为广东地区今后更有效地预防控制H9N2亚型AIV感染及疫苗选择提供参考。
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(责任编辑 崔建勋)