【研究意义】禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAdV）属于腺病毒科（Adenoviridae）禽腺病毒属（Aviadenovirus），是一种无囊膜的双股DNA病毒。禽腺病毒属Ⅰ群可根据病毒结构特征分为5个种（以A~E表示），根据血清交叉中和反应可分为12种血清型（FAdV1~7、8a、8b、9~11）^[1]。禽腺病毒Ⅰ群所有血清型均可引发包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）^[2]，其中FAdV-4被认为是引发心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）的特定病原，发病禽可见明显的心包积液和肝炎、肾炎，致死率高，其流行给我国养禽业造成巨大损失^[3]。目前接种疫苗仍是FAdV防控的有效手段^[4]，但禽腺病毒Ⅰ群血清型较多，且不同血清型之间没有或只有微弱的的交叉保护力^[5]。FAdV-4能够中和FAdV-11，但不能中和FAdV-8a和FAdV-8b，FAdV-8a和FAdV-8b不能交叉中和，FAdV-8b和FAdV-11能够相互中和^[6]。研究FAdV不同血清型的致病性可以进一步认识禽腺病毒的危害，为科学有效防控奠定基础。

【前人研究进展】2007—2018年调查表明，我国占据主导地位的禽腺病毒流行型为FAdV-4，其次为FAdV-8a、-8b、-11。近年来，同属于FAdV-D的FAdV-2、-8a、-8b、-11在我国南方省份被分离发现的占比不断上升^[7-8]，其中FAdV-2的分离率逐年上升。FAdV-2已在中国、加拿大^[9]、日本^[10]和波兰^[11]等许多国家检出，主要感染3~5周龄肉鸡，导致严重的IBH，平均死亡率为5%~10%^[12]。目前，有关FAdV-2的致病性尚不清楚，发病禽的病理变化等仍不明确。

【本研究切入点】通过对养殖场鸡群健康状况调查发现，免疫过鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒病（Ⅰ群FAdV-4）三联灭活疫苗的鸡群出现死亡，剖检可见典型的HHS症状。该情况说明除FAdV-4外可能还存在同样能引发HHS的病毒，因此对该病死鸡的组织样品进行病毒分离鉴定，明确疑似腺病毒的血清型，并通过动物回归试验建立发病模型。

【拟解决的关键问题】FAdV-4被认为是导致HHS症状的主要病原，其发病模型稳定。为建立稳定的FAdV-2发病模型，本研究从HHS发病鸡组织样品中分离出KM株，对其基因序列进行分析，通过比较不同攻毒途径和不同攻毒剂量的致病性差异，筛选出建立发病模型的最佳攻毒途径和攻毒剂量，并对发病评价指标进行验证，为FAdV-2的免疫原性评价和疫苗效果评价提供参考。

1　材料与方法 1.1　试验材料

1.1.1 样品来源　云南昆明某养殖场鸡群出现不明原因死亡，剖检可见肝炎、肾炎和心包积水等HHS样临床症状。该养殖场鸡群已经免疫过两次鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒病（Ⅰ群FAdV-4）三联灭活疫苗。为了明确导致此次疾病的病原，采集病死鸡的肝脏、脾脏和肾脏样本，冷藏保存，送至实验室检查。

1.1.2 试验动物　6周龄SPF鸡70只，购自北京梅里亚维通公司，于动物隔离器中饲养。

1.1.3 试剂和引物　DMEM-F12培养基、胎牛血清、胰酶购自赛默飞世尔科技有限公司；鸡肝癌细胞（LMH细胞）购自广州市华南农大生物药品有限公司；DL2000 Marker、2×Taq Master Mix、磷酸缓冲溶液（PBS）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA提取试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

参照文献[13]设计FAdV鉴定通用引物（上游引物5' CAARTTCAGRCAGACGGT 3'，下游引物5' TAGTGATGMCGSGACATCAT 3'，目的片段大小为897 bp）；将GenBank登记的GX01株作为参考序列，分别设计FAdV-2 Fiber序列扩增引物（上游引物5' ATGGCAAAATCGACTCCTTTC 3'，下游引物5' TTAGGGTTGTGTTAATTTATT 3'，目的片段大小约为1 700 bp）和FAdV-2 Hexon序列扩增引物（上游引物5' CGTCGCATGTGTTATTGACC 3'，下游引物5' GTCCCAGCCATTATAAGCAG 3'，目的片段大小约为3 000 bp）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2　病毒分离鉴定

1.2.1 病原鉴定　将病死鸡组织样本置于研钵，研磨匀浆加PBS后放入5 mL EP管中，反复冻融3次，5 000 r/min离心5 min，按照Takara DNA提取试剂盒说明书的操作步骤抽提上清液DNA作为模板，用FAdV通用引物进行鉴定。PCR体系为：2×Taq Master Mix 5 μL、FAdV上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH₂O 2 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析，出现预期条带则视为样本禽腺病毒阳性。

1.2.2 病毒分离　取LMH细胞生长至密度达90%~95% 的T25细胞瓶，弃去瓶中培养基后加入无菌PBS，平铺润洗后弃去洗液，重复2次。加入经孔径0.22 μm滤膜过滤后的1.2.1阳性样本液200 μL和DMEM-F12培养基300 μL，晃动平铺后置于37 ℃、5%CO₂培养箱中孵育2 h，弃接毒液后加入5 mL含5% FBS的DMEM-F12培养基，放于细胞培养箱中培养72 h，每天观察，培养结束时反复冻融后收获。按照上述接毒方法盲传3代。

1.2.3 病毒鉴定　取盲传3代后的培养液，用DNA提取试剂盒抽提病毒DNA，作为PCR特异性扩增的模板。PCR体系和反应程序按照1.2.1操作。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析，出现预期条带则送测序，并对序列进行比对。

1.3　分离株KM的Fiber和Hexon序列分析

以1.2.3制备的病毒DNA作为模板，分别用Fiber、Hexon引物进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq Master Mix 25 μL、上下游扩增引物各2 μL、模板DNA 2 μL、ddH₂O 19 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min 20 s，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析，出现预期条带则送测序。

在GenBank中下载14株禽腺病毒参考株（表 1）的全基因组序列，利用MegAlign软件的Clustal W方法将本研究的分离株KM与参考株进行核苷酸序列比对和相似性分析，采用MEGA7.0软件构建核苷酸系统发育树（算法NJ邻接法，Bootstrap值设为500）。应用生物软件DNAStar中的Editseq推导分离株的主要结构基因Hexon和Fiber的氨基酸序列，并与GX01株相应蛋白的氨基酸序列进行比对分析。

1.4　KM株扩增及TCID₅₀测定

将KM株F₂代病毒液接种于T75细胞瓶中孵育2 h，弃去接种液并用PBS润洗2次，37 ℃下观察，出现80% 以上病变则将细胞瓶置于-80 ℃下繁毒冻融3次使病毒充分释放，分装，-80 ℃保存待测TCID₅₀。将LMH细胞铺于96孔板中，待其生长至密度达85%~95% 时进行试验。用DMEM-F12培养液将病毒液进行10倍稀释，使病毒液浓度为原液的10^-10~10^-1，分别取100 μL接种于96孔细胞板中，每个稀释度8个重复，第11列为空白对照，第12列为阳性对照。置于37 ℃温箱中孵育2 h后弃去病毒液，加入含1% FBS的DMEM-F12细胞维持液。将细胞板放入37 ℃培养箱中，观察7 d，记录病变孔数，按照ReedMuench法计算病毒TCID₅₀。

1.5　KM株发病模型建立

1.5.1 KM株纯净性检测　分别用试剂盒抽提两代感染毒KM株病毒液中的DNA，并用常见的禽病病毒特异性检测引物进行PCR特异性扩增检测，供检测的病毒包括鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、减蛋综合征病毒（EDSV）、禽支原体（MS/MG）、马立克病病毒（MDV）、新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、禽传染性脑炎病毒（AEV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、鸡传染性病病毒（CAV）、鸡白血病（ALV）、传染性支气管炎（IBV）。PCR体系为：2×Taq 5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、ddH₂O 1 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃ 5 min，PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.5.2 不同攻毒途径的KM株致病性分析　以F₃代病毒作为感染毒，将30只6周龄SPF鸡随机分成3组（a、b、对照），每组10只。对a、b组SPF鸡分别经静脉注射和肌肉注射两种方式注射10^7.2TCID₅₀的病毒液，空白对照组中5只经静脉注射1 mL DMEM-F12（CK1），另外5只经肌肉注射1 mL DMEM-F12培养基（CK2）。攻毒后3组SPF鸡分别在隔离器中饲养，每天观察并记录鸡群状态。攻毒1、3、5、7 d后用棉签采集泄殖腔拭子，-80 ℃保存；攻毒7 d后处死全部鸡，剖检观察脏器病变情况，并采集心、肝、脾、肾组织样品，-80 ℃保存。

1.5.3 不同攻毒剂量的KM株致病性分析　以F3代作为感染毒，将40只6周龄SPF鸡随机分成4组（A、B、C、对照），每组10只。对A、B、C组SPF鸡分别静脉注射10^8.0TCID₅₀、10^7.0TCID₅₀和10^6.0TCID₅₀病毒液，空白对照组（CK）静脉注射1 mL培养基。攻毒后4组SPF鸡分别于隔离器中饲养，每天观察并记录鸡群状态。攻毒1、3、5、7 d后用棉签采集泄殖腔拭子保存于添加PBS的EP管中，-80 ℃保存；攻毒7 d后处死全部鸡，剖检观察脏器病变情况，采集心、肝、脾、肾组织样品，-80 ℃保存。

1.5.4 组织样品核酸检测　将心、肝、脾、肾组织样品置于室温下融化、研磨制成匀浆，置于5 mL EP管中，加入3 mL灭菌PBS，反复倒置混合均匀，放入-80 ℃冰箱中反复冻融3次，5 000 r/min离心5 min，取上清液，用试剂盒抽提上清液中的核酸，PCR体系和反应程序同1.2.1，PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5.5 泄殖腔拭子核酸检测　将泄殖腔拭子于室温中融化，用试剂盒抽提核酸，PCR体系和反应程序同1.2.1，将PCR产物置于1% 琼脂糖凝胶中电泳分析。

2　结果与分析 2.1　病毒鉴定结果

本研究分离的病毒盲传3代后，LMH细胞出现CPE，表现为变圆、脱落（图 1），抽提核酸后经PCR鉴定（图 2）为禽腺病毒。经测序并比对序列，所分离的病毒Hexon基因核苷酸序列与GX01株相似度达99.64%，鉴定为禽腺病毒Ⅰ群D种中的禽腺病毒血清2型（FAdV-2），将该毒株命名为KM株。

2.2　KM株Fiber基因和Hexon基因的进化分析

采用MEGA 7.0软件的Clustal W方法将KM株与5个群共14株FAdV毒株的Fiber基因和Hexon基因核苷酸序列进行分析。根据Fiber遗传进化树（图 3A）来看，KM株与国内分离的FAdV-2血清型GX01株距离最近，同属于禽腺病毒Ⅰ群D种，与其他的A、B、C、E群距离较远；根据Hexon遗传进化树（图 3B）来看，KM株与GX01株距离也最近，同属于禽腺病毒Ⅰ群D种。

采用MegAlign对15株FAdV的Fiber和Hexon基因序列进行核苷酸同源性分析，结果显示，KM株Fiber基因核苷酸序列与GX01、380、685、A-A2、HBQ12、SR48、SR49病毒核苷酸序列同源性为71.8%~98.9%，其中与GX01株同源性为98.9%，该8株病毒同属于禽腺病毒Ⅰ群D种（图 4）；KM株Hexon基因核苷酸序列与GX01、380、685、A-2A病毒核苷酸序列同源性为79.9%~99.6%，与380、SR49、HBQ12病毒核苷酸序列同源性为39.0%~39.1%，其中KM与GX01、685、SR48病毒核苷酸序列同源性为97.8%~99.6%（图 5）。

利用DNAStar中的Editseq软件将分离株KM的主要结构基因Hexon和Fiber翻译为氨基酸序列，采用MegAlign对15株FAdV的Fiber氨基酸序列和Hexon氨基酸序列分别进行同源性分析。结果显示，KM株Fiber氨基酸序列与GX01、685、380、HBQ12的同源性为94.8%~98.9%，其中与GX01株的同源性最高、为98.9%（图 6）；KM株Hexon氨基酸序列也与GX01株同源性最高、为98.8%，与685、SR48同源性为33.1% 和47.9%，表明KM株与国外分离的毒株同源性较低（图 7）。

2.3　KM株的TCID₅₀效价

分别记录病毒液不同稀释度（10^-10~10^-1）出现CPE的孔数，计算每个稀释度出现CPE的占比，按照Reed-Muench计算可得，KM株F₃代滴度为1×10^7.2TCID₅₀/0.1 mL。

2.4　KM株纯净性检测

经PCR特异性扩增后，凝胶电泳结果显示KM株未检测到外源病毒可疑条带，可见KM株F₃代无ILTV、EDSV、MS/MG、MDV、NDV、IBDV、AEV、ARV、CAV、ALV、IBV病毒污染。

2.5　不同攻毒途径的KM株致病性

a组SPF鸡通过静脉注射10^7.2TCID₅₀ KM株，感染后2 d出现排黄绿色稀粪、站立困难、食欲下降等临床症状；攻毒3 d后死亡1只，5 d后死亡1只，死亡率为20%；7 d后处死并剖检每只鸡，可见心包积液、肝脏肿大带出血点、肾肿大等病理变化。b组SPF鸡通过肌肉注射10^7.2TCID₅₀ KM株，感染后3 d出现少许黄绿色稀粪，无食欲下降、趴卧不起等临床症状，无死亡；攻毒7 d后处死剖检无发现肝炎、肾炎等症状。对照CK1、CK2的鸡精神状态良好，食欲正常，7 d后处死剖检无发现肝炎、肾炎等症状。

2.6　不同攻毒剂量的KM株致病性

KM株经静脉注射剂量为10^6.0TCID₅₀（C组）时，鸡群未出现精神沉郁、排黄绿色稀粪等临床症状，剖检无发现心包积液、肝炎症状。静脉攻毒剂量为10^7.0TCID₅₀（B组）时，在7 d内5只SPF鸡出现精神沉郁、趴卧不起、羽毛凌乱、食欲下降等发病症状，但未出现鸡只死亡的情况（表 3），但剖检可见3只出现明显肝炎、肾炎症状。静脉攻毒剂量达10^8.0TCID₅₀（A组）时，10只SPF鸡发病，出现黄绿色稀粪、精神不振、食欲下降等临床症状，且在攻毒3 d内死亡2只，攻毒后7 d内死亡5只，死亡率为50%（表 3）；剖检可见明显的心包积液、肝炎、肾炎症状，肌胃、腺胃无变化（图 8）；攻毒死亡的鸡组织病理切片（图 9）显示，心脏组织间隙增宽、心肌纤维增粗、间质性水肿，肝脏炎性细胞和嗜碱性包涵体浸润，肾脏炎性细胞浸润，间质充血；对照组鸡的心脏、肝脏和肾脏组织病理切片显示正常（表 3）。为保证KM株感染模型中同时存在发病和死亡的情况，选择静脉注射感染途径为宜，感染剂量为10^8.0TCID₅₀。

2.7　脏器组织核酸检测

采集KM株静脉注射10^8.0TCID₅₀死亡的5只鸡和攻毒7 d后统一处死的5只鸡的肝脏、肾脏样本，提取核酸并利用FAdV-2特异性引物进行PCR扩增，均检出大小符合预期的条带，约897 bp（图 10），确认为KM株感染。

2.8　泄殖腔拭子核酸检测

A、B、C试验组攻毒前泄殖腔拭子核酸检测均无目标条带检出，静脉注射KM株，攻毒后1 d的检测结果显示均有目标条带，攻毒后3~7 d各组全部鸡均检出目标条带（表 4）。

3　讨论

我国是畜禽养殖大国，规模化畜禽养殖业为社会带来巨大经济效益^[14]。2015年发现禽心包积液-肝炎综合征^[15]，2016年各地均有病例报告。随着对该病的认识逐渐深入，以及各种疫苗、防控手段应用，2019—2020年该病呈下降趋势^[16]。3~5周龄的种鸡和蛋鸡是心包积液-肝炎综合征最为易感的鸡群，致死率为30%~90%^[17]。FAdV-4被认为是引发心包积液-肝炎综合征的特定病原^[18]。本研究结果显示，高剂量（10^8.0TCID₅₀）的FAdV-2经静脉感染也可引发心包积液-肝炎综合征典型症状进而导致动物死亡，说明FAdV-2对禽类养殖存在较大威胁，研发针对FAdV-2的疫苗仍然是防控的第一选择。

Xie等^[19]对FAdV-2的致病性进行研究，经肌肉注射感染3日龄和10日龄SPF鸡后，试验鸡虽无死亡，但出现明显的体重下降。目前未有报道进行过静脉注射感染大日龄SPF鸡的致病性研究，无法明确在静脉感染途径下大日龄SPF鸡感染FAdV-2的临床症状。为验证不同攻毒途径下FAdV-2的致病性差异，本试验分别通过静脉注射和肌肉注射10^7.2TCID₅₀的病毒液，发现经静脉注射10^7.2TCID₅₀剂量，6周龄SPF鸡出现死亡，剖检可见心包积液和肝炎，死亡率为20%，对未死亡鸡剖检可见明显病理变化。

实验动物、剂量选择、发病症状通常是建立发病模型最为关键的参数。本研究在进行不同攻毒剂量致病性试验设计时分别选择10^8.0TCID₅₀、10^7.0TCID₅₀、10^6.0TCID₅₀ 3个攻毒剂量，感染途径为静脉注射，结果表明，静脉攻毒剂量达到10^7.0TCID₅₀时，6周龄SPF鸡出现黄绿色稀粪，无死亡，泄殖腔拭子攻毒后1 d全部阳性；攻毒剂量达到10^8.0TCID₅₀时，试验鸡死亡率达50%，剖检可见明显病理变化，泄殖腔拭子攻毒后1 d全部阳性。

本研究结合不同攻毒途径和不同攻毒剂量致病性分析结果，建立了FAdV-2 KM株感染6周龄SPF鸡的发病模型：攻毒途径为静脉注射，剂量为10^8.0TCID₅₀，试验鸡可见黄绿色稀粪临床症状，死亡率为50%，剖检脏器可见明显病理变化，攻毒1 d内泄殖腔排毒阳性。本试验分别在感染途径和感染剂量两个方面进行了最优剂量筛选，并通过动物回归试验验证了发病模型的结果。该发病模型证明FAdV-2是引发心包积液-肝炎综合征的病原之一。

4　结论

本试验成功分离出1株FAdV-2野毒株，并将其命名为KM株，通过生物信息学软件对其Hexon和Fiber基因进行遗传演化分析，结果表明，KM株与FAdV-2 GX01株的同源性最高；此外，通过动物实验分析KM株在不同感染途径和不同感染剂量下对6周龄SPF鸡的致病性，发现FAdV-2也可以引发心包积液-肝炎综合征并导致SPF鸡死亡，同时验证了静脉注射途径感染导致的发病严重程度高于肌肉注射。本研究建立了FAdV-2 KM株感染SPF鸡的动物发病模型，为研究FAdV-2的免疫原性和评价疫苗效果提供参考。