2023, Vol. 50文章信息
引用本文 |
基金项目
- 国家重点研发计划项目（2019YFD1000500）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（1630052023002）；海南省自然科学基金（321RC640）
作者简介
- 余乃通（1985—），男，博士，副研究员，研究方向为热带作物病毒学与抗病分子育种，E-mail：yunaitong@163.com.
文章历史
- 收稿日期：2023-05-30
2. 海南省热带微生物资源重点实验室，海南 海口 571101;
3. 清华大学附属中学文昌学校，海南 文昌 571300
2. Hainan Key Laboratory of Tropical Microbe Resources, Haikou 571101, China;
3. Tsinghua University High School-Wenchang, Wenchang 571300, China
【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界热区的重要口粮，也是重要的热带能源作物之一。木薯具有较强的耐旱、耐贫瘠能力，适应性强，目前已在世界热区广泛种植[1-2]。然而，由木薯双生病毒（Cassava mosaic geminivirus, CMVs）感染引起的木薯花叶病（Cassava mosaic disease, CMD）是世界木薯产业的主要限制因素，在非洲和东南亚广泛流行。引起CMD的CMVs病原及其变种有11种，包括非洲木薯花叶病毒（African cassava mosaic virus, ACMV）、斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV）、南非木薯花叶病毒（South African cassava mosaic virus, SACMV）等[3]。20世纪初，SLCMV首先在斯里兰卡被发现和报道，目前已在亚洲的柬埔寨、泰国、越南、老挝、印度和中国等国家发现[4]。2018年，在我国的福建和海南木薯上首次发现和报道了木薯花叶病的病原，即SLCMV[5-6]，序列分析显示，SLCMV中国分离株和斯里兰卡分离株以及印度分离株序列高度相似，同源性在98.5% 以上。中国学者对SLCMV及其他木薯双生病毒研究尚属起步阶段，且国内木薯种质资源对SLCMV的抗性背景也不清楚。此外，从亚洲各地区分离的不同SLCMV株系，其致病性差异还未有研究。因此，开展SLCMV病毒侵染性克隆及鉴定是解决上述问题的重要前期基础。【前人研究进展】 SLCMV是双生病毒科（Geminiviridae）的菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）成员，其基因组由2条大小约2 800 nt的单链环状DNA组分组成，即DNA-A组分和DNA-B组分[7-8]。本研究中SLCMV TVM3株系的DNA-A组分（GenBank序列号：KP455486.1）全长为2 747 nt，其正义链上含有2个开放阅读框（ORF）：AV1和AV2，分别编码外壳蛋白（Coat protein, CP）和AV2蛋白；反义链含有4个ORF：AC1、AC2、AC3和AC4，分别编码复制相关蛋白（Replication-associated protein, Rep）、转录激活蛋白（Transcriptional activator protein, TrAP）、复制增强子（Replication enhancer, REn）和RNA沉默抑制子AC4蛋白。DNA-B组分（GenBank序列号：KP455487.1）全长为2 741 nt，其正义链和反义链各含有1个ORF，即BV1和BC1，分别编码核穿梭蛋白（Nuclear shuttle protein, NSP）和运动蛋白（Movement protein, MP）[9]。根据DNA-A组分全长序列构建系统发育树，Legg等[10]把11种CMVs及其变种分成3组，分别为南亚组、西非组和东南非组。在亚洲地区，木薯花叶病由印度木薯花叶病毒（Indian cassava mosaic virus, ICMV）和SLCMV的2个株系感染引起，均属南亚组[11]。早在1993年，就有学者成功构建了木薯花叶病毒侵染性克隆[12]。2002年，Saunders等[13]也成功构建了SLCMV的侵染性克隆，初步阐明SLCMV最早可能是单组分病毒，进化过程中获取了DNA-B组分从而成为双组分病毒。
【本研究切入点】虽然木薯花叶病已在中国福建和海南等地方出现，但目前尚未在我国发生流行和大面积危害；国内木薯品种抗性不明及抗病种质资源缺乏的现状仍然存在，木薯花叶病一旦流行，将对我国木薯生产造成严重危害和经济损失。因此，开展病毒侵染性克隆构建是探究国内木薯种质资源抗花叶病遗传背景的有效手段。【拟解决的关键问题】利用分子生物学技术构建的病毒侵染性克隆，可通过农杆菌将含有目的病毒片段的质粒介导到植物体内，从而激活病毒蛋白表达和产生病毒全长基因组，最后包装成有侵染活性的病毒粒子，用于SLCMV与宿主相互作用研究。本研究以SLCMV TVM3株系为研究对象，旨在构建不含有编码区重复序列的病毒侵染性克隆，且能成功感染本生烟和拟南芥等模式植物，为下一步国内木薯种质资源抗花叶病遗传背景的精准鉴定、病毒基因功能鉴定以及病毒致病机理研究等提供重要前期基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料植物双元表达载体pCAMBIA1301由本实验保存；EasyTaq DNA Polymerase、GV3101（pSoup-p19）农杆菌感受态、大肠杆菌DH5a感受态、质粒快速小提试剂盒、2k DNA Marker、12k DNA Marker均购自北京全式金生物技术有限公司；快速植物DNA提取试剂盒（RaPure Plant DNA Mini Kit）购自广州美基生物科技有限公司；T4 DNA连接酶、Sac I、Sal I限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司；本生烟（Nicotiana benthamiana）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子为本实验室保存。
1.2 pDNA-A和pDNA-B侵染性克隆载体构建以全长为2 747 nt的SLCMV DNA-A为模板，构建DNA-A侵染性克隆载体。如图 1A所示，该侵染性克隆序列除了含有完整的DNA-A全长序列外，其5' 端还额外含有145 bp的非编码区重复片段（DNA-A+2603~+2747），3' 端也额外含有137 bp的非编码区重复片段（DNA-A+1~+137），两端分别含有Sac I和Sal I酶切位点。将此DNA-A侵染性克隆序列送往通用生物(安徽) 股份有限公司合成，通过T4 DNA连接酶（16 ℃）构建到pCAMBIA1301载体中，即pCAMBIA1301-DNA-A（pDNA-A）。通过化学转化法将pDNA-A转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，随机挑取1个重组子进行Sanger测序，所用引物依次为1301-F、1301-R、DNA-A-seq1~DNA-A-seq4（表 1）；同时提取质粒，用Sac I和Sal I双酶切验证。
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| AV1、AV2、BV1：病毒正义链ORF；AC1 ~ AC4、BC1：病毒负义链ORF；IR: 基因间隔区；Sac I、Sal I：酶切位点；蓝色区域表示重复的IR序列，重复序列大小约105 ~ 144 bp AV1, AV2, BV1 : Open reading frames from the positive sense DNA of the virus genome; AC1 ~ AC4 and BC1:Open reading frames from the negative sense DNA of the virus genome. IR: Intergenic region; Sac I, Sal I: The restriction endonuclease sites; The blue lines represent the repeated IR sequences, with ranging in size from 105 to 144 bp 图 1 pDNA-A（A）和pDNA-B（B）侵染性克隆构建示意图 Fig. 1 Schematic diagram for the construction of pDNA-A (A) and pDNA-B (B) infectious clone |
以全长为2 741 nt的SLCMV DNA-B为模板，构建DNA-B侵染性克隆载体。如图 1B所示，该侵染性克隆序列除了含有DNA-B完整的全长序列外，其5' 端还额外含有106 bp的非编码区重复片段（DNA-B+2636~+2741），同样，其3' 端也额外含有119 bp的非编码区重复片段（DNA-B+1~+119）。其他步骤同DNA-A，所用引物依次为1301-F、1301-R、DNA-B-seq1~DNA-B-seq4（表 1）。
1.3 侵染性克隆接种本生烟和拟南芥植株采用液氮冻融法，将pDNA-A、pDNA-B分别转入GV3101（pSoup-p19）农杆菌感受态细胞，挑取阳性单菌落至500 μL含有抗生素（50 μg/mL Kan, 50 μg/mL Rif, 50 μg/mL Strep）的LB液体培养基中单独培养，28 ℃震荡培养24 h；按照1:50的比例扩大培养，同时加入终浓度为20 mol/L的AS和10 mmol/L的Mes，28 ℃震荡过夜培养；4 ℃、5 000 r/min离心10 min，去上清，菌体沉淀用500 μL溶液（150 μmol/L AS, 10 mmol/L Mes, 10 μmol/L MgCl2）重悬，测定菌液OD600值，使两者的菌液OD600值一致（浓度范围0.4~0.6）；然后1:1混合两者的菌液，室温静置3~5 h；用0.2 mL的无针头注射器将50 μL处理好的农杆菌注入本生烟（5~6叶期）叶片下表皮的叶脉之间，每个叶片注射1个点，每株注射3个叶片，共接种10棵本生烟植株，同时设置接种空质粒的本生烟为对照，置于25 ℃精细培养房培养。
另将混匀的农杆菌侵染液倒入浅口容器中，将拟南芥植株（5~6叶期）的花絮和茎浸入侵染液，静置1 min，共接种10棵拟南芥植株，同时设置接种空质粒的拟南芥为对照，置于25 ℃精细培养房培养。
1.4 症状观察及PCR检测SLCMV侵染性克隆通过GV3101农杆菌接种本生烟和拟南芥植株后，每隔2~3 d观察并记录植株症状。接种14 d（拟南芥接种18 d）后，采集本生烟和拟南芥植株的第3片或第4片新生叶片，用试剂盒（RaPure Plant DNA Mini Kit）提取其总DNA，利用引物DNA-A 2000F和DNA-A 2400R（扩增目的片段约400 bp）、以及DNA-B 370F和DNA-B 800R（扩增目的片段约430 bp）两对引物分别对病毒两个组分进行PCR检测。PCR程序：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL于1% 琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统观察并拍照。
1.5 SLCMV侵染性克隆感染率检测本生烟和拟南芥植株接种SLCMV侵染性克隆后，每隔2~3 d观察并记录植株症状，在第30 d采集本生烟（10株）和拟南芥（10株）植株的新生叶片，利用引物DNA-A 2000F和DNA-A 2400R对病毒进行PCR检测，PCR程序同上。取5 μL PCR产物于1% 琼脂糖凝胶电泳，置于凝胶成像系统观察并拍照。3次重复实验后，分别计算SLCMV在本生烟和拟南芥植株中的感染率。
2 结果与分析 2.1 SLCMV侵染性克隆质粒构建将获得的pDNA-A和pDNA-B侵染性克隆质粒分别进行双酶切验证，结果显示均得到了3.1 kb左右的目的片段和12 kb左右的载体片段（图 2），Sanger测序表明其序列与目标序列一致，说明pDNA-A、pDNA-B侵染性克隆质粒构建成功；即成功获得了SLCMV侵染性克隆质粒pCAMBIA1301-SLCMV，可用于下一步的病毒接种实验。
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| M: DNA marker；1: pDNA-A双酶切DNA片段；2: pDNA-A侵染性克隆质粒；3:pDNA-B双酶切DNA片段；4:pDNA-B侵染性克隆质粒 M: DNA marker; 1:pDNA-A infectious clone plasmid was digested with Sac I/ Sal I. 2:pDNA-A infectious clone plasmid; 3:pDNA-B infectious clone plasmid was digested with Sac I/Sal I; 4: pDNA-B infectious clone plasmid 图 2 SLCMV DNA-A和DNA-B侵染性克隆质粒构建 Fig. 2 Construction of SLCMV DNA-A and DNA-B infectious clone plasmids |
2.2 SLCMV侵染本生烟和拟南芥植株症状观察及分子检测
本生烟接种SLCMV侵染性克隆7 d后，大部分本生烟植株新生叶片无明显症状；而在接种第10 d，本生烟植株的新生叶片开始出现扭曲、斑点褪绿等症状；接种第14 d，本生烟植株新生叶片出现严重扭曲、卷叶和明显的褪绿等症状；对照组新生叶片无症状（图 3A）。PCR检测结果显示，在接种SLCMV的第14 d，染病本生烟植株新生叶片DNA中可检测出DNA-A和DNA-B的特异性条带，而对照植株无任何条带（图 3B），表明SLCMV病毒已在本生烟植株成功复制并产生相应症状。
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| M: DNA marker；1~3：侵染后14 d，烟叶、对照组烟叶和pDNA-A质粒的DNA-A组分检测；4~6：侵染后14 d，烟叶、对照组烟叶和pDNA-B质粒的DNA-B组分检测 M: DNA marker; 1~3: PCR detection of DNA-A component on the 14 d of SLCMV-infected tobacco plants, control tobacco plants and pDNA-A plasmid; 4~6:PCR detection of DNA-B component on the 14 d of SLCMV-infected tobacco plants, control tobacco plants and pDNA-B plasmid 图 3 SLCMV侵染本生烟症状（A）及分子检测（B） Fig. 3 Symptoms (A) and molecular detection (B) of tobacco plants infected by SLCMV |
接种SLCMV侵染性克隆7 d后，大部分拟南芥植株新生叶片无明显症状；而在接种第11 d，拟南芥植株的新生叶片出现轻微扭曲症状；第18 d，新生叶片出现轻微扭曲、老叶黄化等症状；对照组新生叶片无症状（图 4A）。PCR检测结果显示，接种SLCMV 18 d后，染病拟南芥植株新生叶片可见DNA-A和DNA-B的特异性条带，而对照组无任何条带（图 4B），表明SLCMV病毒已在拟南芥植株成功复制并产生相应症状。
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| M: DNA marker；1~3: 侵染后18 d，拟南芥、对照组和pDNA-A质粒的DNA-A组分检测；4~6: 侵染后18 d，拟南芥、对照组和pDNA-A质粒的DNA-B组分检测 M: DNA marker; 1~3. PCR detection of DNA-A component on the 18 d of SLCMV-infected Arabidopsis plants, control Arabidopsis plants and pDNA-A plasmid; 4~6: PCR detection of DNA-B component on the 18 d of SLCMVinfected Arabidopsis plants, control Arabidopsis plants and pDNA-B plasmid 图 4 SLCMV侵染拟南芥症状（A）及分子检测（B） Fig. 4 Symptoms (A) and molecular detection (B) of Arabidopsis plants infected by SLCMV |
2.3 SLCMV在本生烟和拟南芥中的病毒感染率
接种SLCMV侵染性克隆后，本生烟植株前14 d的病程与2.2相似，而在15~30 d，表现出严重扭曲、卷叶和明显的褪绿等症状，且症状进一步加重。于第30 d采集新生叶片对病毒DNA-A组分进行PCR检测，结果显示，染病本生烟植株新生叶片均可检测到DNA-A特异性条带，pDNA-A质粒和pDNA-A/GV3101菌液也检测出目的条带，而对照组无任何条带。统计结果表明，SLCMV侵染性克隆在本生烟中的病毒感染率为96.67%（图 5）。
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| 小写英文字母不同者表示差异显著 Different lowercase letters represent significant differences 图 5 本生烟和拟南芥接种SLCMV侵染性克隆后的病毒感染率 Fig. 5 Viral infection rate of tobacco and Arabidopsis plants inoculated with SLCMV infectious clone |
接种SLCMV侵染性克隆后，拟南芥植株前18 d的病程与2.2相似；在第19~30 d，其症状未有明显变化，部分新生叶片仍出现轻微扭曲、老叶出现黄化等症状。于第30 d采集新生叶片对病毒DNA-A组分进行PCR检测，结果显示，仅从部分拟南芥植株新生叶片中检测到DNA-A特异性条带，而其他拟南芥植株新生叶片未检测到特异条带；pDNA-A质粒和pDNA-A/GV3101菌液也检测出目的条带，对照组无任何条带。统计结果表明，SLCMV侵染性克隆在拟南芥中的病毒感染率为40 %（图 5）。因此，SLCMV侵染性克隆通过农杆菌接种本生烟的病毒感染率达到96.67%，远高于在拟南芥植株中的病毒感染率，差异显著（P < 0.05）。
3 讨论病毒侵染性克隆是病毒反向遗传学操作的重要研究手段，也是病毒基因功能研究的基础工具。通过植物双向表达载体可将有侵染活性的病毒全长cDNA在宿主体内转录表达，或体外转录病毒RNA产物从而成功侵染宿主植物，两者都能产生病毒粒子。以此获得的病毒侵染性克隆，可用于病毒基因组的突变、缺失、插入、置换等研究，从而在寄主植物水平开展和鉴定病毒功能基因。植物DNA病毒的侵染性克隆是1983年在番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus, TGMV）上首先构建成功的[14]，随后其发展极为迅速，现已广泛应用于生物学和农学的各个领域。大量研究表明，植物环状DNA病毒的侵染性克隆构建需要大于一个病毒基因组的全长序列，一般为1.3~1.9倍（mer）于病毒基因组[15-16]。本研究构建的SLCMV病毒侵染性克隆，其pDNA-A和pDNA-B上的病毒序列分别为病毒原基因组DNA-A和DNA-B的1.1倍（mer）和1.08倍（mer），其重复序列主要来自非编码区，不含有编码区序列。因此，该SLCMV病毒侵染性克隆在研究病毒功能基因的突变、缺失、插入、置换等DNA重组技术带来更简便、更高效的研究方法。
本研究的SLCMV病毒侵染性克隆（TVM3株系）通过农杆菌接种本生烟和拟南芥，其病毒接种率存在一定的差异。如通过叶下表皮注射本生烟叶片，其96.67% 的本生烟植株均能感染SLCMV病毒，而拟南芥植株的感染率仅为40%，两者差异显著（P < 0.05）。其可能原因一是接种方法不同，拟南芥由于叶片偏小，主要采用的浸泡植物组织的方法，在效率上比直接注射体内会低一些。另一个原因是宿主植物差异，已有研究表明，菜豆金色黄花叶病毒属病毒更容易感染本生烟且表现出明显的症状，而在拟南芥中对SLCMV敏感性低，在植物中表现的症状也较轻[17-18]，因此在进化上，病毒在侵染宿主方面会更好的选择本生烟植株。
王国芬等[19]构建了SLCMV两个中国分离物的侵染性克隆，SLCMV-Col和SLCMV-DG1922。强致病分离物SLCMV-Col侵染性克隆接种普通烟，在第27 d可引起普通烟叶片向下卷曲，叶背出现耳突，扭曲变形和植株矮化。而弱致病分离物SLCMV-DG1922侵染性克隆接种普通烟，在第27 d普通烟症状不典型，植株新抽叶片无明显症状，植株生长正常。早在2008年，SLCMVKer20侵染性克隆被构建成功，其感染的普通烟症状也不典型，植株新抽叶片无明显症状，表明SLCMV-Ker20也可能是弱毒株系[17]。而本研究所使用的SLCMV-TVM3分离物感染本生烟后，在第14 d新生叶片出现严重扭曲、卷叶和明显的褪绿等症状，表明该分离物为强致病株系。
综上所述，本文构建的SLCMV病毒侵染性克隆为下一步探究国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景，病毒基因组结构和功能，以及寄主与病毒之间的相互作用提供重要前期基础，还可以利用该病毒侵染性克隆进行外源蛋白表达、基因沉默诱导等研究。
4 结论本研究成功构建了斯里兰卡木薯花叶病毒TVM3株系（SLCMV-TVM3）侵染性克隆并能侵染本生烟和拟南芥等模式植物。该侵染性克隆pDNA-A和pDNA-B上的病毒序列分别为病毒原基因组DNA-A和DNA-B大小的1.10倍（mer）和1.08倍（mer）且不含有重复的编码区序列，可为下一步国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景探究和病毒致病机理研究提供重要前期基础。症状跟踪观察和分子检测发现SLCMV可在本生烟新生叶片上大量增殖，且引起典型的扭曲、卷叶和明显的褪绿等双生病毒典型症状，而在拟南芥新生叶片仅表型出轻微症状。此外，SLCMV在本生烟中的病毒感染率达96.67%，而在拟南芥植株中仅为40%，两者差异显著，因此，本生烟更适用于双生病毒的致病机理研究。
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(责任编辑 陈丽娥)