2023, Vol. 50文章信息
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基金项目
- 国家自然科学基金(32272713);广东省重点领域研发计划项目(2020B02022001);广东省农业科学院协同创新中心项目(XTXM202203)
作者简介
- 金庆敏（1986—），女，硕士，助理研究员，研究方向为蔬菜分子育种与分子生物学，E-mail：dzjinqingmin@126.com; 吴廷全，博士，研究员，广东省农业科学院设施农业研究所设施新技术研究室主任，主要从事设施蔬菜抗性与品质性状研究。主持国家自然科学基金面上项目、博士后基金、广东省科技计划、广东省自然科学基金、广州市重点研发计划项目等9项；参加国家、省部级及市级项目30余项。发表学术论文100余篇，其中SCI论文40余篇。获广东省科技进步二等奖和广东省农业科学院一等奖各1项；授权国家发明专利25件；参与育成瓜类新品种7个。主持和参与农业农村部成果评价各1项，成果均达到国际先进及以上水平。担任《Plant Disease》《Scientia Horticulturae》《International Journal of Biological》《Macromolecules》《Gene》等国际期刊审稿专家。带领课题组创立的瓜类蔬菜疫病抗性鉴评技术、叶菜霜霉病抗性鉴评技术及蔬菜种子纯度鉴定技术已广泛服务于各农业企业和科研单位，创造了较好的经济和社会效益.
通讯作者
- 吴廷全（1976—），男，博士，研究员，研究方向为蔬菜作物抗性与品质，E-mail：tingquanwu@sina.com.
文章历史
- 收稿日期：2023-07-29
2. 广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640
2. Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables, Guangzhou 510640, China
【研究意义】黄瓜（Cucumis sativus L.）为葫芦科黄瓜属植物，起源于喜马拉雅山南麓的印度北部、锡金、尼泊尔和中国云南地区[1-2]，是世界上重要的蔬菜作物。中国为黄瓜最大的种植区，根据联合国粮农组织最新统计结果（https://www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL/visualize），2021年全球黄瓜种植面积为217.22万hm2，中国种植面积达129.25万hm2，占比59%；全球黄瓜总产量为9 352.88万t，中国黄瓜产量达7559.77万t，占比81%。因此，黄瓜在我国具有重要的农业经济价值[3]。世界范围内主要作物的优良品种大多通过杂交育种的方法育成[4]。传统的品种纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法从农业生产角度看具有稳定可靠的优点[5]，但从遗传学角度看，品种的纯度和真伪鉴定实质上是对品种基因型的鉴定，且只有通过鉴定DNA分子本身才能准确可靠地鉴定品种的基因型[3, 6-7]。有限的亲本资源和杂交品种的不断涌现，使得品种尤其是杂交种子之间的遗传差异越来越小，蔬菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难[8]，加之黄瓜为自花授粉作物，人工去雄不及时，常会出现假杂种，导致种子遗传纯度降低，给生产造成巨大损失[9]。为保证优良品种能够产生最大的经济效益，开发快速、准确、有效的品种鉴定方法显得尤为重要。【前人研究进展】DNA分子标记技术是随着分子生物学发展而兴起的新型鉴定方法，具有简便、快速、准确的特点[10]。目前常用的分子标记技术包括扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、相关序列扩增多态性（Sequence related amplified polymorphism，SRAP）、序列特征化扩增区域（Sequence characterized amplified region，SCAR）和简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）等[6, 11]。SSR分子标记具有共显性、分布广泛、多态性高等特征，且SSR分子标记稳定性高、操作简单、重复性好，且对DNA质量要求低，可准确高效地鉴别大量等位基因[12-13]。鉴于以上优势，SSR分子标记已在水稻[14-18]、玉米[19-21]、小麦[22-23]、棉花[24-25]、茄子[26]、白菜[27-31]、冬瓜[8]、节瓜[32]、丝瓜[33]、苦瓜[34]等多种作物上得到应用。近年来，SSR标记也被广泛应用于黄瓜[1, 3, 35-38]，如在黄瓜纯度鉴定[3, 35]、重要基因定位[39-41]、种质资源多样性分析[42-45]等方面应用较多。周胜军等[12]在699对SSR引物中筛选出3对引物在‘浙秀1号’杂交种及其父母本之间表现出稳定的共显性，其在‘浙秀1号’黄瓜杂交种的带型均为父母本的互补带，表明3对引物可用于‘浙秀1号’黄瓜杂交种的种子纯度鉴定，且与田间鉴定结果一致。孟淑春等[1, 38]利用66对SSR引物对‘京研绿翡翠’黄瓜品种进行分子标记筛选，得到10对稳定的SSR引物可用于该品种种子的纯度鉴定；利用72对SSR引物对‘京研冬美9号’黄瓜品种进行分子标记筛选，得到2对引物可用于该品种种子的纯度鉴定，且上述筛选到的引物鉴定结果均与田间鉴定结果一致。李春等[36]从240个黄瓜SSR分子标记筛选到2对SSR分子标记（Cs100和Cs109），可对‘川绿15号’华南型黄瓜品种进行种子纯度鉴定，且2对标记的分子鉴定结果与田间形态鉴定结果一致，并可将‘川绿15号’与其他品种的黄瓜种子区分开。以上均为发掘利用SSR分子标记、建立快速高效的黄瓜种子纯度鉴定方法提供了重要的理论依据。【本研究切入点】黄瓜种子纯度和真实性鉴定一直是黄瓜商业化制种中亟待解决的科学问题。传统的种子纯度鉴定方法存在一定的局限性和不足之处，无法完全确保黄瓜种子的纯度和真实性[38]。目前，市场上黄瓜品种居多，存在一品多名或一名多品的情况，且黄瓜遗传背景狭窄，尤其是华北型黄瓜，遗传相似性较高，用传统方法鉴定存在一定难度，利用分子标记的方法可从根本上解决这个问题。同时，本单位所育成的‘粤秀3号’黄瓜品种具有生长势强、产量高、抗病抗逆性强的特点，是华南地区推广面积较多的品种[46]。为实现‘粤秀3号’黄瓜在生产制种中增质提效，以进一步推广该黄瓜品种，本研究拟采用SSR分子标记技术，以‘粤秀3号’及其父母本为试验材料，建立一种准确、快速和可靠的方法，用于检测和鉴定‘粤秀3号’黄瓜杂交种子的纯度和真实性。【拟解决的关键问题】本研究围绕如何选择适合的SSR分子标记，以最大程度地提高‘粤秀3号’黄瓜杂交种子鉴定的准确性和稳定性；如何建立一套标准化的实验流程，确保不同实验室和操作人员之间的结果具有一致性；如何验证该方法在不同批次和环境下的适用性和稳定性，以确保其在实际种子鉴定中的可行性等关键问题展开试验。为降低‘粤秀3号’黄瓜种子纯度鉴定成本，提高种子纯度鉴定时效性及稳定性，利用公开的SSR标记引物资源，筛选用于‘粤秀3号’纯度和真实性鉴定的特异性引物，并建立一套高效准确的黄瓜品种种子纯度鉴定方法，为SSR标记在黄瓜品种鉴定和‘粤秀3号’的市场化推广提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究所用黄瓜品种为广东省农业科学院蔬菜研究所育成的华北型黄瓜杂种一代‘粤秀3号’，其父本材料为C-8，母本材料为A-2。父本C-8植株生产强势，叶色深绿，叶片较小，抗病性强，皮色深绿有光泽，为长春密刺系统变异植株中所选出的单株。母本A-2是在100多份资源材料鉴定的基础上选出的，原始材料来源于亚洲蔬菜中心，主要表现为早熟、分支强、主侧蔓结果[46]。‘粤秀3号’黄瓜早熟，主侧蔓结瓜，连续结果性强，回头瓜多，瓜型呈长棒状，匀称，外形美观，皮色深绿有光泽，刺瘤密，白刺，单瓜重400~450 g，肉厚，味甜脆嫩，商品性好，耐贮运，较抗枯萎病、霜霉病、炭疽病、白粉病等多种病害，是华南地区推广面积较多的品种。
1.2 试验方法1.2.1 基因组DNA的提取 所有材料均于2022年7月中旬浸种催芽播种于穴盘，在蔬菜研究所重点实验室培养，待种子发芽后取两片子叶用于DNA提取。采用德国进口研磨仪RETSCH（莱驰）MM400将样品研磨后，参考姚春鹏等[34]DNA提取方法提取黄瓜基因组DNA，用DL2000核酸蛋白分析仪测定OD260、OD280的值，1% 琼脂糖电泳检测DNA质量。
1.2.2 SSR分子标记引物的筛选 在黄瓜基因组数据库网站（http://www.cucurbitgenomics.org/）下载SSR分子标记序列，选用200对均匀分布在黄瓜染色体上的SSR分子标记引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。参考‘粤秀3号’黄瓜及其父母本材料，将所提取基因组DNA各取10份混合，分别形成‘粤秀3号’及其父母本材料的混合池，按照父母本带型互补的原则用于筛选‘粤秀3号’黄瓜的特异性SSR分子标记。
1.2.3 PCR扩增及丙烯酰胺电泳 PCR扩增反应体系为20 μL：基因组DNA（100 ng/μL）：1.0 μL，Mg2+（20 mmol/L）：1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）：2.0 μL，SSR上下游引物（10 mmol/μL）：0.4 μL，Taq酶（5U/μL）：0.2 μL，10×PCR buffer：2.0 μL，加ddH20补足至20 μL。
PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，35个循环；72 ℃保持7 min，4℃保存待检测。扩增产物经8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（120 V，1.5 h）；电泳结束后，丙烯酰胺凝胶经0.1% AgNO3银染15 min，然后用2% NaOH、0.4% 甲醛、0.04% Na2CO3显色，清水冲洗干净后在灯箱拍照分析。
1.2.4 DNA片段的回收及测序 将父母本互补的两条差异条带在丙烯酰胺凝胶上用手术刀割下，然后用DNA回收试剂盒（全式金EasyPure Quick Gel Extraction Kit）将DNA片段回收，然后将所回收条带连接至T载体（全式金pEASY-T1 Cloning Kit），转化DH5α（全式金Trans5α Chemically Competent Cell）大肠杆菌，挑取阳性单克隆菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.5 种子纯度鉴定 随机选取42粒‘粤秀3号’黄瓜种子提取基因组DNA，用筛选出的SSR分子标记对‘粤秀3号’黄瓜种子及其父母本参照1.2.4方法进行PCR扩增及丙烯酰胺电泳，染色并读带，判定‘粤秀3号’黄瓜种子纯度。
1.2.6 田间形态鉴定 选取‘粤秀3号’黄瓜种子260粒，于2022年7月中旬浸种催芽，播种于穴盘育苗。8月上旬（长出1~3片真叶）移栽238株‘粤秀3号’黄瓜于广东省农业科学院蔬菜研究所白云基地。采用深沟高畦，畦宽1.8~2.0 m，畦高30 cm，株距30 cm，进行常规化管理。在盛果期随机选取100株‘粤秀3号’黄瓜植株，通过田间性状（主要包括瓜型、瓜长、皮色、刺瘤、瓜重等）鉴定其种子纯度。
1.2.7 SSR分子标记特异性鉴定 选取市场上同种类型的黄瓜品种（‘中农108’‘园丰6号’‘津绿5号’‘中农8号’‘津研四号’）种子及其他49份黄瓜种质材料提取DNA，用所筛选的SSR引物对‘粤秀3号’及其亲本进行PCR扩增实验。并对扩增条带进行检测，检验所筛选的SSR分子标记对‘粤秀3号’黄瓜种子纯度鉴定的特异性和有效性。
2 结果与分析 2.1 ‘粤秀3号’黄瓜基因组DNA提取结果分析琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，所提取的‘粤秀3号’黄瓜基因组DNA条带清晰，无明显拖带和降解现象（图 1）。DNA质量检测结果显示，其OD260/OD280比值在1.79~1.98之间，且琼脂糖胶的条带单一，表明所提取的DNA纯度高、杂质少、质量好，满足本试验对基因组DNA的质量要求。
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| M：DNA Marker；1~14：DNA样品 M: DNA Marker; 1-14: DNA sample 图 1 ‘粤秀3号’基因组DNA检测 Fig. 1 Genomic DNA testing of 'Yuexiu No.3' |
2.2 黄瓜SSR分子标记的筛选
以‘粤秀3号’黄瓜父母本为模板，利用合成的200对SSR引物进行PCR扩增及检测，筛选出12对父母本条带差异性引物。将此12对引物在F1中进行验证，经多次重复比较，筛选杂交种与父母本呈现共显性互补带型分离的引物组合，最终筛选出3B-10、2B-41两对SSR引物（表 1）。这两对引物所扩增出的条带清晰、稳定性和重复性好，在父母本中有共显性差异。3B-10引物在母本A-2材料中扩增到特异性条带P1-A，在父本C-8材料中扩增到特异性条带P2-B（图 2A）；2B-41引物在母本A-2材料中扩增到特异性条带P1-C，在父本C-8材料中扩增到特异性条带P2-D（图 2B）。
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| P1：母本A-2；P2：父本C-8；F1：‘粤秀3号’ P1: Female parent A-2;P2: Male parent C-8;F1: 'Yuexiu No.3' 图 2 引物3B-10（A）和2B-41（B）对‘粤秀3号’及其亲本的PCR扩增 Fig. 2 PCR amplification of'Yuexiu No.3'and its parents with primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B) |
2.3 黄瓜SSR分子标记纯度鉴定
取‘粤秀3号’黄瓜材料基因组DNA，用3B-10、2B-41两对SSR引物进行PCR检测。3B-10引物在44份‘粤秀3号’黄瓜F1代基因组DNA扩增结果中，43株具有父母本双方的特异条带P2-B与P1-A（图 3），1株仅具有母本特异性条带P1-A，得出‘粤秀3号’黄瓜种子纯度为97.73%；2B-41引物的检测结果与3B-10引物结果一致（图 4）。综上，本研究所筛选的两对SSR分子标记均可稳定、准确地对‘粤秀3号’黄瓜进行种子纯度鉴定。
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| M：DNA Marker；P1：母本A-2；P2：父本C-8；1~44：‘粤秀3号’F1代 M: DNA Marker; P1: Female parent A-2;P2: Male parent C-8;1-44: F1 generation of 'Yuexiu No.3' 图 3 引物3B-10对‘粤秀3号’亲本及其杂交F1代种子的纯度鉴定 Fig. 3 Purity identification for the seeds from 'Yuexiu No.3' parents and their hybrid F1 generation by primer 3B-10 |
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| M：DNA Marker；P1：母本A-2；P2：父本C-8；1~44：‘粤秀3号’F1代 M: DNA Marker; P1: Female parent A-2;P2: Male parent C-8;1-44: F1 generation of 'Yuexiu No.3' 图 4 引物2B-41对‘粤秀3号’亲本及其杂交F1代种子的纯度鉴定 Fig. 4 Purity identification for the seeds from 'Yuexiu No. 3' parents and their hybrid F1 generation by primer 2B-41 |
2.4 ‘粤秀3号’黄瓜田间性状鉴定
田间性状（主要包括瓜型、瓜长、皮色、刺瘤、瓜重等）鉴定结果显示，随机选取的100株‘粤秀3号’黄瓜植株中有98株为杂交种，2株性状表现为母本类型，其田间纯度为98%；用3B-10、2B-41两对SSR分子标记对44份‘粤秀3号’黄瓜种子纯度鉴定，结果显示，43份为杂交种，1份为母本类型，种子纯度为97.73%，与田间性状鉴定结果一致。表明这两对SSR分子标记可准确地对‘粤秀3号’黄瓜进行分子纯度鉴定。
2.5 黄瓜SSR分子标记特异性鉴定在‘粤秀3号’黄瓜中增加性状相似的‘中农108’‘园丰6号’‘津绿5号’‘中农8号’‘津研四号’黄瓜品种种子作为假种子，同时使用3B-10、2B-41两对SSR分子标记对‘粤秀3号’及其他49份种质材料进行鉴定。结果显示，3B- 10、2B-41两对引物在‘粤秀3号’中为杂合互补带型，在‘中农108’‘园丰6号’‘津绿5号’‘中农8号’中为父本或母本的纯合条带，在‘津研四号’中则无条带显示（图 5），表明3B-10、2B-41为‘粤秀3号’的特异性分子标记，可明显区分‘粤秀3号’种子与其他参试黄瓜品种。
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| M：DNA Marker；P1：母本A-2；P2：父本C-8 M: DNA Marker; P1: Female parent A-2;P2: Male parent C-8 图 5 引物3B-10（A）和2B-41（B）对‘粤秀3号’的特异性鉴定 Fig. 5 Specificity verification of primers 3B-10 (A) and 2B-41 (B) for 'Yuexiu No.3' |
利用3B-10及2B-41对‘粤秀3号’黄瓜与其他49份黄瓜种质资源的真实性进行鉴定，结果（图 6、图 7）发现，仅‘粤秀3号’黄瓜具有父母本的两个条带，其他49份黄瓜种质资源均未出现该两条电泳条带。但3B-10在49份黄瓜种质资源中多态性较高，未能有效区分7×8、24×25、36×37等组合的杂交种。表明本研究所筛选的两对SSR分子标记中，2B-41对‘粤秀3号’黄瓜具有更好的特异性，可用于‘粤秀3号’黄瓜真实性鉴定。
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| M：DNA Marker；P1：母本A-2；P2：父本C-8；F1：‘粤秀3号’F1代；1~49：49份黄瓜种质资源 M: DNA Marker; P1: Female parent A-2;P2: Male parent C-8;F1: F1 generation of 'Yuexiu No.3';1-49: 49 cucumber germplasm resources 图 6 引物3B-10对‘粤秀3号’的真实性鉴定 Fig. 6 Authenticity identification of 'Yuexiu No.3' by primer 3B-10 |
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| M：DNA Marker；P1：母本A-2；P2：父本C-8；F1：‘粤秀3号’F1代；1~49：49份黄瓜种质资源 M: DNA Marker; P1: Female parent A-2;P2: Male parent C-8;F1: F1 generation of 'Yuexiu No.3';1-49: 49 cucumber germplasm resources 图 7 引物2B-41对‘粤秀3号’的真实性鉴定 Fig. 7 Authenticity identification of 'Yuexiu No.3' by primer 2B-41 |
2.6 SSR分子标记差异性条带序列的鉴定分析
为明确3B-10、2B-41两对SSR分子标记在‘粤秀3号’黄瓜及其父母本中所扩增到的DNA序列及其差异，本研究对父母本中所扩增到的差异条带进行胶回收，将DNA片段连接至T载体测序并对比分析。结果（图 8、图 9）表明，3B-10在父母本中所扩增到的差异条带P1-A（160 bp）比P2-B（190 bp）在49~79 bp处缺少5个6碱基（GTGAGG）的简单重复序列；2B-41在父母本中所扩增到的差异条带P1-C（218 bp）则比P2-D（206 bp）在120~131 bp处缺少12个碱基。
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| 图 8 引物3B-10扩增父母本DNA差异片段的序列比对 Fig. 8 Sequence alignment of parental DNA differential fragments amplified by primer 3B-10 |
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| 图 9 引物2B-41扩增父母本DNA差异片段的序列比对 Fig. 9 Sequence alignment of parental DNA differential fragments amplified by primer 2B-41 |
3 讨论
目前，我国蔬菜种子市场处于瓶颈期，种子质量是农业生产中的重要元素，其质量的优劣程度直接影响到农产品的质量和产量。种子纯度鉴定不仅是保证种子质量不可或缺的一部分，而且在品种权保护、品种登记管理、种质资源多样性分析及种子生产中有重要价值[38]。相对于周期长、成本高、易受环境影响的传统种子纯度鉴定方法，以SSR分子标记为基础的种子纯度鉴定方法快速、高效、低成本且操作简单，是目前商品种种子纯度鉴定的理想方法[8]。
随着黄瓜产业发展及生产的需求，越来越多的新品种涌入市场，同时也存在劣种、假种等现象，在黄瓜育种及制种过程中黄瓜品种纯度的鉴定显得尤为重要[9]。利用SSR分子标记对黄瓜进行分子纯度鉴定，结果更为准确，且与田间鉴定结果一致。李海梅等[9]基于黄瓜线粒体父系遗传特性，从线粒体基因组中的72对SSR引物中筛选出4对引物，在30份黄瓜品种中呈现多态性，其中利用引物mtSSR4和mtSSR10对4份黄瓜F1种子纯度进行鉴定，结果显示黄瓜F1种子的带型与其父本一致，可将掺入杂交组合中的假种子区分开。但其种子鉴定结果有一定的局限性，不能排除F1种子中掺入杂交种父本的情况，而本研究所筛选到的引物可严格区分出杂交种子的父母亲本。周胜军等[12]从699对SSR引物中筛选出3对引物，其可有效鉴定出‘浙秀1号’黄瓜杂交种及其父母亲本，引物稳定性良好且种子纯度鉴定结果与田间鉴定结果一致，但其未对所筛选引物的特异性进行鉴定，仅限于对父母本的区分，不能与其他品种黄瓜种子相区分。本研究使用与‘粤秀3号’黄瓜田间性状类似的5个黄瓜品种及其他49份黄瓜种质资源对3B-10、2B-41两对SSR分子标记的特异性进行验证，结果表明所筛选到的SSR分子标记2B-41不仅可鉴定其纯度，也可有效地将‘粤秀3号’与其他相似黄瓜品种区分开来，说明该标记对‘粤秀3号’黄瓜品种有良好的特异性，实现了其对品种的真实性鉴定。陈鸿鸵等[37]利用100对SSR引物对黄瓜品种‘SH23’及其亲本进行筛选，得到5对在‘SH23’及其亲本和对照品种间多态性较高的SSR引物，均可有效鉴别出‘SH23’及其他品种，表明SSR标记可用于黄瓜品种的真实性鉴定。本研究所建立的‘粤秀3号’黄瓜种子纯度鉴定方法，在科学取样的基础上得到种子纯度鉴定结果，其准确率可达100%。此外，本研究解析了3B-10、2B-41两对SSR分子标记在‘粤秀3号’黄瓜父母本中的差异条带，与前人已报道的黄瓜种子纯度鉴定相比，丰富了SSR分子标记的内涵，明确了具体的DNA差异片段序列信息，增强了SSR分子标记在鉴别和区分黄瓜品种遗传背景差异的能力。‘粤秀3号’为华南地区主要的黄瓜栽培品种，该分子标记的开发可有效解决制种后的种子质量检测滞后问题，大幅节约时间及人工成本，为‘粤秀3号’在华南地区的推广提供技术支撑。
4 结论本研究从200对SSR分子标记引物中筛选得到可用于‘粤秀3号’黄瓜种子纯度鉴定的两对引物3B-10和2B-41。3B-10引物在父、母本中可分别扩增出190 bp和160 bp的特异性条带，而2B-41引物在父、母本中则分别能够扩增出206 bp和218 bp的特异性条带，这些条带均可作为特异标记使用；两对引物均能够有效区分‘粤秀3号’杂交种子与其父本、母本，且该结果与田间生物学鉴定结果一致。2B-41可用于‘粤秀3号’的真实性鉴定，可有效地将其与其他品种种子所区分。本研究所开发的3B-10和2B-41两对SSR分子标记引物可快速、准确、有效地对黄瓜‘粤秀3号’杂交种子的纯度进行鉴定，且操作简单、成本较低，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有极高的商业应用价值。
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