2023, Vol. 50文章信息
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基金项目
- 广州市科技计划项目（2023B03J1322）；国家重点研发计划项目（2019YFD1001003）
作者简介
- 周荣，硕士，三级教授，硕士生导师，佛山科学技术学院风景学院学科和专业带头人，主要从事园艺园林植物开发利用研究。主持广东省科技厅、省农业农村厅、佛山市等省市厅科研课题10余项，发表论文40多篇，主编专著4部、参编1部。获广东省科技进步三等奖、广东省农业技术推广奖二等奖和三等奖、佛山市科技进步二等奖、中国发明协会创业银奖等奖项10余项；授权国家发明专利1件。曾获广东省“三八红旗手”、广东省三下乡优秀教师、广东省创新创业优秀指导教师、佛山市“三八”红旗手、佛山市科技标兵等称号；指导大学生“挑战杯”创业计划竞赛获得国银和省银奖、“互联网+”大学生创新创业大赛获得省金和省铜奖；主持教育部协同育人、广东省质量工程项目各1项、校级教研课题3项；主编和参编教材2部；指导学生国家和省级大学生创业项目5项；兼任中国花卉协会兰花分会副秘书长、广东省兰花协会副会长、《佛山科学技术学院学报》编委。周荣（1966—），女，硕士，教授，研究方向为园艺园林植物开发和利用，E-mail：602597936@qq.com; 杨凤玺，博士，研究员，硕士生导师，主要从事兰花种质资源创新、重要性状功能基因挖掘、分子育种及新品种配套栽培技术研发。广东省农业科学院环境园艺研究所副所长兼兰花研究室主任、广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室主任，兼任中国花卉协会兰花分会副秘书长、广东省园艺学会副理事长、广东省现代农业产业技术体系花卉团队岗位专家、广东省农村科技特派员、广州市乡村振兴“百团千人科技下乡”专家等。主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划项目（子课题负责人）、广东省自然科学基金、广东省科技基础条件建设重点项目、广州市重点研发计划等30余个项目。获神农中华农业科技优秀团队奖、云南省自然科学一等奖、湖南省科技进步二等奖、广东省农业技术推广奖二等奖和汕头市科学技术二等奖等多项奖励。发表论文50余篇（SCI 30篇），参编专著2部，获授权国家发明专利8件（排名第一），培育特色兰花新品种9个.
通讯作者
- 杨凤玺（1985—），女，博士，研究员，研究方向为兰科植物遗传育种，E-mail：yangfengxi@gdaas.cn.
文章历史
- 收稿日期：2023-07-09
2. 广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东 广州 510640
2. Environmental Horticulture Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China
【研究意义】墨兰（Cymbidium sinense）是我国国兰的典型代表之一，在福建、广东、台湾广泛分布。墨兰叶型独特，花姿优美，花香馥郁，花期长（9月至翌年3月），具有很高的观赏价值和经济价值[1–3]，产品远销韩国、日本等地。开花性状是墨兰最重要的育种目标，而APETALA1（AP1）基因在植物成花转变和花器官发育过程中具有非常关键的作用[4]。开展墨兰AP1基因的克隆和表达分析研究，对探究墨兰开花过程中的分子调控机制具有重要意义。【前人研究进展】MADS-box基因家族是一类在植物中广泛存在的转录因子家族，可与其他转录因子和调控因子相互作用，共同在植物花器官分化、果实发育和开花调控等方面起作用。MADSbox基因家族通常分为两个亚家族（Type Ⅰ和Type Ⅱ），其中Type Ⅱ亚家族基因编码的蛋白质均有1个特征性结构域K，能够折叠形成3个α螺旋结构，介导MADS-box蛋白之间形成二聚体，通过蛋白复合体共同调控下游靶基因。以Type Ⅱ类MADS-box基因为核心构成的花发育ABCDE模型决定植物花器官的发育[5-6]。A类基因主要影响花朵的外轮花器官发育，同时与E类基因共同参与萼片的发育，并与B类基因和E类基因共同调控花瓣的形成和特化。AP1属于A类基因，其突变或过表达都会对植物的开花时间和花器官产生显著影响[7-8]。在拟南芥中，过表达AP1可使拟南芥提前1周左右开花[9]。AP1同时可以抑制最外轮花器官萼片叶腋处形成更多花原基。另外，AP1可以分别通过抑制细胞分裂素合成基因和激活细胞分裂素降解酶，减少AP1基因表达区域的细胞分裂素含量，从而维持正常花分生组织的有限生长。目前，建兰（C. ensifolium）[10]、石斛（Dendrobium Chao Praya Smile）[11]、萼脊兰（Sedirea japonica）[8]、牡丹（Paeonia suff ruticosa）[12]、荔枝（Litchi chinensis）[13]、大豆（Glycine max）[14]等多种植物的AP1基因已被成功克隆，研究发现，它们在花器官的形成和花期调控中起着非常重要的作用。【本研究切入点】目前关于墨兰AP1基因的研究报道甚少，该基因在墨兰上的功能表现也尚未清楚。因此，本研究以墨兰为研究对象，克隆并鉴定到1个墨兰AP1基因（命名为CsAP1-A），并进行基因表达模式分析[15]。【拟解决的关键问题】本研究克隆墨兰CsAP1-A基因，通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系，利用RTqPCR方法分别检测CsAP1-A在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况，通过转录组测序分析CsAP1-A在5个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况，并采用蛋白互作预测软件分析CsAP1-A与其他蛋白的互作关系，为进一步研究CsAP1-A在墨兰花发育过程的功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料基因克隆、表达分析供试的墨兰品种为‘小香’，栽培于广东省农业科学院环境园艺研究所国家墨兰种质资源圃内。挑选3株长势良好的墨兰，采集其花芽、成熟花器官及根、茎、叶和果各3 g左右，用液氮速冻，-80 ℃保存备用。
不同花型转录组测序分析供试的5个墨兰品种为‘瑞金’（WT普通花型）、‘安康梅’（花瓣蕊柱化的梅瓣花型，Gynostegium-like petal variety，GPV）、‘大圣’（重瓣花型，Multi perianth variety，MPV）、‘金凤蝶’（花瓣唇瓣化花型，Labellum -like petal variety，LaPV）和‘六瓣花’（唇瓣萼片化花型，Null-labellum variety，NLV），均来源于广东省农业科学院环境园艺研究所国家墨兰种质资源圃。采集的花朵立即用液氮速冻处理。
DH5α化学感受态细胞、荧光定量试剂盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）、高保真酶试剂盒（2×Phanta Flash Master Mix）、产物纯化试剂盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、克隆载体试剂盒（5 min TA/Blunt Cloning Kit）和RNA提取试剂盒（FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit），均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
1.2 总RNA提取及反转录用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取墨兰花芽的RNA，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。使用蛋白核酸分析仪检测RNA浓度，使用1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，将检测合格的RNA进行反转录反应得到cDNA。
1.3 目的基因克隆以前期基因组测序得到的CsAP1-A CDS为参考序列，使用NCBI设计基因克隆的PCR引物：CsAP1-A-F 5'ATGGGAAGAGGGAGGGTT3'、CsAP1-A-R 5'TTATCCATTCATATGAGTGAGC3'。以墨兰花芽cDNA为模板，按照高保真酶试剂盒说明书操作进行CsAP1-A基因克隆，PCR体系为50 μL，反应程序：98 ℃预变性30 s；98 ℃预变性10 s、58 ℃退火5 s、72 ℃延伸5 s，34个循环；72 ℃延伸1 min。扩增产物回收纯化后与TA克隆载体连接，转化到DH5α化学感受态细胞中培养，次日挑选阳性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，得到CsAP1-A基因完整序列。
1.4 CsAP1-A生物信息学分析使用Expasy-ProtParam（https://www.expasy.org/）分析CsAP1-A蛋白的分子量大小、亲水性等理化性质；使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析CsAP1-A的保守结构域；使用DNAMAN软件将CsAP1-A与6个同源蛋白进行多序列比对；使用Mega6.0软件的邻接法构建CsAP1-A系统进化树。
1.5 CsAP1-A基因表达分析使用RT-qPCR方法对CsAP1-A在墨兰不同器官（根、茎、叶、花、果）、不同花发育阶段（花芽分化初期S1、花芽分化发育期S2、花梗伸长期S3、排铃期S4和开花期S5）和不同花组织部位（萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱）的表达进行分析。以CsActin作为内参基因（表 1），PCR反应程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40个循环。基因表达试验重复3次，使用2-ΔΔCt公式计算CsAP1-A相对表达量[16]。
1.6 不同花型转录组测序分析
采集5个不同花型（WT、GPV、MPV、LaPV、NLV）墨兰品种（‘瑞金’‘安康梅’‘大圣’‘金凤蝶’‘六瓣花’）的花朵，立即液氮速冻处理，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行转录组测序。对CsAP1-A的FPKM值进行log2转换，并利用R语言中的Pheatmap工具包生成热图。
1.7 CsAP1-A蛋白互作关系通过STRING数据库（https://cn.string-db.org/）预测可能与CsAP1-A发生互作的蛋白质，并以水稻作为参考，构建CsAP1-A与其他蛋白的互作关系图。
2 结果与分析 2.1 CsAP1-A基因全长克隆以墨兰花芽为材料提取RNA，并将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，以墨兰基因组参考序列设计引物，扩增得到约750 bp的单一片段（图 1）。将回收的DNA片段与TA克隆载体进行连接并转化感受态细胞，最后通过测序得到CsAP1-A基因序列，全长744 bp，编码248个氨基酸（图 2）。
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| 图 1 CsAP1-A基因克隆PCR产物 Fig. 1 PCR product of CsAP1-A gene cloning |
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| 图 2 CsAP1-A基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列 Fig. 2 Nucleotide acid sequence of CsAP1-A gene and deduced amino sequence |
2.2 CsAP1-A生物信息学分析
2.2.1 CsAP1-A蛋白理化性质分析 根据Expasy-ProtParam预测分析结果，CsAP1-A蛋白的分子式为C1242H2038N370O376S9，蛋白分子量为28.4 kD，总原子数为4 035，脂肪系数为83.40，平均亲水性为-0.762，说明CsAP1-A是一个亲水蛋白。选择模型一致性高达98.38% 的同源蛋白AOA1P8SCC5.1A作为模板，通过SWISS-MODEL在线软件构建CsAP1-A蛋白的三级结构，发现该结构包含4个保守的α-螺旋和2个β折叠结构（图 3）。
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| 图 3 CsAP1-A蛋白三级结构预测 Fig. 3 Tertiary structure prediction of CsAP1-A protein |
2.2.2 CsAP1-A蛋白保守域分析与同源序列比对 通过NCBI数据库分析蛋白序列可知，CsAP1-A拥有保守的MADS-box结构域和K-box结构域（图 4），属于MADS-box转录因子家族成员。此外，通过NCBI数据库得到多个与CsAP1-A同源性很高的蛋白序列，其中，CsAP1-A与春兰（C. goeringii）AP1/FUL（APY18447.1）和蕙兰（C. faberi）MADS1（AGE15496.1）的同源性均高达98.38%，与金钗石斛（D. nobile）MADSbox protein 1（ABQ08573.1）、蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）AP1-related protein（AAZ76263.1）、华山姜（Alpinia oblongifolia）APETALA1-like protein（ABS83558.1）、银合欢（Nelumbo nucifera）APETALA1（AGY54940.1）的同源性分别为85.83%、82.19%、66.27% 和60.32%（图 5）。
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| 图 4 CsAP1-A蛋白保守结构域分析 Fig. 4 Analysis of conserved domains of CsAP1-A protein |
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| 图 5 CsAP1-A蛋白同源序列比对 Fig. 5 Homologous sequence alignment of CsAP1-A protein |
2.2.3 CsAP1-A氨基酸序列的系统进化 为进一步了解CsAP1-A蛋白的系统进化情况，从NCBI数据库中挑选20条与CsAP1-A氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列，利用MEGA6.0软件的NJ法构建进化树。结果（图 6）表明，CsAP1-A的进化树可以分为单子叶植物和双子叶植物两类[17]，其中在单子叶植物中，CsAP1-A与其他兰科植物亲缘关系较近，并聚类一起。
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| 图 6 CsAP1-A蛋白NJ系统进化树 Fig. 6 Neighbor-joining phylogenetic tree of CsAP1-A protein |
2.3 CsAP1-A基因时空表达分析
为研究CsAP1-A的表达模式，用RT-qPCR方法分别检测其在墨兰根、茎、叶、花、果不同器官，不同花发育阶段，以及萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱不同花朵组织部位的表达情况。结果（图 7）表明，CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达，在花中表达量最高，其次分别为茎、果、根和叶。
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| 图 7 CsAP1-A在墨兰不同器官中的相对表达量 Fig. 7 Relative expression of CsAP1-A in different organs of Cymbidium sinense |
在墨兰花芽分化发育的不同阶段，CsAP1-A集中在花发育早期阶段表达，在S1阶段的表达量最高，之后逐渐下降，在S3阶段的表达量降至60%，在S5阶段的表达量降至最低。此外，对墨兰不同花组织部位的表达分析发现，CsAP1-A在合蕊柱中的表达量最高，其次分别是唇瓣、花瓣和萼片（图 8）。
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| A：不同花发育阶段; B：不同花组织部位 A: At different stages of flower development; B: In different floral parts 图 8 CsAP1-A在墨兰花中的相对表达量 Fig. 8 Relative expression of CsAP1-A in flower of Cymbidium sinense |
2.4 不同花型墨兰CsAP1-A表达模式分析
分析墨兰不同花型转录组数据集，用热图形式显示不同花型CsAP1-A基因的表达情况。结果（图 9）表明，CsAP1-A在WT、MPV、LAPV和NLV 4种花型[18]中均以合蕊柱中的表达量最高、萼片中的表达量最低；在合蕊柱异常发育的MPV中，CsAP1-A在合蕊柱的表达量显著提高，而在GPV中的整体表达量最高，且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。
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| WT：普通花型，GPV：花瓣蕊柱化的梅瓣花型，MPV：重瓣花型，LaPV：花瓣唇瓣化花型，NLV：唇瓣萼片化花型；1~4：分别代表萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱 WT: Common type variety; GPV: Gynostegium-like petal variety; MPV: Multi perianth variety; LaPV: Labellum-like petal variety; NLV: Null-labellum variety; 1-4: Sepal, petal, labellum and gynostemium, respectively 图 9 不同花型墨兰CsAP1-A表达模式分析 Fig. 9 Analysis of expression patterns of CsAP1-A in different floral types of Cymbidium sinense |
2.5 CsAP1-A蛋白互作预测分析
使用String在线网站预测CsAP1-A蛋白与其他蛋白之间的互作可能性，并以水稻作为参考，结果（图 10）表明，CsAP1-A可能与MADS1（A类基因）、MADS6（D类基因）、MADS47（B类基因）、MADS8（C类基因）等10个蛋白存在互作关系。MADS1与MADS47的综合得分较高，推测CsAP1-A与它们互作的可能性更大。而在水稻中，OsMADS1和OsMADS6蛋白均属于MADSbox转录因子家族成员，且这些蛋白在花器官发育和花期调控方面发挥重要作用[19]。因此，推测CsAP1-A蛋白参与墨兰花的发育。
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| 图 10 CsAP1-A蛋白互作关系预测 Fig. 10 Prediction of CsAP1-A protein interactions |
3 讨论
MADS-box转录因子在调控植物花的形态和发育过程方面扮演着重要角色，而AP1基因是MADS-box转录因子家族的重要成员，被归类为拟南芥ABCDE开花模型中的A类基因，在许多植物中均被证实能够发挥调控植物开花、调控花器官发育的作用[20]。五峰玉兰MawuAP1基因可以使拟南芥提前开花，并在花序顶端产生顶生花[21]。过表达麻风树JcAP1基因能够显著缩短拟南芥的生长周期并导致提前开花[22]。过表达月季RcAP1也可以使拟南芥提前开花[23]。
本研究从墨兰花芽中克隆出CsAP1-A基因，该基因编码区为744 bp，编码248个氨基酸，含有MADS-box和K-box结构域，表明CsAP1-A是典型MADS-box转录因子。通过与其相似度较高的蛋白进行多序列比对，发现它们的保守结构域相同。系统进化树分析表明，CsAP1-A蛋白与春兰AP1/FUL3蛋白聚为一支，说明二者亲缘关系最近。
大多数A类基因在生殖器官的表达量均高于营养器官[24]。本研究比较了CsAP1-A基因在墨兰根、茎、叶、花、果5个器官的相对表达量，发现CsAP1-A在花中的表达量最高，在其他器官的表达量较低，说明CsAP1-A与花的发育和形成有关。在墨兰花芽分化的5个时期中，CsAP1-A在花芽分化初期（S1）的表达量最高，然后逐渐下降，在开花期（S5）的表达量降到最低，这与大部分的A类基因在不同花发育时期表达规律相似，如山茶的CjAPL1[25]、麻风树的JcAP1[22]和洋桔梗的EgAP1[26]，因为S1期是花器官形成的起始阶段和关键阶段，AP1作为一个转录因子，可以在此阶段启动信号来激活其他基因促进花的形成，而随着花芽的不断发育，其他相互作用的调控因子和信号通路逐渐介入，AP1的表达量就会逐渐降低。在墨兰花朵的不同组织部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表达量最高，其次是唇瓣，推测CsAP1-A主要参与墨兰合蕊柱的发育。对墨兰不同花型进行转录组测序分析，发现CsAP1-A在WT、MPV、LaPV和NLV 4种花型的合蕊柱中表达量均最高，这与RT-qPCR检测WT花型中CsAP1-A的表达结果相一致。AP1作为A类基因主要在第一、二轮花器官中表达，诱导花瓣和萼片的发育[7]；但在兰科植物中，AP1不在第一、二轮花器官表达，而是在内轮的合蕊柱中表达[27]。
根据蛋白互作关系的预测结果可知，CsAP1-A大多与MADS-box蛋白家族存在相互作用，而这些蛋白均与花器官发育和花期相关，因此预测CsAP1-A蛋白在墨兰花器官发育过程中起重要作用，这为进一步研究墨兰花器官发育分子调控机制提供理论依据。
4 结论本研究在墨兰花芽中克隆得到CsAP1-A基因，该基因编码248个氨基酸，含有MADS-box转录因子家族的MADS-box和K-box结构域。墨兰CsAP1-A与春兰和蕙兰的亲缘关系最近，且可能与MADS1、MADS6、MADS47、MADS8等蛋白具有相互作用。CsAP1-A在墨兰花中的相对表达量显著高于其他器官，且在花芽分化初期的表达量最高，并随着花朵发育而逐渐下降；在墨兰花朵不同组织部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表达量最高，其次是唇瓣、花瓣和萼片。通过对不同花型的墨兰品种转录组测序发现，CsAP1-A在WT、MPV、LaPV和NLV 4种花型的合蕊柱中表达量均最高。综上所述，CsAP1-A可能在墨兰花发育和合蕊柱形成中具有重要作用。
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(责任编辑 崔建勋)