【研究意义】原生质体是植物细胞去除细胞壁组分后的总称，在生物技术研究方面有良好的应用前景，主要用于原生质体融合、原生质体突变、原生质体转化等。因此，原生质体可广泛应用于品种改良及新品种选育等领域^[1-3]；同时，基于原生质体建立的遗传转化方法还可用于基因功能、蛋白定位等分子生物学基础研究。【前人研究进展】原生质体制备的关键在于对细胞壁的消化，不同物种的细胞壁成分存在差异，因此所用的细胞壁消化酶也不同。而影响原生质体产量和质量的因素除了酶的种类，还包括材料种类、酶解体系、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂等^[4]。不同真菌的细胞壁组成有所不同，主要由β葡聚糖、几丁质、甘露聚糖等多糖及糖蛋白组成^[5]，酶解时需要根据细胞壁的组成特点，选择合适的消化酶、消化时间、消化温度，从而获得大量优质的原生质体。成熟的遗传转化体系是开展基因功能研究的基础。目前常用的遗传转化方法主要有根癌农杆菌转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）、聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）介导的原生质体转化法、基因枪法（Biolistic）和CRISPR-Cas9转化法等^[6]。其中最常用的是ATMT法^[7-8]和PEG介导的原生质体转化法。目前，ATMT法已成功应用到多种食药用菌中，虫草真菌中也有不少报道，如蛹虫草（Cordyceps militaris）^[9]、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）^[10]、罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）^[11]、冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）^[12]等。而PEG介导的原生质体转化法在食用菌中报道较多，如香菇（Lentinula edodes）^[13-14]、灵芝（Ganoderma lucidum）^[15]、银耳（Tremella fuciformis）^[16]、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）^[17]、茶树菇（Agrocybe aegerita）^[18]、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）^[19]、金针菇（Flammulina velutipes）^[20]等，但在虫草真菌中仅有少数报道，如爪哇虫草（Cordyceps javanica）^[21]、蛹虫草^[22]等。与ATMT法相比，PEG介导的原生质体转化法具有操作更为简便的优势。在广东虫草中，郝转等^[23]采用ATMT法构建了热激蛋白40 CgDnaJ05基因沉默转化子，证实CgDnaJ05基因明显影响广东虫草菌丝生长和原基形成。但PEG介导的原生质体转化法在广东虫草中尚未报道。

【本研究切入点】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌，其营养成分丰富，活性功效显著，具有抗氧化^[24]、防治慢性肾衰竭^[25]、治疗慢性支气管炎^[26]、抗疲劳及延长动物寿命^[27]、保护禽流感病毒小鼠肺部^[28]、缓减肥胖、降血脂^[29-30]等作用。目前该虫草已实现子实体规模化栽培，在食品、保健品、医药及化妆品领域均有广阔的应用前景，因此选育高产优质新品种对促进其产业化应用具有重要意义。团队前期对广东虫草全基因组进行了测序，挖掘到部分子实体发育关键基因，如CgPro1，该基因是真菌中特有的锌指半胱氨酸结构转录因子，在多数真菌中参与有性发育过程，但其具体功能尚不清楚，而建立成熟的原生质体制备技术和相关的遗传转化体系是原生质体应用及基因功能研究的前提基础。【拟解决的关键问题】以广东虫草为材料，建立成熟的原生质体制备及PEG介导的原生质体转化法，并以广东虫草中的CgPro1基因为目的转化片段对转化系统进行验证，为广东虫草新品种选育及重要功能基因研究奠定基础。

1　材料与方法 1.1　试验材料与试剂

1.1.1 供试菌株　供试广东虫草菌株GDGM 30035，由广东省微生物研究所华南微生物资源中心提供。

1.1.2 供试培养基　PDA固体培养基：200 g土豆去皮切成1 cm³的小块，加800 mL纯水煮沸后继续煮30 min，纱布过滤，加入葡萄糖20 g，琼脂粉15 g（在转化子筛选时使用低熔点琼脂），加水定容至1 L；YMPT固体培养基：麦芽汁培养基6 g，酵母提取物6 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，低熔点琼脂粉15 g，加水定容至1 L；HPDA固体培养基：250 g黄豆芽加水煮沸后继续煮10 min，定容至400 mL，加入PDA培养基定容至1 L；TB₃固体培养基：酵母提取物3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，低熔点琼脂15 g，加水定容至1 L；0.6 mol/L KCl-PDA固体培养基：在PDA配方基础上加入KCl 44.73 g，定容至1 L；上述培养基均121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂及溶液配制　KC缓冲液：KCl 13.42 g，CaCl₂ 1.665 g，加去离子水定容至300 mL。亚精胺溶液：配制500 mmol/L的亚精胺母液，用直径0.22 μm的细菌过滤器过滤备用。PEG4000溶液（现配现用）：称取PEG4000 0.25 g，加入10 mmol/mL Tris-HCl 500 μL、50 mmol/mL CaCl₂ 500 μL，搅拌溶解后，用直径0.22 μm的无菌滤器过滤备用。裂解酶、崩溃酶购于Sigma-Aldrich.Inc公司（货号L1412、85186-71-6）；溶壁酶、蜗牛酶购于上海源叶生物科技有限公司（货号S1010⁷、S10083）。

1.2　广东虫草原生质体制备最佳条件筛选

将广东虫草菌株接种至YMPT液体培养基中，120 r/min、24 ℃摇床培养12 d，获得广东虫草菌丝体（菌球）。分别称取0.5 g菌球，用KC缓冲液清洗后，置于六孔板中，用于后续试验分析，试验重复3次。

1.2.1 菌丝最佳酶解体系筛选　分别在每10 mL KC缓冲液中加入裂解酶、裂解酶+ 蜗牛酶、裂解酶+ 崩溃酶、溶壁酶、溶壁酶+蜗牛酶、溶壁酶+崩溃酶各0.15 g（混合酶按1∶1比例加入），制成6种酶液，用直径0.22 μm细菌过滤器过滤后备用。往盛有菌球的孔板中每孔加入5 mL不同的酶液，酶解4.5 h后镜检并使用血球计数板计算原生质体数量。

1.2.2 广东虫草菌丝最佳酶解时间筛选　往盛有菌球的孔板中加入5 mL最佳酶液后，从第3.5 h开始镜检（前期试验发现前3.5 h酶解效果较差，原生质体释放极少），并使用血球计数板计算原生质体数量，每1 h取样计数1次。

1.2.3 广东虫草菌丝最佳酶解温度筛选　往盛有菌球的孔板中加入5 mL最佳酶液后，分别将孔板置于24 ℃、28 ℃、32 ℃，100 r/min酶解5.5 h，镜检并使用血球计数板计算原生质体数量。

1.3　广东虫草原生质体最佳复苏培养基及潮霉素抗性浓度筛选

将获得的原生质体用KC缓冲液悬浮，调整其浓度为10⁷个/mL备用。分别吸取200 μL原生质体悬浮液混入15 mL低熔点PDA、HPDA、0.6 mol/L KCl-PDA、TB₃、YMPT培养基，置于24 ℃下恒温培养；分别吸取200 μL原生质体加入到含有不同潮霉素浓度的低熔点TB₃培养基中，潮霉素浓度梯度为0、150、200、250、300 μg/mL，置于24 ℃下恒温培养。每个处理3次重复，观察原生质体复苏情况。

1.4　潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300及CgPro1基因敲除转化片段准备

将含潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300的菌液于LB平板上划线培养，挑取单菌落接种于新的LB培养基中，摇瓶过夜培养。收集菌液，采用Takara质粒提取试剂盒进行质粒提取，检测浓度，采用KpnI内切酶将质粒进行单酶切线性化，回收，使其终浓度达到200 ~ 300 ng/μL备用。

PCR扩增CgPro1上下游1 kb左右同源臂，采用融合PCR将同源臂分别与潮霉素抗性标记基因片段连接，获得转化片段，PCR扩增连接后的全长转化DNA片段，回收，克隆到大肠杆菌感受态细胞中测序验证（引物见表 1）。

1.5　PEG介导的原生质体转化过程优化

取质粒转化DNA片段100 μL，加入亚精胺溶液（终浓度设置为2、5、7 mmol/L 3个不同梯度），混匀后，加入200 μL广东虫草原生质体，轻轻混匀后，冰浴10 min。室温条件下，在广东虫草原生质体与目的基因转化DNA片段混合液中，分3次分别加入100、200、500 μL的25% 体积分数的PEG4000溶液（设置5、10、15 min 3个不同的加入时间间隔），轻轻混匀后，将混合液全部加入到TB₃再生培养基中，倒板，25 ℃恒温培养。TB₃再生培养基培养一定天数后（设置不同时间间隔1、2、3、4、5 d），平板中再倒1层含有250 μg/mL潮霉素抗性标记的PDA培养基，继续培养。待转化子长到上层板后，挑取单个转化子于新的含有潮霉素抗性标记的PDA平板中，传代培养3代，获得稳定的转化子。

1.6　转化子鉴定及表型分析

提取pCAMBIA1300质粒转化子DNA，PCR检测潮霉素抗性基因片段；提取转化子RNA，RT-PCR检测潮霉素抗性基因片段的表达情况，确认潮霉素基因插入到转化子中并正确表达。提取广东虫草锌指结构转录因子CgPro1敲除突变株DNA及RNA，检测CgPro1基因片段的存在及表达情况，并参照广东虫草子实体栽培方法对突变株进行子实体栽培表型分析^[31-32]。

1.7　统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan多重比较法对数据结果进行显著性分析。

2　结果与分析 2.1　酶解组合对广东虫草原生质体释放的影响

在其他酶解条件相同的前提下，不同酶解组合对广东虫草原生质体释放的影响如图 1所示。使用裂解酶+ 崩溃酶的组合获得的原生质体最多（7.54×10⁶个/mL），且菌丝的裂解程度最高；单独使用裂解酶的效果次之；而溶壁酶及其混合酶体系对广东虫草菌丝酶解能力均较弱。因此认为裂解酶+ 崩溃酶是最佳的混合酶体系，后续试验中均使用该组合。

2.2　酶解时间对广东虫草原生质体释放的影响

由图 2可知，裂解3.5~5.5 h广东虫草菌丝有较少量的原生质体释放，在5.5 h原生质体的增长最多，浓度为1.77×10⁷个/mL，几乎翻倍增长；5.5 h后还有持续增长，后续研究发现广东虫草原生质体在22.5 h后仍存活，镜检无破裂现象。为方便试验进行，后续酶解温度筛选以5.5 h作为取样点。

2.3　酶解温度对广东虫草原生质体释放的影响

广东虫草菌丝体在裂解酶+ 崩溃酶作用下，裂解5.5 h时，不同酶解温度下原生质体释放情况如图 3所示。当酶解温度为28 ℃时，菌丝裂解获得的原生质体数量最多、达4.53×10⁷个/mL，酶解温度为32 ℃时，酶解获得的原生质体数量相对较少，而酶解温度为24 ℃时，酶解获得的原生质体数量最少。

2.4　广东虫草原生质体复苏培养基及潮霉素抗性浓度筛选

原生质体复苏需要不同的营养条件，本研究发现广东虫草的原生质体在高渗的TB₃复苏培养基中复苏效率最高（图 4），新长出的菌落几乎布满整个培养皿，0.6 mol/L KCl-PDA次之；而非高渗的培养基PDA、HPDA、YMPT的复苏效果均较差，只有较稀疏的单菌落长出，说明TB₃培养基最适合广东虫草原生质体复苏。

潮霉素抗性浓度筛选试验发现，当潮霉素浓度为0~200 μg/mL时，随浓度的升高，菌落数减少，在浓度为250 μg/mL时已无菌落生长（图 5），因此将250 μg/mL作为最佳潮霉素抗性浓度，并以此浓度后期筛选转化子。

2.5　PEG介导的原生质体转化体系建立及优化

按照上述转化方法，筛选了亚精胺浓度、加入PEG4000的间隔时间、TB₃再生培养基添加潮霉素抗性标记上层板的间隔时间对转化效率的影响。结果（表 2）显示，亚精胺的终浓度为5 mmol/L、加入PEG4000的间隔时间为10 min、TB₃再生培养基添加潮霉素抗性标记上层板的间隔时间为3 d时，转化子筛选效率最高。

2.6　转化子鉴定及转化系统验证

通过潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300建立了广东虫草原生质体转化体系，并获得多个转化子，且转化子在含有潮霉素的培养基上稳定生长。潮霉素基因检测结果显示，转化子中潮霉素基因稳定存在且正常表达（图 6）。同时以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1敲除片段为目的转化片段，对转化系统进行了验证。以广东虫草DNA为模板，通过PCR扩增获得锌指结构转录因子CgPro1上游同源臂、潮霉素表达框、下游同源臂分别为925、2 221、1 077 bp。最终获得融合转化片段长度为4 223 bp（图 7）。将转化片段克隆到大肠杆菌中，挑取克隆子提取质粒进行测序验证，序列正确，证明转化片段构建成功。通过上述转化系统，本研究成功获得了3个CgPro1敲除突变株及3个杂合子，子实体栽培比较试验结果（图 8）显示，广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1也参与其子实体发育过程。

3　讨论

原生质体的制备在多种食药用真菌中得到了广泛研究^[33-34]，但不同真菌原生质体制备所用酶类、酶解温度、时间等均存在差异。在虫草真菌中，不同物种原生质体制备的最佳酶类组合也有所不同。如在冬虫夏草中，采用2% 溶壁酶和1% 蜗牛酶组合于32 ℃条件下酶解2 h可获得较多的原生质体^[35]；采用4 mg/mL和3 mg/mL的Yatalase和Glucanex酶组合酶解3 h也可以获得较多的冬虫夏草原生质体^[36-37]；采用0.5% 的裂解酶于30 ℃条件下酶解2 h可获得质量较好的原生质体^[38]。在蛹虫草中，1% 的蜗牛酶和0.5% 的纤维素酶组合于35 ℃条件下酶解3 h^[39]、或1.5% 的蜗牛酶和1.5 % 的溶壁酶组合于34 ℃条件下酶解4 h可获得较多的原生质体^[40]。采用2.06% 的溶壁酶于26.1 ℃条件下对单核蛹虫草芽生孢子酶解2.57 h以及2.5% 的溶壁酶于24 ℃条件下对蛹虫草芽生孢子酶解2.5 h均可获得数量较多的原生质体^[41]；高雄山虫草的无性型细脚拟青霉细胞壁用1 % 的溶壁酶在30 ℃条件下酶解2.5 h可获得较多原生质体^[42]；而古尼虫草小孢变种上分离的无性型古尼拟青霉小孢变种原生质体产量较高的细胞壁消化条件为0.5% 的溶壁酶和0.5 % 的蜗牛酶的混合酶液于28 ℃条件下酶解时间1.5~2 h^[43]。由本研究结果也可明显看出，酶的种类、酶解温度、及酶解时间显著影响广东虫草原生质体的释放和数量，广东虫草中原生质体得量最多的细胞壁消化条件为1∶1的裂解酶和崩溃酶组合于28 ℃条件下酶解5.5 h。上述差异现象说明真菌原生质体的制备不仅与真菌细胞壁结果和组成有关，也与所用酶的来源有关，不同真菌制备的酶，其活力也存在差异。真菌细胞壁的组分较为复杂，不同真菌细胞壁的结构和组分均存在差异^[44]，因此原生质体制备的最佳酶类组合也有所不同。影响原生质制备的关键因素是细胞壁溶解酶，活性好且适宜的酶可使菌丝细胞壁降解更充分、释放出更多的原生质体。本研究中，采用裂解酶和崩溃酶的组合对广东虫草菌丝酶解的效果最佳，获得的原生质体数量最多，且菌丝裂解最完全，这可能与广东虫草细胞壁成分有关。崩溃酶是一类含有昆布多糖酶、木聚糖酶及纤维素酶的复合酶，广泛应用于多种植物病原真菌的原生质体制备^[45]；而来自哈茨木霉的裂解酶则具有蛋白酶、几丁质酶及纤维素酶等活性，在子囊菌的原生质体制备中效果较好^[46]。

酶解时间和酶解温度都是影响原生质体释放的因素。酶解时间不足时原生质体得不到充分释放，而酶解过久则会使已裂解出来的原生质体破裂，影响其质量及数量。一般而言，真菌菌丝在一定酶解时间内，原生质体数量会随着时间的延长而增加，但随着反应时间的延长，分离的原生质体数量转为缓慢增加，在达到一定时间后其数量开始下降^[36]。酶解时间因真菌而异，在试验中发现广东虫草原生质体的酶解时间比许多真菌都要长，甚至在22.5 h后依然有继续增加，而且其形态保持完好。酶解温度可以直接影响到酶促反应的速度，真菌脱壁酶的温度一般在24~35 ℃之间^[47]，而广东虫草菌丝的最佳酶解温度为28 ℃，此时脱壁最快。原生质体的再生与原生质体的制备同样重要，需要寻找合适的再生培养基。原生质体由于缺乏细胞壁的支撑显得相当脆弱，高渗的复苏培养基有助于维持质膜系统渗透压，对原生质体起保护作用^[4]。而不同真菌原生质体所适合的复苏培养基也有所差异。通常情况下，学者很少对再生培养基进行筛选，多用常规培养基或改良的常规培养基作为再生培养基，如冬虫夏草中所用的再生培养基为常规培养基添加不同的渗稳剂^[35]；蛹虫草常使用PDA培养基作为再生培养基^[40]等。陈晓琳等^[43]对古尼虫草小孢变种上分离的无性型古尼拟青霉小孢变种原生质体在0.6 mol/L氯化钠的SDAY培养基上再生率最高。本研究比较了培养基对广东虫草原生质体再生的影响，结果显示高渗的TB₃培养基效果最佳，其次为高渗的0.6 mol/mL-KCl PDA培养基。由此可见，原生质体的再生不仅与培养基营养有关，同时还与培养基中的渗透稳定剂有关。

PEG介导的原生质体转化广泛应用于真菌中，但在虫草真菌中应用相对较少。PEG介导的原生质体转化过程大致相同，只是不同的真菌所用的渗透稳定剂、PEG规格、再生培养基类型、抗性标记及浓度有所差异。如蛹虫草常用甘露醇作为渗透稳定剂^[40]，而本研究中广东虫草采用KC溶液作为渗透稳定剂；真菌中常采用PEG4000作为转化媒介，而少数真菌中也有采用PEG8000作为转化媒介的^[48]。不同真菌对抗生素的抗性存在显著差异，抗性标记的选择对于遗传转化过程中转化子的筛选至关重要。目前虫草真菌中常用的抗性标记可分为药物抗性筛选和营养缺陷型筛选，本研究采用的是药物抗性筛选中的潮霉素抗性筛选。潮霉素磷酸转移酶基因产物的作用底物潮霉素B（Hygromycin B），是一种氨基糖苷类抗生素，可通过破坏核糖体的功能，导致基因的翻译受阻，使蛋白质合成受到抑制，而潮霉素磷酸转移酶可使受体菌产生潮霉素抗性，使转化子能正常生长。多数真菌对潮霉素B有更高的敏感性，在浓度50~400 μg/mL的范围内可以抑制大多数真核微生物的生长^[49]。但不同真菌对潮霉素的抗性能力存在差异，如蛹虫草对潮霉素的抗性能力较强，通常采用650 mg/L的浓度进行筛选^[40]，而本研究结果显示广东虫草对潮霉素的抗性能力较弱，培养基中添加250 mg/L潮霉素时，再生原生质体不能正常生长。

4　结论

本研究建立和优化了珍稀虫草真菌广东虫草的原生质体制备及PEG介导的转化方法。广东虫草菌丝在裂解酶+ 崩溃酶（1∶1）中酶解效果最佳、获得原生质体数量最多，酶解时间为5.5 h时原生质体数量增长最多，但随后仍有增加；广东虫草原生质体最佳酶解温度为28 ℃、最佳复苏培养基为TB₃、潮霉素抗性浓度为250 μg/mL。转化过程中所用亚精胺浓度为5 mmol/L、加入PEG4000的间隔时间为10 min、TB₃再生培养基添加潮霉素抗性标记上层板的间隔时间为3 d时，转化子筛选效率最高。通过该转化系统，成功获得广东虫草中锌指半胱氨酸转录因子CgPro1的敲除突变株及杂合子，并通过与野生型菌株比较，发现CgPro1参与广东虫草子实体发育过程。