【研究意义】烤烟叶片作为中式卷烟的重要原料，其质量状况直接影响工业可用性。“生态决定特色，品种彰显特色，栽培保障特色”的生产观念已深入人心，因地制宜地选用烤烟品种是破解生产难题、彰显风格特色、提升烟叶质量的重要手段^[1-3]。不同烤烟品种在基因与产区环境互作下，烤后烟叶表现出不同的内在品质，其中中部烟叶品质是评价烤烟品种可用性的重要因素之一，叶片成熟过程是叶片品质形成最关键的时期，而氮代谢强度影响着烤烟叶片各种内含物质的含量和比例，类胡萝卜素也是烟叶重要致香前体物质之一^[4-6]，探究烤烟中部叶关键生育时期的氮代谢和类胡萝卜素代谢对解析品种间差异和优化配套栽培措施具有重要意义。【前人研究进展】硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NIR）、谷氨酰胺合成酶（GS）是烟草氮代谢关键限速酶，参与烟株氮素吸收、同化和利用^[7]。八氢番茄红素合成酶（PSY）催化2分子的牻牛儿牻牛儿基焦磷酸形成无色的八氢番茄红素。后者在八氢番茄红素脱氢酶（PDS）、ζ- 胡萝卜素脱氢酶（ZDS）和类胡萝卜素异构酶（CRTISO）的作用下形成红色的番茄红素。番茄红素经番茄红素β- 环化酶（LCYB）和番茄红素ε- 环化酶（LCYE）催化环化，形成2个β环的β- 胡萝卜素和α- 胡萝卜素，这是类胡萝卜素合成途径中的关键分支点^[8-10]。张小全等^[11]研究得出，叶片成熟速度快的品种存在氮同化相关的GS、谷氨酸脱氢酶（GDH）和NR基因表达量较低，总氮和类胡萝卜素含量也相对较低的特征。张玲等^[12]研究发现不同烤烟品种生育期内NR活性整体趋势相近，烟叶品质表现较好的毕纳一号在叶龄30 d和50 d时NR活性最高。张生杰等^[13]研究发现不同基因型烤烟叶片NR活性达到极显著差异，其中豫烟5号等品种色素含量、NR活性均较高。杨虹琦等^[14]认为类胡萝卜素含量较高时烟叶的香气质和香气量较好；过伟民等^[15]以我国不同产区烟叶为原料，发现类胡萝卜素含量在102.87~133.29 μg/g范围时烟叶的香气品质较好。【本研究切入点】以上研究主要是基于特定生态条件下的试验结果，不同品种在不同生育时期内氮代谢及相关基因表达情况存在差异^[16-18]，不同品种适宜的类胡萝卜素含量仍存在争议，探究氮代谢与类胡萝卜素的关系，促进烟株营养均衡、进而彰显不同品种烤后烟质量优势对烟区可持续发展具有重要意义。关于氮代谢和类胡萝卜素代谢之间关系的研究报道较少，杨志晓等^[19]比较了红花大金元和K326在大田生育期内碳氮代谢关键酶与类胡萝卜素的关系，发现蔗糖转化酶活性与类胡萝卜素各组分含量呈显著负相关，但尚不清楚基因表达间的相关性。【拟解决的关键问题】与江西主栽品种云烟87相比，闽烟312有效叶数多2~3片，中上部叶面积与之相当，香气质和香气量更好；闽烟12号上部叶耐熟性更好，香气质和香气量较好。本研究基于江西代表性烟区生态条件，通过比较感官评吸质量表现较好的闽烟312、闽烟12号，与常规主栽品种云烟87之间氮代谢和类胡萝卜素代谢相关的物质组分及基因表达差异，挖掘各品种相关生理个性和共性特征，分析氮代谢与类胡萝卜代谢之间的相关性，为各品种在不同生态条件下的合理利用及优质烟叶生产技术优化提供依据。

1　材料与方法 1.1　试验材料

试验于2022年在江西省吉安市峡江县开展。以烤烟品种闽烟312、闽烟12号、云烟87（CK）为试验材料，统一于3月13日完成移栽，每667 m²施氮量9.5 kg，供试土壤为砂壤土，pH 5.3，有机质含量19.3 g/kg，速效氮含量91.3 mg/kg，速效磷含量24.8 mg/kg，速效钾含量99.4 mg/kg，无严重病虫害发生。试验材料种子由江西省烟草科学研究所提供。

1.2　试验方法

1.2.1 材料种植及取样　采用随机区组设计，设3次重复，每份材料种植120株，行株距1.20 m×0.50 m，分别在旺长期（5月5日）、现蕾期（5月16日）、脚叶成熟期（5月27日）、腰叶成熟期（6月8日）选取每个小区代表性烟株3株，取第12叶位叶片中间部位混合后于液氮中快速冷冻，置于-80℃冰箱保存备用，剩余叶片去除主脉后利用冷冻真空干燥机（购自MARTIN CHRIST公司，德国）进行冷冻干燥处理。期间大田管理统一按照当地优质烟叶生产技术方案执行。

1.2.2 类胡萝卜素和常规化学成分含量测定　烟叶样品利用高效液相色谱仪（购自AGILENT公司，美国）按照YC/T382-2010方法测定类胡萝卜素含量，使用连续流动分析仪（购自SKALAR公司，荷兰）按照YC/T161-2002和YC/T468-2013方法测定总氮和烟碱含量，利用凯氏定氮仪（购自BUCHI公司，瑞士）按照YC/T249-2008方法测定蛋白质含量。

1.2.3 基因表达量检测　取适量冷冻烟叶在研钵中用液氮研磨至组织发白，并迅速转移至1.5 mL离心管，用Eastep Super总RNA提取试剂盒（购自PROMEGA公司，美国）提取RNA。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（购自TAKARA公司，美国）合成第1链cDNA作为模板，所用特异性引物（表 1）由Thermo Fisher Scientific公司（美国）合成，利用SYBR Premix Ex Taq荧光定量试剂盒（购自TAKARA公司，美国）在qTower3G荧光定量PCR仪（购自耶拿公司，德国）上进行反应，目的基因相对表达量按照2^-ΔΔCT的方法计算^[20]。

1.3　数据处理

利用Excel 2016分析试验数据、绘制图形，利用DPS数据处理系统软件进行方差分析，并以3个品种的基因表达量、类胡萝卜素组分含量为单位开展氮代谢与类胡萝卜素代谢相关性分析。

2　结果与分析 2.1　各生育期不同品种烤烟的类胡萝卜素含量分析

类胡萝卜素主要由叶黄素和β- 胡萝卜素组成^[21]，不同品种各生育期内类胡萝卜素主要成分含量见表 2。闽烟312和闽烟12号中部叶类胡萝卜素各组分含量随叶片发育呈逐渐降低趋势，而云烟87则呈先升高后降低的变化趋势。在旺长期，3个品种中部叶类胡萝卜素总量在8.28~9.00 mg/g之间，品种间无显著差异，但闽烟312的β- 胡萝卜素含量高出闽烟12号14.69%，差异显著；在现蕾期和脚叶成熟期，闽烟312和闽烟12号中部叶类胡萝卜素总量分别为7.40~7.72 mg/g和3.59~3.98 mg/g，其总量和各组分含量均无显著差异，但均极显著低于云烟87；在腰叶成熟期，闽烟12号中部叶叶黄素和β-胡萝卜素含量最高，分别高出云烟87 20.56% 和18.37%。由此可见，3个品种中部叶类胡萝卜素含量差异主要发生在烟株成熟期，且闽烟12号中部叶成熟时类胡萝卜素含量较高。

2.2　各生育期不同品种烤烟的类胡萝卜素合成相关基因表达量分析

不同烤烟品种类胡萝卜素合成相关基因表达量在不同生育期存在差异（图 1）。3个品种中部叶PSY基因表达量随叶片发育逐渐降低，在旺长期和脚叶成熟期PSY基因表达量表现为闽烟312 > 闽烟12号 > 云烟87，其中闽烟312基因表达量较云烟87分别提高76.44% 和136.77%。闽烟312和闽烟12号中部叶CRTISO基因表达量随叶片发育呈逐渐降低的变化趋势，而云烟87中CRTISO基因表达量先升高后降低，且在腰叶成熟期之前闽烟12号中部叶CRTISO基因相对表达量均较高，较云烟87平均提高77.77%。闽烟12号和云烟87的LCYB基因表达量随叶片发育整体呈现逐渐降低的变化趋势，在旺长期至脚叶成熟期中部叶LCYB基因表达量表现为闽烟312＞闽烟12号＞云烟87，而在腰叶成熟期云烟87中部叶LCYB基因表达量最高，分别高出闽烟312和闽烟12号71.70%、71.23%。闽烟312中部叶LCYE基因表达量随叶片发育逐渐降低，且在旺长期至现蕾期基因表达量显著较高，脚叶成熟期最低、仅为云烟87的49.40%。综合来看，3个品种中部叶类胡萝卜素合成相关基因的表达量高峰主要发生在旺长期和现蕾期，基因表达量随叶片发育整体呈现逐渐降低或先升高后降低的趋势，在腰叶成熟期前闽烟312和闽烟12号中部叶类胡萝卜素合成相关基因表达量相对较高。

2.3　各生育期不同品种烤烟的总氮和主要含氮化合物含量分析

各生育期不同品种总氮和主要含氮化合物含量见表 3。3个品种中部叶总氮和蛋白质含量变化趋势一致，表现为随叶片发育逐渐降低，而烟碱含量随叶片发育逐渐升高。在旺长期，闽烟312中部叶总氮和蛋白质含量较低，分别为云烟87的75.96% 和79.66%，闽烟12号中部叶烟碱含量为0.35%，极显著低于云烟87。在现蕾期和脚叶成熟期，闽烟312和闽烟12号中部叶总氮和蛋白质含量无显著差异，且极显著低于云烟87、为云烟87的50.61%~78.83%，其中闽烟312中部叶烟碱含量在现蕾期仅为云烟87的80.30%。在腰叶成熟期，3个品种中部叶总氮含量无显著差异，闽烟12号烟碱含量明显较低，闽烟312蛋白质含量明显较低，分别为闽烟12号和云烟87的85.04%、89.50%。

2.4　各生育期不同品种烤烟的氮代谢相关基因表达量分析

烟草中的NR是氮代谢的第一个关键酶和限速酶，主要作用是将NO₃^-还原成NO₂^-[22]。由 图 2可知，闽烟312和云烟87中部叶NR基因表达量随叶片发育呈先升高后降低的变化趋势，其中闽烟312中部叶在腰叶成熟期前NR基因表达量是云烟87的1.30~1.86倍，闽烟312和云烟87中部叶NR基因表达量在脚叶成熟期达最大值。NIR1将NO₂^-还原为NH₄^+[23]，3个品种NIR1基因表达量均随叶片发育逐渐降低，其中闽烟312 NIR1基因表达量最高，较云烟87平均提高76.6%。GS1-5催化NH₄⁺合成谷氨酰胺^[24-25]，3个品种中部叶GS1-5基因表达量变化随叶片发育存在一定波动，闽烟312和闽烟12号GS1-5基因表达量在腰叶成熟期之前高于云烟87、在腰叶成熟期低于云烟87。综合来看，不同品种间氮代谢相关基因表达存在较大差异，可能与品种对环境的适应性相关，同时反映出不同品种的氮代谢特性。

2.5　烤烟氮代谢与类胡萝卜素代谢相关性分析

由表 4可知，烤烟氮代谢和类胡萝卜素代谢相关物质组分和基因间存在显著或极显著相关性。氮代谢相关的NIR1和GS1-5基因与类胡萝卜素合成相关的PSY和LCYE存在极显著正相关，总氮、蛋白质含量与PSY和叶黄素、β- 胡萝卜素含量存在极显著正相关，烟碱与CRTISO、LCYB、叶黄素含量、β- 胡萝卜素含量存在极显著负相关。

3　讨论

烟草从移栽到成熟阶段被划分为多个生育期，中部叶在旺长期开始发生，到腰叶成熟期采收，其间包括烟株现蕾期、打顶期、脚叶成熟期等，且在不同生育期需要采取不同的栽培技术措施调控烟株生长，因此按照生育期分析中部叶生长发育特征更利于揭示烟株生长状况，指导改进该时期的栽培技术。类胡萝卜素是烟叶致香前体物质之一，其降解产物的含量和协调性直接影响烤烟香气风格和香气特征^[26-27]。不同品种烤烟在基因与环境的互作下，表现出叶片生长发育过程中表型和内含物质的差异。本研究表明，在江西生态条件下，闽烟312、闽烟12号中部叶叶黄素、β- 胡萝卜素含量在现蕾期至脚叶成熟期极显著低于云烟87，而PSY等类胡萝卜素合成相关基因表达量整体高于云烟87，这种差异可能主要来源于叶片发育进程的不同，即闽烟312和闽烟12号田间早生快发优势明显，叶片发育进程较一致，而云烟87表现出与李峥等^[28]研究的结果较一致，烟株早生快发和后发均可导致品种间旺盛生长期中部叶片差异，进而可能成为影响中部叶类胡萝卜素和常规化学成分相对含量的主要因素。闽烟312和闽烟12号中部叶叶黄素含量在成熟时均极显著高于云烟87，可能采烤前较高的叶黄素含量更有利于改善烟叶品质，这需要进一步增加品种数量加以验证研究。

氮代谢是烤烟植株生长的最基本、最重要的代谢之一，含氮化合物在决定烟草品质方面起着重要作用^[29]。氮代谢相关基因中NR、NIR1参与氮素的吸收同化，GS1-5参与氮素的转移利用^[30]。闽烟312和闽烟12号中部叶在腰叶成熟期之前NR、NIR1、GS1-5基因表达量均较高，而在腰叶成熟期NR、NIR1基因表达量高于或与云烟87相当，GS1-5基因表达量低于云烟87，表明闽烟312和闽烟12号中部叶在成熟前氮代谢旺盛，而在成熟后期存在氮素转移能力下降的情况，这种基因表达特征与落黄较快品种豫烟10号相反^[11]，这可能是闽烟312和闽烟12号大田后期较云烟87更耐熟的重要原因，减弱江西烟区后期高温胁迫影响，延长叶片干物质积累时间，以致烤烟表现出较好的外观质量和内在品质^[31]。云烟87中部叶在腰叶成熟期前氮素吸收同化利用能力相对较低，腰叶成熟期氮素同化能力较弱、氮素转移能力较强，从一定程度上解释了云烟87中部叶生长发育较慢、大田后期不耐熟的原因；基于高琴等^[32]得出的“高氮处理下烟叶硝酸还原酶活性下降时间推迟”的研究结果，可采取施用秸秆菜饼有机肥^[33]或有机无机复混肥^[34]促进烟株早生快发、优化基追肥比例^[35]等措施促进烟株生长后期的碳氮代谢平衡。

由氮代谢和类胡萝卜素代谢相关物质组分含量和基因表达量相关分析结果可知，NIR1、GS1-5基因与类胡萝卜素合成相关基因及叶黄素含量、β-胡萝卜素含量存在显著或极显著正相关性，说明烤烟较强的氮素同化利用能力有利于促进类胡萝卜素合成相关基因的表达，提升叶片类胡萝卜素积累量。烟碱与PSY、CRTISO、LCYB、叶黄素含量、β-胡萝卜素含量呈显著或极显著负相关，表明叶片中烟碱的积累会限制类胡萝卜素含量的增加。本研究结果表明氮代谢与类胡萝卜素代谢之间存在显著相关性。今后可增加品种数量，进一步分析在每个生育期氮代谢与类胡萝卜素代谢之间紧密关联的基因特征。

4　结论

3个品种的氮代谢和类胡萝卜素代谢差异主要发生在旺长期至脚叶成熟期，闽烟312和闽烟12号物质组分含量和生理代谢特征相近，与云烟87存在较大差异。闽烟312和闽烟12号成熟期前NR、PSY等氮代谢和类胡萝卜素代谢相关基因活性是云烟87的0.73~6.28倍，较云烟87基因表达量平均提高60.26%，而相关物质组分含量平均仅为云烟87的78.09%。其中，闽烟12号在成熟后期NR基因活性较高，氮代谢相关基因GS与叶黄素、β- 类胡萝卜素含量及其基因间存在显著或极显著相关性。本研究进一步阐明了闽烟312和闽烟12号在以江西烟区为代表的东南烟区生态条件下良好适应性的氮代谢特征，指出了烟叶生产中促进烟株早生快发、后期碳氮代谢平衡的重要性，为各品种在不同生态条件下的合理利用及优质烟叶生产技术优化提供依据。