【研究意义】七彩神仙鱼（Symphysodon aequifasciatus）隶属于盘丽鱼属，原产自亚马逊河流域，其体色艳丽，具有极高的观赏价值，因此被誉为“观赏鱼之王” ^[1-2]。七彩神仙鱼具有特殊的亲代抚育行为，可利用皮肤细胞分泌粘液喂养子代长达1个月，在行为模式上与哺乳相似^[1-5]。亲代抚育行为的发生涉及大脑^[6]到生殖器官^[7]多层次生理变化，下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴对其具有重要影响^[8-9]。探究催乳素（Prolactin, PRL）在七彩神仙鱼亲代抚育行为发生中的潜在功能具有重要意义。【前人研究进展】PRL是一种主要由垂体前叶泌乳细胞合成和分泌的多肽激素^[10]，通过与催乳素受体（Prolactin receptor, PRLR）结合来发挥其作用。最初因PRL能诱导鸽子分泌乳汁而被鉴定，随后因其在哺乳动物中能够刺激乳腺分泌乳汁而被命名^[11]。PRL在脊椎动物（包括鸟类、哺乳动物和鱼类^[12-15]）的亲代行为中起重要作用，参与渗透调节、哺乳、繁殖、发育和生长、内分泌和代谢、免疫调节等生命活动^[14,16-24]。在鸟类中，PRL是鸟类亲代行为发生和维持的基础^[17,25]；在鱼类中，PRL和雌激素共同促进慈鲷鱼类口孵行为的发生^[26]。外源注射PRL可增加叉尾斗鱼（Macropodus opercularis）粘液分泌量，并刺激粘液细胞的增殖，促进筑巢行为^[27-28]。对蓝鳃太阳鱼（Lepomis macrochirus）和三刺棘鱼（Gasterosteus aculeatus）进行PRL抑制后，亲鱼巢扇行为明显减少^[29-30]。雄性蓝鳃太阳鱼经PRL抑制剂处理后，对捕食者的攻击性减少，对仔鱼的保护和防御行为减少^[30]。注射PRL后的七彩神仙鱼亲鱼抚育行为增加，推测PRL可能在七彩神仙鱼亲代抚育行为中起作用^[31]。【本研究切入点】包括PRL在内的多种循环激素能够促进亲代抚育行为的发生，但相关研究主要集中在哺乳动物和鸟类，对PRL在鱼类亲代抚育行为中的作用研究较少。【拟解决的关键问题】本研究从七彩神仙鱼中鉴定并克隆PRL基因，命名为dfprl，分析其在不同抚育阶段七彩神仙鱼的脑、性腺和皮肤组织中的表达，并在皮肤组织中对dfprl基因及其受体基因（dfprlr）进行双探针原位杂交，揭示dfprl在七彩神仙鱼亲代抚育中的潜在功能，为提高七彩神仙鱼人工繁育效率提供科学依据。

1　材料与方法 1.1　试验材料

供试的七彩神仙鱼由上海海洋大学滨海养殖基地提供，经上海海洋大学动物护理和使用委员会批准（SHOU-DW-2021-026）后使用。挑选非繁殖期（NB）、产卵期（S）、抚育1 d（P1）、抚育7 d（P7）、非抚育期（NP）等不同繁殖阶段（表 1）的七彩神仙鱼各3对，实验用鱼形体健康、规格一致（体长11.0±1.5 cm），保持养殖条件相同（28.0±0.5 ℃，pH 7.8±0.5，DO＞6.0 mg/L）。

1.2　试验方法

1.2.1 样品采集　于2022年8—9月在上海海洋大学滨海养殖基地进行七彩神仙鱼养殖试验，在养殖过程中分别采集上述5个时期共15对七彩神仙鱼的脑、性腺和皮肤组织（亲鱼进入不同繁殖阶段的第1天上午10:00取样），置于无酶管中，在液氮中冷冻，-80 ℃下保存，用于转录组测序分析。另采集皮肤组织置于15 mL装满原位杂交固定液的无酶管中，4 ℃下保存备用。

1.2.2 总RNA提取和cDNA合成　使用TRIzol 〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕提取各组织中的总RNA，经NanoPhotometer和NanoDrop评估，每个样品的总RNA量为1 μg，完整性数＞7.0。选取光密度OD_260/280为1.8~2.2的样品等量混合，通过1% MOPs琼脂糖凝胶进行电泳以及微量核酸蛋白测定仪进行定性和定量检测。使用DNase Ⅰ（上海碧云天生物技术有限公司）去除RNA中残留的DNA，以1 μg总RNA为模板反转录成cDNA，将cDNA保存于-20 ℃下。

1.2.3 基因筛选和序列验证　采用七彩神仙鱼全基因组数据（GenBank登录号：PRJNA863920），以Ensembl数据库下载的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和人类（Homo sapiens）的PRL蛋白为参考序列，通过BLASTP（2.9.0）（E＜0.001）对七彩神仙鱼全基因组进行比对^[32-33]。为确认PLR存在1个或多个结构域，使用PFAM和SMART对所有基于BLASTP的候选序列进一步筛选。将两种方法获得的基因剔除冗余，从七彩神仙鱼基因组中鉴定出PRL基因，命名为dfprl。

选取dfprl基因的CDS区，使用Primer Premier 5.0设计PCR引物（表 2），由上海生工生物工程股份有限公司合成。以七彩神仙鱼皮肤cDNA作为模板，使用C1000 Touch™ PCR仪（Bio-Rad，美国）对dfprl进行PCR扩增。反应体系25 μL：Mix（TSE101）22 μL、cDNA 1 μL、dfprl-O-F 1 μL、dfprl-O-R 1 μL。反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s，10个循环；98 ℃ 10 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s，25个循环；72 ℃ 1 min。产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，胶回收后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.2.4 dfprl基因的3'-RACE和5'-RACE克隆　根据dfprl基因的CDS区，使用Primer Premier 5.0设计3'-RACE特异性巢式引物、5'-RACE特异性巢式引物和5'-RACE特异性反转录引物（表 2）。分别使用3'-RACE Kit、5'-RACE Kit〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕对dfprl基因3' 末端、5' 末端进行扩增。

1.2.5 生物信息学分析　使用NCBI的ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找dfprl基因的ORF区，获得相应的氨基酸序列。通过在线软件ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/computepi/）预测dfprl的氨基酸数、分子量、等电点和亲水性等信息。由SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM）预测信号肽和跨膜结构域。运用SOPMA（https://npsa-pbil.ibcp.fr/）和SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质结构预测。利用MEGA 11采用邻接法（参数为：Poisson correction、Pairwise deletion、Bootstrap 1000）构建系统发育树^[32,34-36]。

1.2.6 转录组分析　以样品cDNA为模板、β-actin为内参基因（表 2），利用qRT-PCR验证转录组数据的可信性^[35,37]。反应体系：cDNA 1.6 μL，引物β-actin-q-S和β-actin-q-A各0.8 μL，ddH₂O 6.8 μL，2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL。反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s、56 ℃ 5 s、72 ℃ 10 s，40个循环；95 ℃ 5 s；65 ℃ 5 s；95 ℃ 20 s。

1.2.7 dfprl与其受体基因的原位杂交　实验室前期工作已克隆得到七彩神仙鱼催乳素受体基因dfprlr（数据库基因号：EVM0008977）。设计原位杂交探针，筛选出特异性高的探针并合成，样品经固定液处理后进行石蜡切片SweAMI探针原位杂交。

dfprl基因探针如下：

5'-CTGCCAAAAGGAGGGAAGTGAGAG-3'

5'-CGAGGTCAGTGCCTCCTCTGTAG-3'

5'-GAGGCAGGACAGCAGAAAATTGAA-3'

dfprlr基因探针如下：

5'-CTCTTTTTCAGGAGAACGGCATCG-3'

5'-GAGATACTCGGGAACTTTGATGTAGGAA-3'

5'-GATAGTACAGAGCGTAAGTAGTTGGCATT-3'

5'-GACCCAGATAACGGTGTTGTTCTTGT-3'

5'-GCTCATAGATTAGAGTGATCCAACCGG-3'

2　结果与分析 2.1　七彩神仙鱼dfprl基因的筛选、克隆及结构分析

为鉴定七彩神仙鱼基因组中的dfprl基因，采用17种硬骨鱼的PRL蛋白序列、Hormone_1结构域（PF00103）和PRL蛋白的特征基序作为依据，分别使用BLASTP算法对七彩神仙鱼基因组数据库进行搜索。结果筛选并鉴定出1个七彩神仙鱼PRL基因，命名为dfprl（数据库基因号：EVM0024940）。

dfprl的cDNA序列开放阅读框（ORF）长度为639 bp，共编码212个氨基酸，5'-UTR为309 bp，3'-UTR为334 bp，全长为1 282 bp（图 1）。

dfprl基因ORF编码的氨基酸分子量为23.48 kD，等电点为9.13，亲水性总平均值（GRAVY）为-0.190，dfprl属于亲水性蛋白，分子式为C ₁₀₂₀H₁₆₇₇N₂₉₅O₃₁₀S₁₄，脂肪指数为91.60，不稳定指数为52.79，dfprl为不稳定蛋白。dfprl的结构域主要由Hormone_1组成。对dfprl蛋白的二级结构进行预测，发现α-螺旋占整体的58.49%、β-转角占2.83%、延伸链占0.94%、无规则卷曲占37.74%（图 2）。对dfprl蛋白三级结构进行预测，结果表明其与尼加拉瓜湖始丽鱼AcPRL-1蛋白、人hPRL蛋白的相似度均较高，均达80% 以上。

BLAST同源性对比结果显示，dfprl与17种鱼的PRL同源性较高，与尼加拉瓜湖始丽鱼同源性最高（96.70%），与其他16种鱼的同源性均大于80%。多序列比对结果（图 3）表明，PRL家族的Hormone_1结构域和部分特征基序在鱼类中高度保守。系统发育树结果表明高等动物PRL与鱼类PRL的进化距离相对较远，但整体进化距离差距不大。鱼类中，慈鲷科PRL聚为一簇，非慈鲷科鱼类聚为一簇，其中七彩神仙鱼dfprl和尼加拉瓜湖始丽鱼AcPRL-1聚在同一分支，进化关系最近（图 4）。

2.2　七彩神仙鱼dfprl基因的表达分析

转录组分析显示，dfprl基因在七彩神仙鱼亲本雌雄鱼中的表达略有差异。在整个抚育周期内，dfprl在亲鱼脑中的平均表达水平低于其在亲鱼性腺和皮肤中的表达水平（图 5）。在性腺中，雌雄七彩神仙鱼的表达趋势一致，在雄性精巢中的表达量较高。在精巢中，dfprl表达水平在NB期到S期之间下降，在S期、P1期和P7期逐步上升，NP期间又有所回降，NB期和NP期的表达量无显著差异。在皮肤中，雌雄七彩神仙鱼的表达趋势有明显差异，在S期雌鱼dfprl mRNA水平表达明显上调，在P1期、P7期和NP期逐渐下降；雄鱼进入抚育期后，dfprl mRNA水平逐渐上调，在NP期有所下降。

2.3　七彩神仙鱼dfprl与dfprlr基因的原位杂交

由图 6可知，dfprl基因的荧光素标记为绿色，dfprlr基因的荧光素标记为红色，可见，dfprl和dfprlr基因在皮肤组织的粘液细胞中均有表达，且表达位点相近。dfprl在S期的荧光色最为明显，说明表达量较高；P1期、P7期和NP期荧光色逐渐变暗，说明表达量逐渐下降，这与转录组表达趋势相符。dfprl和dfprlr在P1期和P7期重叠明显。

3　讨论

催乳素对哺乳动物、两栖动物、鸟类和鱼类的繁殖、内分泌、免疫等方面均起重要作用^[14,16-23]。目前，在所有脊椎动物中均发现了PRL的同源基因^[20,38-39]。本研究从七彩神仙鱼中克隆了dfprl基因全长，通过蛋白结构预测，发现七彩神仙鱼dfprl和人类hPRL、尼加拉瓜湖始丽鱼AcPRL-1蛋白的三级结构相似，表明PRL蛋白功能相近。已有研究表明，哺乳动物PRL蛋白的N端、中部和C端存在3个二硫键，但硬骨鱼PRL的N端缺乏12~14个氨基酸，导致其缺乏N端二硫键^[17,40]。一项对鲑鱼（Oncorhynchus keta）的研究首次证明典型的哺乳动物PRL基因结构在鱼类中是保守的^[41]。硬骨鱼类的PRL具有共同的保守结构域，并含有4个相对保守的半胱氨酸残基，其中1个半胱氨酸残基在C端。本研究中，七彩神仙鱼dfprl由212个氨基酸组成，也含有4个半胱氨酸残基，可能在成熟dfprl蛋白中形成2个二硫键，与其他硬骨鱼PRL结构一致。对七彩神仙鱼dfprl和其他物种的PRL蛋白进行多序列比对分析，结果发现所有PRL蛋白均含有保守的Hormone _1结构域及其侧翼。可见，dfprl在硬骨鱼中高度保守，与其他脊椎动物也具有共同的结构域^{[14,39,42-43]}。

研究表明，催乳素和催乳素受体在真兽类和后兽类的雌性和雄性大脑中均有表达，在雌性生殖器官和组织（如子宫、胎盘和乳腺）中表达明显增加^[24,44]。在哺乳动物和鸟类中，催乳素已被证明在生殖发育（包括促进性成熟）中发挥作用，包括乳房生长和卵母细胞成熟（哺乳动物）和嗉囊生长（鸟类）^{[24-25,45-46]}。PRL还调节各种生殖活动，影响激素受体丰度和性腺功能^[17]，在促进黄体存活和类固醇生成方面发挥重要作用^[47]。虽然对鱼类催乳素的研究较少，但有证据表明催乳素在鱼类生殖活动中具有类似功能^[14,18,48]。

七彩神仙鱼亲鱼通过提供皮肤产生的粘液进行抚育，研究表明PRL信号可能在其粘液产生过程中发挥作用^[4,31,49]。本研究对dfprl基因在七彩神仙鱼亲代抚育周期中的表达进行分析，结果表明，在亲鱼进入亲代抚育周期后，dfprl在性腺中的表达水平均上升，在雌鱼皮肤中表达水平明显上调，在雄鱼皮肤中表达水平上调略有滞后，但dfprl在亲鱼皮肤中整体表达上升，这与先前推测七彩神仙鱼催乳素调控亲代抚育期间粘液供养行为的观点一致。进一步通过对NB期、P1期、P7期和NP期皮肤组织进行原位杂交定位及半定量分析，结果显示，dfprl和dfprlr在皮肤粘液细胞中共表达，原位杂交表达与转录组表达趋势一致，在S期后dfprl和dfprlr的结合逐渐明显，表明在抚育期间dfprl很可能通过dfprlr进而在皮肤粘液细胞中起作用。本研究为了解鱼类亲代抚育行为并阐明dfprl基因在七彩神仙鱼亲鱼粘液供养行为中的作用及具体机制奠定基础，扩充了鱼类PRL功能的相关研究。

4　结论

本研究从七彩神仙鱼全基因组数据中筛选鉴定出1个PRL基因（dfprl）。对dfprl进行基因结构及蛋白结构等一系列比对分析，结果显示PRL在鱼类和高等动物中高度保守，一致性均大于80%，dfprl与PRL家族其他成员一致，均存在稳定的Hormone_1结构域。dfprl在精巢中的表达量明显较高，且进入产卵期后，dfprl在皮肤中的表达显著上调。在抚育阶段七彩神仙鱼亲代性腺和皮肤中dfprl高表达，表明dfprl可能参与亲代抚育行为的发生。原位杂交切片结果显示，dfprl与dfprlr在七彩神仙鱼亲代抚育阶段皮肤粘液细胞中的表达位点高度重合，暗示dfprl可能通过与dfprlr结合参与调控七彩神仙鱼皮肤分泌粘液，从而维持亲代抚育行为。