2024, Vol. 51文章信息
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基金项目
- 广东省科技计划项目(2019B030316008, 2023B1212060038); 广东省科技专项资金项目(200831086270718); 广东省林业科技创新项目(2021KJCX013)
作者简介
- 邱道寿，博士，广东省农业科学院作物研究所研究员，硕士生导师，九三学社社员，华中农业大学、厦门大学博士后，《广东省岭南中药材保护条例》立法起草组专家。主要从事南药资源、育种与栽培技术研究。在广东省岭南中药材资源保护、新品种选育、仿野生栽培和林下栽培等方面取得了多项科研成果，这些成果对乡村振兴、精准扶贫和发展林下经济具有重要意义。主持（含第二主持）省（部）级项目12项、市（厅）级项目12项；以第一和通信作者发表论文30篇，主编出版科技著作1部。先后获省级科技进步二等奖3项、三等奖1项；省农业推广二等奖1项、三等奖1项；广东省烟草专卖局（公司）科技三等奖1项；广东省农业科学院科技二等奖1项。获国家发明专利10件，实用新型专利6件，计算机软件著作权6项。通过广东省品种审定4个，参与制订广东省地方标准2项，团体标准10多项；主持完成的成果入选省级农业主推技术2项。邱道寿（1965—），男，博士，研究员，研究方向为南药资源、育种与栽培，E-mail：dsqiu@163.com.
文章历史
- 收稿日期：2024-02-19
2. 中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004;
3. 广东杨帆科技农业有限公司，广东 仁化 512399;
4. 翁源县恒之源农林科技有限公司，广东 翁源 512637
2. School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China;
3. Guangdong Yangfan Technology Agriculture Co. Ltd., Renhua 512399, China;
4. Wengyuan County Hengzhiyuan Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd., Wengyuan 512637, China
【研究意义】骨碎补为水龙骨科植物槲蕨及其习用近缘植物中药名的统称，是历代临床常用中药，用药历史悠久[1-4]。但《中国药典》自1995年版起，仅将槲蕨〔Drynaria fortune（Kunze）J. Sm〕收载为骨碎补药材的唯一基源植物，以干燥根茎入药，具有疗伤止痛、补肾强骨、外用消风祛斑等功效[5]。近年来，大量研究表明骨碎补主要含有黄酮类、苯丙素类、三萜类、酚酸类、木脂素类等化合物，可用于改善骨代谢、抗骨质疏松、调控炎症因子、保护神经系统、护牙健齿、防治中毒性耳聋、防治链霉素毒副作用、强心镇静、降血脂、抗血小板聚集等[6-9]。随着骨碎补活性成分和药理功效的深入研究，药材需求量也日益增大，仅靠野生采集很难满足市场需求，因此，实现人工栽培将是骨碎补药材原料供应的必由之路。【前人研究进展】骨碎补是一味传统的常用中药，古代本草中出现过多基源记载，经考证，骨碎补的基源植物是槲蕨（D. fortune），而中华槲蕨（D. sinica）是主要习用品，大叶骨碎补（Davallia formosana）是地方习用品，另外还有多种混伪品[1-4]。自1995年版《中国药典》将槲蕨定为骨碎补基源后，诸多科研人员专注于槲蕨研究，主要包括药材鉴定、有效成分分析、药理作用、疾病（骨质疏松、骨关节炎、骨折、骨缺损、口腔疾患等）治疗作用和机制、调控骨细胞或干细胞等方面[10]。与这些研究热点相比，关于骨碎补种质资源鉴定筛选、种苗繁育和人工栽培的研究却鲜有报道，仅有少量研究涉及到资源调查[11]、根茎繁殖[12-13]、扦插繁殖[14]和组培繁殖[15]，尚无骨碎补人工栽培技术的研究报道。【本研究切入点】课题组从2020年开始尝试研究骨碎补设施大棚栽培技术，并在小面积试验中取得良好进展。代谢组学是一种在特定条件下对生物体内所有代谢产物进行全面定性或定量分析的方法[16]，已经广泛应用于野生和栽培的黄芪[17]、苍术[18]、人参[19-20]等药材的差异代谢物比较研究，骨碎补抗骨质疏松机制[21]、改善肾功能和治疗骨质疏松机制[22]、骨关节炎治疗机制[23]等药理药效研究，以及其他蕨类药材如绵马贯众（Dryopteris crassirhizoma）的体外抗菌活性[24]、石韦（Pyrrosia lingua）改善肾组织损伤并防止肾结石形成[25]等机制研究。参考和借鉴这些研究基础，本研究拟用广泛靶向代谢组学技术开展大棚栽培3年的骨碎补与其野生品的比较研究，以探讨二者之间的差异代谢物及其通路富集途径。【拟解决的关键问题】通过大棚栽培骨碎补及其野生品的差异代谢物比较分析，参考骨碎补主要药效成分，在差异代谢物中挖掘栽培骨碎补的优势代谢物，为骨碎补的人工栽培提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试骨碎补材料包括野生植株和大棚栽培植株。（1）基源植物槲蕨的野生种源采集于广东省仁化县扶溪镇，为大叶香樟树干上的附生植株；2020年10月开始准备试验材料，野生材料留存于原采集地的树干上。（2）大棚栽培材料为同一生境采集的种源，采用分株繁殖方法移栽于广东省农业科学院白云试验基地南药大棚内。栽植托盘规格为54 cm×30 cm×6 cm，底部铺设一层营养土（厚4~5 cm），将槲蕨根茎贴附于营养土，每盘3~4株，上面覆盖松树皮粒4~5 cm（粒径3~4 cm），整齐摆放于1.8 m宽的可移动式架高苗床上，托盘之间空隙用松树皮粒覆盖，行株距约为40 cm×30 cm。高温季节每隔2~3 d淋水1次，低温季节每隔5~6 d淋水1次，保持土壤湿润。整个栽培期间未施用任何肥料。
主要仪器：高效液相色谱（UPLC，Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A）、串联质谱（MS/MS，QTRAP® 4500+）。主要试剂：甲醇、色谱纯，乙腈、色谱纯，Merck；标准品、色谱纯，BioBioPha/Sigma-Aldrich。
1.2 试验方法1.2.1 采样方法 （1）野生品：2020年10月，在广东省仁化县扶溪镇原始种源采集时，于同一树干或相邻树干选择与采集植株相似的植株进行标记，并留存于树干上。2023年11月，以标记植株为采集样本源，采集成熟植株3株，并于室内将根茎去除杂质、剪去叶片叶柄、褪去绒毛后交武汉慧赢生物有限公司进行广泛靶向代谢组学测试。（2）棚栽品：2023年11月，在1.1大棚栽培的苗床中，选择长势好、根茎膨大壮实的植株，采集3株，将根茎去除杂质、剪去叶片叶柄、褪去绒毛后交上述专业公司进行代谢组学测试。
1.2.2 样品提取 将骨碎补根茎样品置于冻干机中真空冷冻干燥后，采用研磨仪研磨至粉末状。称取粉末50 mg，溶解于1.0 mL 70% 甲醇提取液中；经超声破碎10 min后涡旋3次，每隔10 min涡旋1次、每次10 s，置于4 ℃冰箱过夜。过夜样品于12 000 r/min离心10 min，吸取上清，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤后保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。
1.2.3 色谱质谱采集条件 液相条件：（1）色谱柱：沃特世ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 µm，2.1 mm×100 mm。（2）流动相：A相超纯水（加入0.04% 乙酸），B相乙腈（加入0.04% 乙酸）。（3）洗脱梯度：0 min，水∶乙腈=95∶5（V/V）；10.0 min，水∶乙腈=5∶95（V/V）；11.0 min，水∶乙腈=5∶95（V/V）；11.1 min，水∶乙腈=95∶5（V/V）；15.0 min，水∶乙腈=95∶5（V/V）。（4）流速0.35 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。
质谱条件：电喷雾离子源温度550 ℃，质谱电压5 500V（正）、-4 500 V（负），离子源气体Ⅰ 55 psi，气体Ⅱ 60 psi，气帘气25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四极杆中，按优化去簇电压和碰撞能对每个离子对进行扫描检测。
1.2.4 质控与相关性分析 基于本地代谢数据库，对骨碎补的代谢物进行质谱定性定量分析（MRM代谢物检测多峰图）和总离子流图（TIC图）重叠性等验证，以确保试验方法的稳定性和可靠性；然后，采用主成分分析（PCA）和聚类分析等方法对样本的生物学重复进行检验。
1.2.5 差异代谢物分类分析 依据野生和大棚栽培两组样品的检测结果，通过R软件pheatmap包进行代谢物含量热图分析和物质分类分析。
1.2.6 差异代谢物注释和筛选 通过建立正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型，依据模型的变量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP），结合单变量分析的P值和差异倍数值（Fold Change，FC）（FC≥2，或FC≤0.5，VIP≥1，P＜0.05），从多角度综合分析筛选挖掘差异代谢物。
1.2.7 差异代谢物通路富集分析 基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库，对差异代谢物进行功能注释和富集分析，并以超几何检验P值大小判定富集的显著性。
2 结果与分析 2.1 骨碎补大棚栽培情况从广东省仁化县扶溪镇大叶香樟树干（图 1A）采回的野生骨碎补根茎，经分株处理，于广东省农业科学院白云试验基地大棚栽培。3年后，大棚栽培骨碎补植株生长旺盛、整体长势整齐、叶色浓绿（图 1B），株高略高于野生植株（图 1E）。每年2—4月，地下茎长出新生小叶，新叶多为黄绿色（图 1C），随着叶片长大逐渐转为淡绿色、深绿色；3—5月，在成熟叶片背面会长出孢子囊群，初长出时为浅黄色，之后逐渐转为深黄色至黄褐色，至5月中下旬即可成熟（图 1D）。大棚栽培骨碎补的根茎（图 1E右、图 1F右）与野生品根茎（图 1E左、图 1F左）大小相近、健壮充实，表面密被的绒毛颜色比野生根茎略浅。
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| A：野生场景；B：大棚栽培场景；C：初生叶片；D：成熟孢子囊；E、F：成熟植株和根茎（左边为野生、右边为棚栽） A: Wild scene; B: Greenhouse cultivation scene; C: Primary leaves; D: Mature sporangia; E, F: Mature plants and rhizomes (left: wild; right: greenhouse-cultivated) 图 1 骨碎补大棚栽培和野生植株的形态特征比较 Fig. 1 Comparison of morphological characteristics of greenhouse-cultivated and wild Drynaria fortune |
2.2 骨碎补大棚栽培和野生根茎样本相关性分析
为检测组间和组内样品之间的变异度，对骨碎补大棚栽培和野生根茎样品进行主成分分析（PCA）。图 2A显示，第一主成分PC1和第二主成分PC2的贡献率分别为72.99% 和6.54%，可见组内样本间变异度均较小，而组间样本代谢物则呈明显的分离趋势。采用皮尔逊相关系数R对样本的生物学重复进行相关性评估发现，样品组内的R2均大于0.85（图 2B），表明大棚栽培和野生骨碎补的3个生物学重复样品相关性强，且组间分离明显，检测数据可靠。
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| A：主成分分析结果；B：样品间相关性热图，R2越接近1，表明2个重复样品相关性越强；W：野生根茎样品；G：大棚栽培根茎样品；MIX：混合样品 A: Principal component analysis; B: Correlation heatmap among samples. R2 is closer to 1, the stronger the correlation between the two repeated samples; W: Wild rhizome samples; G: Greenhouse-cultivated rhizome samples; MIX: Mixed samples 图 2 骨碎补大棚栽培和野生根茎样本相关性分析 Fig. 2 Correlation analysis between greenhouse-cultivated and wild rhizome samples of Drynaria fortune |
2.3 骨碎补大棚栽培和野生根茎差异代谢物的分类
将大棚栽培和野生两种生境骨碎补根茎样品的代谢物进行聚类分析，结果如图 3。从图 3可以看出，不同组别间整体象限分明，红绿两种颜色分界线明显，表明两种生境根茎样品中代谢物的组成和含量表现出显著差异。通过代谢物数据库的进一步筛查，在2种根茎样品中共检测到749种代谢物（图 4），包含23类主要代谢物，其中酚酸类97种、黄酮醇86种、氨基酸及其衍生物66种、黄酮45种、生物碱44种和有机酸41种，以上6类代谢物占总数的50.60%，前10类代谢物则占总数的68.75%。总体而言，本研究鉴定到的骨碎补根茎代谢物较为丰富，可进行两种根茎的化合物差异对比。
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| 左侧聚类线为差异代谢物聚类树，上方为样品分组；不同颜色代表相对含量的标准化值，红色为高含量、绿色为低含量 The clustering line on the left is the differential metabolite clustering tree, and that on the top is the sample group; Different colors represent standardized values of relative content, with red indicating high content and green indicating low content 图 3 骨碎补大棚栽培和野生根茎差异代谢物热图 Fig. 3 Heatmap of differential metabolites between greenhouse-cultivated and wild rhizomes of Drynaria fortune |
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| 图 4 骨碎补大棚栽培和野生根茎中检测到的代谢物类别和数量 Fig. 4 Metabolite categories and quantities detected in greenhouse-cultivated and wild rhizomes of Drynaria fortune |
2.4 骨碎补大棚栽培与野生根茎的差异代谢物筛选
为准确挖掘差异代谢物，需要结合单变量统计分析和多元统计分析，从多角度分析筛选差异代谢物。由此，进一步进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。根据所建立的OPLS-DA模型对大棚栽培和野生骨碎补根茎样品的代谢组数据进行分析，绘制各分组的得分图（图 5）。由图 5可知，2组样品间在主成分上有明显分离，且T分值达到80.80%。
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| 横坐标表示组间差距，纵坐标表示组内差距；百分比表示该成分对数据集的解释度，Group为分组；W：野生样品，G：大棚栽培样品 The horizontal axis indicates the difference between groups, and the vertical axis indicates the difference within the group; The percentage represents the explanatory power of the component to the dataset; Group represents grouping; W: Wild sample, G: Greenhouse-cultivated sample 图 5 OPLS-DA得分图 Fig. 5 OPLS-DA score map |
进一步对OPLS-DA模型进行预测评价，结果如图 6。模型对X和Y矩阵的解释率分别为R2X ＝ 0.852和R2Y ＝ 1，模型预测值Q2=0.996，3个预测参数均接近于1，表明本研究建立的OPLS-DA模型的区分度、准确性和稳定性达到预期，可用作结果预测。为避免过拟合，对OPLS-DA模型进行200次随机排列组合实验验证，结果发现Q2和R2Y的P值均小于0.05，表明模型的预测能力较优，可用作差异代谢物的筛选。
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| R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率；Q2表示模型预测能力，Q2>0.5为有效模型，Q2>0.9为出色模型 R2X and R2Y represent the explanatory power of the constructed model for the X and Y matrices, respectively; Q2 represents the predictive ability of the model; When Q2>0.5, it can be considered as an effective model, when Q2>0.9, it can be considered as an excellent model 图 6 OPLS-DA验证图 Fig. 6 OPLS-DA verification diagram |
对各项代谢物的差异倍数值FC进行以2为底数的对数换算，以|log2FC|＞1、VIP＞1及T检验P＜0.05为筛选条件（图 7），最后共筛选到差异代谢物100种（图 8）。其中，在大棚栽培根茎中上调表达的代谢物有58种、下调表达的42种。
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| 每一个点表示一种代谢物；横坐标绝对值越大表示表达量倍数差异越大，纵坐标值越大表示差异表达越显著、筛选到的差异代谢物越可靠；黄点代表下调差异代谢物，红点代表上调差异代谢物，蓝点代表VIP＞1的差异代谢物，灰点代表差异不显著的代谢物 Each dot represents a metabolite; The larger the absolute value of the horizontal axis, the greater the difference in expression multiples; the larger the vertical axis value, the more significant the differential expression, and the more reliable the screened differential expression metabolites are; The yellow dots represent down-regulated differential metabolites, the red dots represent up-regulated differential metabolites, the blue dots represent differential metabolites with VIP>1, and the gray dots represent metabolites with insignificant differences 图 7 差异代谢物火山图 Fig. 7 Volcano plot of differential metabolites |
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| 图 8 差异代谢物分类与数量 Fig. 8 Classification and quantity of differential metabolites |
通过差异代谢物KEGG功能注释和分类发现，这些差异代谢物主要包括黄酮类、有机酸、氨基酸及其衍生物、酚酸类、生物碱、游离脂肪酸等。在大棚栽培骨碎补根茎中，黄酮醇、黄酮碳糖苷、糖及糖类代谢物的含量全部表现为上调，而在野生根茎中则是氨基酸及衍生物、酚酸类、溶血磷脂酰胆碱和花青素类代谢物较多地表现为上调（图 8）。
为进一步阐明大棚栽培品相较于野生品最显著的上调和下调差异代谢物，根据|Log2FC|绝对值的大小将差异代谢物进行排序，上调、下调差异倍数分别居前10位的代谢物如表 1所示。由表 1可知，上调幅度居前10位的差异代谢物中，有酚酸类2种、花青素1种、黄酮醇6种、黄酮碳糖苷1种；上调差异倍数最大的代谢物是紫云英苷和三叶豆甙，比野生骨碎补根茎高出16倍。下调幅度居前10位的差异代谢物中，有氨基酸及其衍生物1种、酚酸类1种、黄酮醇1种、黄酮碳糖苷1种、溶血磷脂酰乙醇胺2种、游离脂肪酸1种、原花青素1种；下调差异倍数最大的代谢物是原花青素，其差异倍数高达15.56倍。
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2.5 骨碎补大棚栽培和野生根茎的黄酮类差异代谢物比较
骨碎补的活性成分主要包括黄酮类、苯丙素类、三萜类、酚酸类、木脂素类等化合物，尤其是黄酮类化合物被认为是改善骨代谢、抗骨质疏松、调控骨关节炎的主要成分，因此本研究进一步对大棚栽培和野生骨碎补根茎种的黄酮类差异代谢物含量进行比较，结果如表 2。
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表 2显示，在6种黄酮类差异代谢物中，相对野生根茎而言，4种在大棚栽培骨碎补中表现为上调、2种表现为下调，其中木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-3'-O-β-D-葡萄糖苷、C-己糖基-芹菜素-O-戊糖苷等3种代谢物上调倍数超过2倍。
在22种黄酮醇类差异代谢物中，相对野生根茎而言，大棚栽培骨碎补全部表现为上调，上调1.5倍以上的有20种、占90.91%，其中上调倍数最大的代谢物为紫云英苷和三叶豆甙、分别达16.64倍和16.58倍。
与野生根茎相比，异皂草苷、橙皮素C-己糖苷等两种黄酮碳糖苷类差异代谢物在大棚栽培骨碎补中均表现为上调，上调倍数分别为3.15倍和1.95倍。
与野生根茎相比，两种异黄酮类代谢物中，1种在大棚栽培根茎中表现为上调，1种在野生根茎中表现上调，差异倍数都在2倍以下。
此外，《中国药典》规定检测的骨碎补主要成分柚皮苷（柚皮素7-O-新橘皮糖苷）也在大棚栽培根茎中表现为微弱上调（log2FC=0.207079，VIP=2.189048），但与野生根茎相比差异未达显著水平（P=0.149384）。
2.6 骨碎补大棚栽培和野生根茎差异代谢物代谢通路分析通过差异代谢物的通路富集分析有助于了解代谢途径的变化机制。本研究利用KEGG PATHWAY数据库，根据注释检测到的差异代谢物进行通路富集分析，100种差异代谢物共注释到47条代谢通路，其中显著富集的有维生素B6代谢、芪类化合物（Stilbenoid）生物合成、二芳基庚烷（Diarylheptanoid）生物合成、姜酚（Gingerol）生物合成、黄酮和黄酮醇（Flavone and flavonol）生物合成、半胱氨酸（Cysteine）代谢、蛋氨酸（Methionine）代谢、花青素（Anthocyanin）生物合成、氨酰基tRNA（Aminoacyl-tRNA）生物合成等途径（图 9）。从图 9还可以看出，每种代谢途径有多种代谢物参与，部分代谢物也可参与多个代谢途径。
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| Rich factor值越大，表示富集程度越大；P值越接近于0，表示富集越显著；圆点越大，表示富集到相应通路上的差异显著代谢物的种数越多 The larger the Rich factor value, the greater the degree of enrichment; The closer the P value is to 0, the more significant the enrichment is; The larger the dot, the greater the number of significantly different metabolites enriched in the corresponding pathway 图 9 骨碎补大棚栽培和野生根茎差异代谢物KEGG富集图 Fig. 9 KEGG enrichment map of differential metabolites between greenhouse-cultivated and wild rhizomes of Drynaria fortune |
3 讨论
骨碎补始载于唐代《本草拾遗》，已有1 000多年历史，开元皇帝以其主伤折补骨碎而得名[1]。宋廷杰等[1]调查发现骨碎补在我国有3科6属12种习用品种，但自1995年版《中国药典》仅收载槲蕨1种后，槲蕨即被逐渐公认为主流品种，占商品来源的70% 以上。据药化分析，槲蕨中含有骨碎补活性成分之一的柚皮苷，且含量在药典规定的0.5% 之上，而中华槲蕨及其他品种则含量甚微或不能检出。本研究在棚栽和野生骨碎补根茎样品中均检测到柚皮苷（柚皮素7-O-新橘皮糖苷），且柚皮苷含量在棚栽样品中略高，这与宋廷杰等[1]研究结果相符。周群等[6]与谌顺清等[7]综述了骨碎补药理作用研究进展，认为骨碎补的抗骨质疏松、促进骨折愈合和软骨再生、补肾保肾、护牙健齿、抗炎、降脂、增强免疫力、改善记忆、防治药物中毒性耳聋、活血化瘀、抑菌、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抑制椎间盘退变等诸多药理作用，几乎都与黄酮类物质含量有关，尤其黄酮类化合物含量在促进骨折愈合、抗骨质疏松、抗炎、肾脏保护、促进牙齿生长、降血脂等中起着显著作用。本研究通过比较分析棚栽与野生骨碎补根茎样品发现，两者差异代谢物中，黄酮类化合物排首位，并且在棚栽骨碎补根茎中，黄酮醇、黄酮碳糖苷类代谢物含量全部表现为上调，表明骨碎补由野生改为人工栽培不仅可以完全保留药材品质，甚至还可以提升主要活性成分含量。
在药材商品中，不少品种都有野生品与栽培品供应市场，不同的中药材野生品与栽培品品质差异参差不齐，但野生中药材品质普遍优于栽培品[26-28]，在相同剂量下野生品的作用效果优于栽培品[29-30]。然而也有不少研究表明，栽培药材与野生药材其标志性成分各有差异[31-32]，或主要活性成分含量无显著差异[33-35]，甚至有些栽培品还优于野生品[36]，认为栽培品可以代替野生品使用。本研究中，棚栽和野生骨碎补在黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷、酚酸类等主要活性化合物中有上调、也有下调，但棚栽骨碎补样品的黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷等化合物含量上调更为显著，显示出优于野生品的潜力。就附生性或寄生性药材而言，附生基质或寄主的不同可能导致药材品质甚至药性的显著差异。田凡等[37]选用9个树种开展铁皮石斛附生栽培研究，发现不同的附生树种不仅造成铁皮石斛生长指标的差异，同时也对其品质产生显著影响，附生李树的总黄酮含量高，附生盐麸木、李树、南酸枣的总多糖含量高，附生李树、枇杷、天竺桂的则表现总生物碱含量高。李立章[38]研究表明，不同的寄主不仅显著影响桑寄生药材的药性，也影响药材质量，如肉桂寄生带来温热药性、柳树寄生产生寒凉药性，而桑树寄生的药性则为平性或偏凉性；采用代谢组学技术进一步分析，发现桑树寄生药材与寄主之间存在着物质成分的传输，且寄主不同传输的物质成分和含量也有所不同，并推测这可能是影响药材质量和药性差异的主要原因。骨碎补作为一种兼性附生植物，在野外除常见附生于多种树干上外，也可见附生在岩体、老屋瓦栋或墙体等生境上，不同的附生基质可能导致药材成分和质量显著不同。黄春江等[39]通过比较两种生境骨碎补药材水分、总灰分、浸出物、柚皮苷等含量，发现树干生境骨碎补药材的质量要高于岩石生境，并推测产生这种差异的主要原因可能包括：附生植物具有更强的适应性，林冠遮蔽可减轻高温伤害而有利于光合作用、增加碳积累，附生植物能从树干径流中选择性地吸收养分等。本研究通过代谢产物的对比分析，发现大棚栽培的骨碎补相比树干附生的野生骨碎补质量更优，在上述岩石和树干两种野外生境对比研究的基础上，增加了一种大棚栽培研究的结果参考。本研究在开展骨碎补人工栽培时，为着生和保水，除在根茎上覆盖松树皮颗粒外，还在栽培托盘上铺设一层营养土，相较于野外树干其着生介质和养分可能更加优厚，加上大棚环境下光照、温度和湿度相对稳定，更有利于植株生长和成分积累，这些因素的综合作用可能是导致大棚栽培骨碎补质量优于树干附生野生品的主要原因。
目前，骨碎补药材基本来源于野生资源的采挖，仅有少量根茎繁殖[12-13]、扦插繁殖[14]和组培繁殖[15]的研究报道，尚未实现产业化人工栽培。本研究中，大棚栽培的骨碎补根茎在黄酮类化合物中明显表现出优于野生品的优势，可为进一步开展骨碎补的产业化种植提供依据。但本研究开展的骨碎补大棚栽培规模较小、栽培方式单一，根据槲蕨的野外生长习性，除大棚栽培外，应该可以实现山地、林下、树干附生等多种人工栽培或仿野生栽培模式，其栽培效果值得进一步深入研究。目前，骨碎补的功效物质基础研究主要集中于总黄酮研究上，对单体成分的研究也主要集中在柚皮苷等少数物质，对除黄酮类化合物以外化学成分的药理作用研究尚不够深入[6]，且黄酮类化合物存在于多种中药材中，其功效作用也复杂多样，后续仍然需要更加深入细致的研究。
4 结论以大棚栽培3年和原采集点野生的骨碎补根茎为试验材料，通过广泛靶向代谢组分析共检测到749种代谢物，包含23类主要代谢物，其中酚酸类97种、黄酮醇86种、氨基酸及其衍生物66种、黄酮45种、生物碱44种和有机酸41种，这6类代谢物占总数的50.60%，前10类代谢物则占总数的68.75%。以|log2FC|＞1、VIP＞1和P＜0.05为条件，从中筛选到100种差异代谢物，在大棚栽培的骨碎补根茎中58种表现为上调、42种表现为下调。主要差异代谢物包括黄酮类、有机酸、氨基酸及其衍生物、酚酸类、生物碱、游离脂肪酸等。在大棚栽培骨碎补根茎中，黄酮醇、黄酮碳糖苷、糖及糖类代谢物全部表现为上调；而在野生根茎中，则是氨基酸及衍生物、酚酸类、溶血磷脂酰胆碱、花青素类代谢物较多地表现为上调。在大棚栽培根茎中上调幅度居前10位的差异代谢物中，有酚酸类2种、花青素1种、黄酮醇6种、黄酮碳糖苷1种；上调差异倍数最大的代谢物是紫云英苷和三叶豆甙，比野生根茎高出16倍。下调幅度居前10位的差异代谢物中，有氨基酸及其衍生物1种、酚酸类1种、黄酮醇1种、黄酮碳糖苷1种、溶血磷脂酰乙醇胺2种、游离脂肪酸1种、原花青素1种；下调差异倍数最大的代谢物是原花青素，其差异倍数高达15.56倍。通路富集分析结果显示，100种差异代谢物共注释到47条代谢通路，其中显著富集的有维生素B6代谢、芪类化合物生物合成、二芳基庚烷生物合成、姜酚生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、半胱氨酸代谢、蛋氨酸代谢、花青素生物合成、氨酰基tRNA生物合成等途径。大棚栽培的骨碎补根茎较野生根茎在主要有效成分黄酮类化合物的积累上具有显著优势。
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(责任编辑 张辉玲)