【研究意义】菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）又称菜薹，是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种中以花薹为产品的蔬菜，起源于中国南部，品质柔嫩，营养丰富，被称为“蔬品之冠”和“百蔬之王” ^[1]，在岭南蔬菜市场供应中居于首要地位。根据广东省农业农村厅对2023年广东省蔬菜产销形式分析，2023年广东省蔬菜播种面积约145.6万hm²，其中菜心种植面积占比最大、为25.0%，产量占比为13.3%。菜心消费从华南地区逐渐出口韩国、日本、美国、欧洲、东南亚等国家和地区^[2]，深受广大种植户和消费者的喜爱。菜心软腐病是一种常见的细菌性病害，华南地区高温多雨天气持续时间长^[3]，软腐病病菌经土壤和水流传播后，从植株伤口或自然孔口进入植株体内，被侵染的植株先呈半透明水渍状，2~3 d后变成灰色或褐色，随后变为黏滑软腐状，并放出特殊臭味。菜心软腐病造成的经济损失可达菜心产业的30% 左右^[4]，严重时甚至可能导致绝收。菜心软腐病的防治包括农业防治、化学防治和生物防治等方面，其中农业防治措施主要有轮作、选用抗病品种、加强田间管理等，生物防治主要利用有益微生物进行防治，化学防治主要是使用化学农药进行防治。选择抗软腐病的菜心品种是有效的防治措施之一，可为菜心抗软腐病生产提供便捷。【前人研究进展】我国关于菜心软腐病的研究最早报道是在20世纪50年代，郑冠标^[4]针对惠阳县菜心的发病情况进行防治试验，发现撒石灰可有效防治菜心软腐病。此后国内有关菜心软腐病的研究鲜见报道，近年来相关研究得到广泛关注。许多研究者们从病原菌的鉴定、发病规律、影响因素等生物学特性，以及侵染机制、流行规律等方面进行了研究。曾小玲等^[5]对软腐病菌侵染下的菜心叶片进行转录组测序工作，以获取在软腐病菌侵染下的菜心转录组功能基因信息，为菜心抗软腐病关键基因及其功能研究提供了重要依据。蒋梅等^[6]通过调查和试验，揭示了软腐病的发生规律和传播途径，对病害的预测和防治具有一定的指导意义。关于菜心软腐病的抗性鉴定方法在国内尚无相关报道。但张华等^[7]根据接种浓度、保湿时间和苗龄进行试验、摸索出了一套适合于菜心炭疽病苗期抗病性鉴定的方法；田宇等^[8]经过比较不同软腐致病菌、接种方法、苗龄、接种后调查时间对软腐病发病的影响，建立起一套方便快速的生菜细菌性软腐病抗性评价方法；张衍荣等^[9]对胚根接种法和剪根第6期李桂花等：不同菜心品种对软腐病的抗性鉴定91接种法进行了分析比较，发现苗期剪根接种法最适宜用于豇豆枯萎病抗性鉴定；姚玉荣等^[10]对接种菌液浓度、苗龄、接种方法及发病温度等因素进行试验，可以客观反映出花椰菜对黑腐病的抗病性；关钟燕^[11]探索了一种不仅准确而且方便易行的黄瓜细菌性角斑病苗期抗病性鉴定方法。上述研究对菜心软腐病的抗性鉴定具有借鉴价值。【本研究切入点】目前关于不同菜心品种对菜心软腐病的抗性差异研究鲜见报道，筛选出具有抗菜心软腐病的菜心品种，对实际生产具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究通过菜心软腐病病原菌分离、纯化、鉴定和接种、病情指数测定及抗性分级等进行研究，并对收集到的有代表性的52份菜心品种进行软腐病抗性鉴定，以期筛选出抗软腐病的菜心品种（系）。

1　材料与方法 1.1　试验材料

试验于2023年在广东省农业科学院植物保护研究所植物培养温网室内进行，供试的52份菜心材料由广州市农业科学研究院和广东省农业科学院蔬菜研究所提供，其中广州市农业科学研究院提供38份：玉田2号、玉田3号、玉田4号、广玉田5号、广玉田7号、广玉田8号、SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SA-5、SA-6、SA-7、SA-8、SA-9、SA-10、SA-11、SA-12、SA-13、SA-14、SA-15、SA-16、SA-17、SA-18、SA-19、SA-20、SA-21、SA-22、SA-23、SA-24、SA-25、SA-26、SA-27、SA-28、SA-29、SA-30、SA-31、SA-32；广东省农业科学院蔬菜研究所提供14份：粤薹1号、粤薹2号、粤薹3号、粤薹4号、粤薹5号、粤薹8号、柳盛1号、70天尖叶、萧岗菜心、T大白菜、120天尖叶、丰裕2号、丰裕4号、靓青菜苔。上述52份菜心品种均为近年通过广东省农作物品种评定、配制的杂交新组合、生产上大面积推广的常规种或骨干亲本，种子充实、饱满、发芽率98% 以上。

供试软腐病菌株分离自广东省菜心产区的菜心软腐病病样，菌株编号为ZCCX-2。

1.2　仪器及试剂配制

超净工作台、酒精灯、接种环、刀片、研钵、蒸馏水（滴瓶）、载玻片、显微镜、记号笔、标签、70% 乙醇、灭菌培养皿、灭菌水、NA培养基、LB液体培养基、离心机、离心管、移液枪、高压灭菌锅、恒温箱、-80℃冰箱、电子天平。

营养琼脂培养基（NA）：牛肉浸膏3.09 g，蛋白5.0 g，葡萄糖2.5 g，酵母浸膏1.0 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.2。

LB液体培养基：蛋白胨2.5 g，酵母提取物1.25 g，氯化钠2.5 g，蒸馏水250 mL，pH 7.0。

1.3　试验方法

1.3.1 软腐病病原菌的分离　将采集的疑似菜心软腐病的标本进行病组织切片，显微镜观察可见叶脉的切口处有大量云雾状液体流出。经过镜检确认有喷菌现象后，采用划线分离法^[12]进行病原菌分离。具体操作：取发病菜心的叶片，蒸馏水冲洗后，75% 酒精消毒。用灭菌剪刀剪下病健交界处的组织置于研钵，加5 mL蒸馏水研磨，静置10 min充分释放菌液后，形成细菌悬浮液。取菌液划线至NA培养基平板上，26~28℃恒温倒置培养2~3 d。待平板上长出菌落，挑取单菌落移至新的NA培养基平板上，再用灭菌水将单菌落稀释成悬浮液作第二次划线分离，28℃恒温培养箱中倒置培养1~2 d，反复划线纯化3次。挑取纯化后的单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养12 h，再分别取500 μL菌液和500 μL的30% 甘油于2 mL离心管中混合均匀，液氮速冻后，-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 病原菌形态学及分子鉴定　形态学观察：将分离的病原菌单菌落接种于NA平板培养基上，28℃恒温培养48 h后，观察并记录菌落大小、表面形状、颜色、粘度、透明度。采用革兰氏染色法，在油镜下观察菌体形态。分子鉴定：将纯化后的单菌落接种于LB液体培养基中，于28℃振荡培养12 h后，取3 mL菌液送至广州艾基生物有限公司进行16S rDNA菌种鉴定。

1.3.3 试验菜心苗准备　将新鲜基质土倒入4×8格的育苗盘，于2023年5月6日将各菜心材料的种子撒入穴盘中，每穴播1~2粒种子，随后在种子上覆盖上一层薄薄的基质土，每份菜心材料做好标记，26℃温室培育至出苗，于2023年7月17日进行软腐病病菌接种。

1.3.4 接种方法　采用喷雾法进行接种，接种菌液浓度为1×108 CFU/mL。在菜心长至7~8片真叶时每穴留1~2株苗，用刀片在茎部轻划2个直径约5 mm的刀口，使用小型手持喷雾器将菌液喷到伤口表面，每处理30株，3次重复，随机排列。接种完成后，保持栽培土湿润，每天早晚各浇水1次，温网室内自然光，温度28~35℃，相对湿度55%~65%。

1.3.5 病情指数调查及分级标准　接种3 d后进行调查。观察发病情况，记录各级病株数，计算各品种（材料）病情指数。参考菜心对软腐病抗性水平评价标准，根据症状表现评估各个材料的抗性水平、确定病情指数分级标准。将病情指数分为0级、1级、3级、5级、7级和9级，具体如下：

1.4　数据分析

运用Microsoft Excel和SPSS进行试验数据处理及方差统计分析。试验数据进行单因素差异分析（One-way analysis of variance，ANOVA），P＜0.05为显著差异性，P＜00.1为极显著差异性。

2　结果与分析 2.1　病原菌形态及分子鉴定

菌株分离培养和镜检观察结果（图 1）表明，分离得到的病原菌为革兰氏阴性菌，能在37℃的NA培养基上生长，菌落圆形、质地均匀、乳白色、半透明、边缘整齐、中央稍隆起、表面光滑湿润，菌体呈短杆状，菌株有臭味。

提取上述菌株的DNA，使用16S rDNA引物进行PCR扩增，经电泳检测得到明亮清晰条带，分子大小约1 500 bp。将测序结果与NCBI上相似序列进行Blast对比，发现其与巴西果胶杆菌（Pectobacterium brasiliense）和胡萝卜软腐病果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）的相似性均在98% 以上。

2.2　52份菜心品种间软腐病抗性差异分析

本研究通过室内人工接种，鉴定与评价了52份菜心材料对菜心软腐病的抗性水平，并对52份菜心材料病情指数的数据进行分析，结果（图 3）显示，52份菜心材料的平均病情指数介于42.96~100，其中广玉田7号和SA-20的平均病情指数最高（均为100），为高感品种；丰裕4号平均病情指数最低（42.96），为中抗品种；未发现高抗及免疫品种。

参照菜心品种对软腐病抗性水平评价标准，由表 1可知，52份菜心材料中广玉田7号、SA- 20、SA-23、SA-9、SA-27、粤薹8号、SA-3、SA-7、玉田3号、柳盛1号、SA-29、广玉田5号、SA-32、SA-1、SA-17、SA-5、SA-11、70天尖叶、SA-31、SA-15、SA-8、T大白菜、SA-30、萧岗菜心、SA-14、玉田4号、SA-16、SA-4、SA-25、SA-19、粤薹2号、粤薹3号、SA-12、SA-22和SA-13等35份菜心品种对菜心软腐病均表现为高感；粤薹1号、SA-26、SA-24、120天尖叶、粤薹4号、SA-10、SA-21、广玉田8号、玉田2号、SA-18、SA-2、丰裕2号、粤薹5号、靓青菜苔、SA-6和SA-28等16份菜心品种对菜心软腐病均表现为感病；丰裕4号菜心品种对菜心软腐病表现为中抗；3次重复的平均病情指数分别为80.78、84.15、81.78，差异不显著。本研究未发现高抗或免疫品种，表明目前生产上可能仍缺乏菜心软腐病高抗品种。

3　讨论

近年来，随着菜心栽培面积的扩大和重茬现象的出现，菜心病害逐年加重，其中细菌性软腐病是危害菜心的主要病害之一。蔬菜细菌性软腐病是由软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora ssp. carotovora, Ecc）引起的一种流行性死体营养型细菌病害，其病原菌可存于植物表面和土壤中，通过伤口或自然孔口进入植物体内，主要依靠Types II蛋白分泌系统合成和分泌水解酶降解植物细胞壁，使植物组织呈浸渍状^[13]。该病害发病较重时可造成蔬菜严重减产，且在储藏运输过程中易造成腐烂，严重影响品质。本研究分析探讨不同菜心品种对软腐病抗病性差异，并对菜心品种进行抗病性评价，以期筛选出抗病品种应用于生产。本研究评价了52份菜心材料的抗性水平，结果表明，52份菜心材料中，35份表现为高感，16份表现为感病，仅有丰裕4号菜心表现为中抗。菜心是小白菜，经过长期的驯化，形成的一支独特的变种。臧威等^[14]对大白菜材料软腐病接种鉴定结果表明，在44份材料中尚未发现有对大白菜软腐病免疫或高抗的品种，该结论与本研究对菜心材料的接种鉴定结果一致，表明菜心抗软腐病的种质资源相对有限，抗病育种任务艰巨。因此，后续要收集更多亲缘关系较近的小白菜、大白菜等，从中寻找抗性资源材料，为培育抗软腐病菜心品种提供支撑。

目前关于菜心软腐病的抗性鉴定研究相对较少，尤其是在不同品种的抗病性方面，更多是集中在对菜心炭疽病^[15]、辣椒炭疽病^[16]、大白菜软腐病^[14]、马铃薯软腐病^[17]的抗性鉴定等，本研究围绕菜心软腐病展开，具有较强的针对性和现实意义。此外，后续可探讨菜心对软腐病的抗性与其他性状之间的关系，例如产量、营养成分等，同时还可以开展软腐病防治技术研究，提出有效防治措施，减少农药使用量、降低农药残留、提高蔬菜安全性，培育抗病且高产优质的菜心品种，为农业生产和育种工作提供重要指导。

4　结论

本研究分离鉴定得到一株菜心软腐病病原菌，经Blast比对发现其与巴西果胶杆菌和胡萝卜软腐病果胶杆菌的相似性均在98% 以上；同时采用喷雾法室内人工接种软腐病病原菌，建立了可快速、准确鉴定菜心的抗软腐病水平的方法。鉴定的52份菜心品种中有35份品种表现为高感、16份品种表现为感病，仅丰裕4号表现为中抗，未发现高抗或免疫品种。由此推测，目前生产上种植及培育的菜心品种多数为感病品种，建议加强菜心亲缘关系较近材料小白菜、大白菜的利用，为抗病育种提供更多的抗性材料。