2024, Vol. 51文章信息
引用本文 |
基金项目
- 湖北省重点研发计划项目（2022BBA0031）；湖北中烟工业有限责任公司科技项目（2021JCYL3SX2B011）
作者简介
- 张贝贝（1999—），女，在读硕士生，研究方向为雪茄微生物发酵，E-mail：zhangbeibei202102@163.com.
通讯作者
- 冀志霞（1973—），女，博士，副教授，研究方向为微生物发酵与代谢，E-mail：zhixiaji@mail.hzau.edu.cn.
文章历史
- 收稿日期：2024-03-10
2. 湖北中烟工业有限责任公司，湖北 武汉 430040;
3. 华中农业大学园艺林学学院，湖北 武汉 430070
2. China Tobacco Hubei Industrial Co., ltd., Wuhan 430040, China;
3. College of Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
【研究意义】香气是雪茄烟重要的品质指标，在生产实践中，因烟叶原料的种植及管理差异，导致烟叶香气量不足、香韵类型单一、刺激性强和杂气重等问题，降低烟叶的可用性，而烟叶发酵是改善烟叶香气品质的重要手段之一。【前人研究进展】经微生物发酵后，烟叶内部无特征香味大分子化合物转化分解为各种小分子或挥发性物质，可以显著提升烟叶香气品质。但烟叶自然发酵的过程存在发酵时间长、微生物作用效率低、作用效果不稳定等问题[1]。而人工接菌发酵是在温、湿度可控条件下，利用功能微生物的生物催化或代谢作用来发酵烟叶，可加速降解或转化烟叶中的不良物质、于短时间内提升烟叶品质。因此，筛选烟叶功能微生物并用于烟叶发酵，一直是研究人员关注的热点。芽孢杆菌属（Bacillus）广泛应用于工、农业和医药生产领域，因其具有较强的抗逆性广泛存在于烟叶发酵的各阶段，是目前雪茄烟叶发酵过程中的主要菌属[2]，English等[3]在烟叶上分别或混合接种枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和环状芽孢杆菌（B. circularis）后，烟叶香气得到有效提高。李志豪等[4]和梁开朝等[5]利用嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus）和蜡样芽孢杆菌（B. cereus）使烟叶香气也得到明显提高。综上，功能微生物发酵在改善烟叶香味和吃味方面有较大潜力，因此通过筛选与应用功能微生物可提高烟叶香气品质。【本研究切入点】已有报道指出，芽孢杆菌是烟叶中的优势菌属，目前应用于烟叶发酵的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌（B. amylolyticus）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）和莫海威芽孢杆菌（B. mojavensis）等[6-9]，但尚未有将沙福芽孢杆菌（B. safensis）应用于雪茄烟叶发酵的报道。沙福芽孢杆菌是一种常见的土壤微生物，当前对其的研究主要集中在抗重金属及抗生物胁迫等方面，其可为植物提供营养、改善土壤结构、提高植物免疫力和促进植物生长等，还具有产蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的能力，对降解烟叶中的大分子物质具有重要作用[10-15]。前人研究中仅通过人工接种微生物发酵烟叶来提升烟叶品质，并未将香气成分与烟叶的感官品质特征进行关联分析。【拟解决的关键问题】本研究首次将沙福芽孢杆菌应用于雪茄烟叶发酵，通过对比分析雪茄烟叶中性致香成分的变化，结合多元统计方法筛选差异代谢物，分析差异代谢物与烟叶感官品质相关性，以期为其应用于雪茄烟叶发酵提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料沙福芽孢杆菌GL2由本课题组从古巴雪茄烟高希霸罗伯图中分离得来。发酵烟叶品种为‘Criollo 98’，试验年份为2019年，叶位取上二棚（由湖北中烟工业有限责任公司提供）。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH值7.0~7.2，固体培养基再加琼脂粉20.0。乙酸苯乙酯（98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；C7-C40正构烷烃混标为色谱纯（BR），上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 菌种制备 将GL2接种至牛肉膏液体培养基，于37 ℃、180 r/min条件下振荡培养12 h。然后以4 000 r/min离心5 min，收集菌体。菌体用无菌水清洗2次，并用无菌水重悬得菌液，进行计数，配制成一定浓度的菌液，作为接种备用。
1.2.2 烟叶发酵 接种发酵前使用烘箱法检测烟叶的初始含水率[16]，计算烟叶需要额外加水量，根据前期预实验确定菌株的接种量。挑取完整片状雪茄烟叶，每份约40 g，将GL2菌液加无菌水稀释后均匀喷洒至烟叶表面，保证烟叶的接种量为108 CFU/g、含水率为40%。以仅添加无菌水的烟叶样品（含水率为40%）作为空白对照，每个处理设置3次重复。将接种后的烟叶封装于无菌袋中，于37 ℃恒温发酵15 d，烟叶发酵结束后取出用液氮冷冻，然后用植物粉碎机进行粉碎，过孔径为0.63 mm的筛网，将得到的烟叶粉末置于4 ℃冰箱用于后续检测。
1.2.3 中性致香成分测定 雪茄烟叶的中性致香成分使用水蒸气蒸馏 - 二氯甲烷溶剂萃取法[17]测定，每个处理3次重复。在1 000 mL圆底烧瓶中加入5.0 g烟样、0.5 g柠檬酸、500 mL蒸馏水和50 µL乙酸苯乙酯（浓度为2.23 µ/µL），使用恒温电热套加热；装置的另一端接盛有40 mL二氯甲烷的250 mL圆底烧瓶，该端烧瓶置于恒温水浴锅中加热，水浴温度为60 ℃。同时，蒸馏萃取2.5 h，萃取完成后加入过量无水硫酸钠干燥有机相，将有机相转移到茄形瓶，使用旋转蒸发仪浓缩至约1 mL，得到烟叶精油；将烟叶精油转移至2 mL棕色气相瓶中，用于GC-MS分析。
色谱柱：TG-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。载气He，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，传输线温度280 ℃，离子源温度177 ℃。升温程序：初始温度60 ℃保留2 min，然后以2 ℃ / min的升温速度升至230 ℃，保留15 min，分流比10∶1，进样量为2 μL，电离能70 eV，电离方式EI。质量数范围35~500 amu，溶剂延迟6 min。
数据处理参考刘峰峰等[16]方法，由GC-MS得出正构烷烃标样C7-C40和发酵样品中各香气成分色谱峰的保留时间（RT），计算物质的保留指数，经计算机通过NIST谱库进行检索匹配，以匹配值> 600，保留指数误差不超过15为鉴定标准，结合数据库中的匹配度进行定性挥发物的相对含量计算如下：
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1.2.4 烟叶感官质量评价 由6名烟叶感官评审专家对发酵好的雪茄烟叶进行感官评价，一般情况下，影响烟叶品质的因素主要有香韵类型、香气、和刺激性等不良气息，而烟叶中胡萝卜素、酚类等香气成分对烟叶色泽有直接影响，故评价指标选择烟叶香气、刺激性、色泽和香韵种类，且前三者按档次分别赋予不同分值，满分依次为15、15和10分，如表 1所示；香韵按照评审种类及强度进行评分（分值为1~5分），香韵特征包括木香、豆香、花香、蜜甜香、醇甜香、清甜香等，具体评价标准参考《国产雪茄烟感官质量评价方法的建立》 [18]。
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1.3 数据处理
鉴定出的中性致香成分利用SIMCA（Version 14.1，Umetries，Sweden）进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘分析（OPLS-DA），借助变量投影重要度（Variable importance in projection，VIP） > 1和独立t检验中P < 0.05筛选显著变化的物质，并以此为差异代谢物。差异中性致香成分含量采用Z-score归一化处理并作热图。关键中性致香成分采用相对香气活力值（Relative Odor Activity Value，ROAV）进行比较，阈值查询采用文献[19]提供的空气介质觉察阈值，优先使用最新年份的阈值数据，一般认为ROAV＞1的组分为关键香气成分，0.1＜ROAV＜1的组分为修饰香气成分[20]。烟叶品质指标与差异中性致香成分之间采用皮尔逊相关性方法分析（Pearson correlation coefficient）[21]，通过SPSS 23计算。使用Excel 2009、SPSS 23、GraphPad Prism 7.0对雪茄烟叶中性致香成分进行数据分析及可视化，采用Unpaired student’s t-test检验进行差异显著性分析，香气香型描述参考李玉川等[22]。
2 结果与分析 2.1 沙福芽孢杆菌GL2发酵后雪茄烟叶中性致香成分对发酵后的雪茄烟叶进行GC-MS检测，从沙福芽孢杆菌GL2发酵样及对照样（CK）中分别检测出37、39种中性致香成分。按照官能团将中性致香成分分为6类，具体种类及相对含量见表 2，各类物质占比如图 1所示。雪茄烟叶中性致香成分主要为烯烃类、酮类、醇类、酯类、醛类和酚类，经GL2发酵后各类别的香气种类有一定的改变；同时烟叶中性致香成分总量由1 118.28 μg/g提高至1 509.38 μg/g，提高34.97%，增加的物质类型主要是烯烃类、酮类、醇类和酚类，而酯类和醛类含量则降低。不同处理烟叶中性致香成分占比均以烯烃类、酮类和醇类致香成分为主，且在GL2发酵后含量明显增加，分别增加7.16%、2.20% 和2.26%；含量增加的烃类共10种，其中新植二烯含量从143.30 μg/g提高至278.53 μg/g、增幅达94.4%，是GL2发酵后雪茄烟叶含量最高的中性致香成分。含量增加的酮类成分共13种，包括有新鲜胡萝卜样香味的茄酮、有明显果香和木香香气的β-大马酮、有甜润而又持久烟草和干果香气的巨豆三烯酮A和巨豆三烯酮B等物质，GL2发酵后含量分别为51.60、1.09、4.04和3.28 μg/g。这些物质均是烟草中重要的香味成分，能调和烟气，减少刺激感[23]。酮类成分中含量最多的是金合欢基丙酮，从95.57 μg/g提升至132.49 μg/g，其具有甜香，可增强烟香、改善吸味。含量增加的醇类共8种，植物醇含量从176.08 μg/g提高至265.52 μg/g，其常作为定香剂用于烟用香精，是含量最高的醇类成分。酚类成分总量提升0.90%，GL2发酵后烟叶中酚类物质仅检测到2, 4-二叔丁基苯酚，其含量从21.57 μg/g提升至62.96 μg/g。此外，GL2发酵后酯类和醛类成分总量分别减少6.66% 和5.86%，未检测到二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸二丁酯及苯乙醛；(R)-二氢猕猴桃内酯具有清凉感，魏涛等[24]研究表明，(R)-二氢猕猴桃内酯是增加烟清新香气的主要成分，但赵赛月等[25]研究发现其对香气存在显著的负面效应；茅中一等[26]指出苯乙醛能增加烟叶花香香韵，而王泽鹏等[27]研究表明苯乙醛对烟草干草香、焦甜香、焦香、正甜香、清甜香、清香均有较大的负面影响。
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| 图 1 雪茄烟叶中不同种类的中性致香成分含量 Fig. 1 Contents of different neutral aroma components in cigar tobacco leaves |
由雪茄烟叶香韵特征的感官评分（表 3）可知，CK组烟叶以木香、醇甜香、蜜甜香和烘焙香为主，GL2接种发酵后烟叶的香韵以焦甜香、清甜香、花香和干草香为主，香韵特征发生明显变化，这与酮类香气成分增加、苯乙醛含量降低对香韵的影响较为一致。综上，雪茄烟叶经GL2发酵后香气总量及多种重要致香成分含量呈增加趋势，主要为烯烃类、酮类和醇类，包括新植二烯、茄酮、β-大马酮、巨豆三烯酮、金合欢基丙酮、植物醇等雪茄特征香味物质，这些物质的增加有助于提升雪茄烟叶的感官品质；减少的成分主要为酯类和醛类，包括苯乙醛、二氢猕猴桃内酯和邻苯二甲酸二丁酯。
2.2 沙福芽孢杆菌GL2发酵后雪茄烟叶中差异中性致香成分
GL2发酵后雪茄烟叶中多种中性致香成分含量发生变化，为明晰中性致香成分差异，使用无监督模式识别的多维数据方法对样品的GC-MS原始峰进行统计分析，判断与对照间整体代谢差异以及组内样本变异程度。从图 2A可以看出，两个处理组间存在显著差异，但组内差异不显著；为最大限度地区分各组变量，揭示雪茄烟叶发酵过程中的差异中性致香成分，采用监督模式下OPLS-DA模型进行差异代谢物质筛选，如图 2B所示，接菌发酵与对照组中性致香成分可被分为两组。在OPLS-DA基础上，以VIP值大于1来界定物质，结合独立样本T检验，以P < 0.05最终确定差异中性致香成分，结果见表 4，共13种物质，包括5种酮类、2种醇类、2种酚类、2种酯类、1种醛类和1种烃类。
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| 图 2 雪茄烟叶中性致香成分主成分分析（A）及正交偏最小二乘法判别分析（B） Fig. 2 Principal component analysis (A) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (B) of neutral aroma components in cigar tobacco leaves |
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为直观分析GL2发酵后雪茄烟叶差异中性致香成分的变化，将差异致香成分的相对含量进行归一化处理，结果如图 3所示。差异中性致香成分主要有13种，以酮类、酯类和醇类为主，其中9种成分显著上调，包括5种酮类、2种醇类、1种烯烃类及1种酚类成分，分别为2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮、2, 6, 6- 三甲基-1, 4-环己二酮、茄酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮、香叶基芳樟醇、植物醇、新植二烯和2, 4-二叔丁基苯酚；2种差异酯类成分(R)-二氢猕猴桃内酯和邻苯二甲酸二丁酯含量显著下调（P < 0.05），苯乙醛和2, 4-二叔丁基-6-硝基苯酚显著下调（P < 0.05）。差异中性致香成分的筛选，能够更加明确GL2对雪茄烟叶中性致香物质的影响。
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| 图 3 雪茄烟叶差异中性致香成分含量热图 Fig. 3 Heat diagram of contents of neutral aroma components in cigar leaves |
2.3 沙福芽孢杆菌GL2发酵后雪茄烟叶关键差异中性致香成分
为阐明GL2发酵后雪茄烟叶差异致香成分对烟叶品质的影响，对雪茄烟叶香气、刺激性和色泽3项指标进行感官审评，结果（表 5）表明，经GL2发酵后香气得分得到提高、刺激性明显降低、烟叶色泽更佳。采用皮尔逊相关性系数分析差异中性致香成分与烟叶感官评分之间的相关性并作热图，结果（图 4）显示，有9种差异中性致香成分与雪茄烟叶的整体香气得分呈正相关，但只有酮类（5种）、新植二烯和植物醇与雪茄烟叶的整体香气呈显著正相关（P < 0.05）。此外，有4种差异致香成分与香气呈负相关，其中2, 4-二叔丁基-6-硝基苯酚与烟叶的整体香气呈显著负相关（P < 0.05）。茄酮、2, 6, 6- 三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮、香叶基丙酮和金合欢基丙酮是类胡萝卜素降解产物，是增加烟香和清新香气的主要成分，对香气量、香气质有正面影响作用[28]；新植二烯是叶绿素降解产物，可直接进入烟气，具有降低刺激性、使烟气醇和的作用[29]；植物醇具有淡花香，常作为定香剂用于烟用香精[30]。另一方面，共有4种成分与刺激性呈正相关，其中苯乙醛呈显著正相关（P < 0.05），这与王泽鹏等[27]研究结果类似；苯乙醛会增大烟叶吸味的刺激性，对烟草干草香、焦甜香、焦香、正甜香、清甜香、清香均有较大负面影响[17]。从两种处理的雪茄烟叶中性致香成分与感官评分相关性可知，2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮、2, 6, 6-三甲基-1, 4-环己二酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮、新植二烯、茄酮和植物醇可认为是沙福芽孢杆菌GL2发酵雪茄烟叶后的关键差异中性致香成分。
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| *: P < 0.05, **: P < 0.01 图 4 雪茄烟叶差异中性致香成分含量与评分的相关性聚类分析 Fig. 4 Correlation cluster analysis between the content and score of neutral aroma components in cigar tobacco leaves |
2.4 沙福芽孢杆菌GL2发酵对雪茄烟叶关键差异中性致香成分的香气贡献度分析
雪茄烟叶吸味由各中性致香成分的阈值及其在风味体系中的浓度共同决定。ROAV结合各挥发性物质觉察阈值与体系中相对含量，可以量化评价各组分对总体香气贡献程度，进而确定中性致香成分对香气的贡献度大小。在一定范围内，ROAV值越大，该香气对体系香气的贡献度越大；ROAV > 1的致香成分决定香气体系的大部分风味，而0.1 < ROAV < 1则对香气具有一定修饰作用。通过ROAV计算，结果如表 6所示，从CK鉴定出12种ROAV值> 1的中性致香成分，包括具有干香特征的2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮（100.00）、巨豆三烯酮A（42.16）、巨豆三烯酮B（30.11），具有花香的香叶基丙酮（40.53）、苯乙醛（38.38）、反 - 橙花叔醇（20.51）、植物醇（15.56）、芳樟醇（7.41）、邻苯二甲酸二丁酯（5.41）、2, 4-二叔丁基苯酚（2.49），具有清凉感的异佛尔酮（15.69）、(R)-二氢猕猴桃内酯（13.40）；另有3种重要的修饰香气成分；可见CK的香气总体呈干香、花香。
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GL2发酵后的烟叶共鉴定出9种ROAV值> 1的中性致香成分；与CK相比，GL2发酵后的烟叶后表征干香特征的巨豆三烯酮A和巨豆三烯酮B的ROAV值提高，分别为78.75、63.85，对雪茄干香特征的贡献大大提高。此外，香叶基丙酮、反 - 橙花叔醇和植物醇的ROAV值同样提升，分别为44.03、22.84和16.054，是花香主要香气成分；具有新鲜胡萝卜味的茄酮活度值由0.88提升至1.13，从修饰香气成分转变为主要香气成分；同时，具有柠檬草香气的6-甲基-5-庚烯-2-酮（0.31）和具有木香花香的(S)-氧化芳樟醇（0.14）为GL2发酵雪茄烟叶中的特有香气成分，可被认为是其特征致香物质；而(R)-二氢猕猴桃内酯、苯乙醛和邻苯二甲酸二丁酯等3种与香气呈负相关的成分的活度值降低。整体而言，GL2发酵后的雪茄烟叶关键差异中性致香成分中2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮、香叶基丙酮、茄酮和植物醇对香气的贡献增大，使整体香气的干香、花香更加浓郁。
3 讨论 3.1 沙福芽孢杆菌GL2对雪茄烟叶中性致香成分数量的影响GL2发酵雪茄烟叶后中性致香成分的种类略比对照减少2种，这与许春平等[31]利用芽孢杆菌发酵烤烟可以增加香气成分种类的结果不大一致。GL2发酵雪茄烟叶后中性致香成分中，烃类增加2种、醇类增加1种，而酚类减少1种、醛类和酯类各减少2种，但酮类种类数未变；新增加有酮类（6-甲基-5-庚烯-2-酮）、烯烃类（正癸烷、4, 5-二甲基壬烷和2, 6, 7-三甲基癸烷）、醇类〔(S)-氧化芳樟醇、香叶基芳樟醇〕；而存在于对照中但未检出的有4-(2, 2, 6-三甲基环己基)-2-丁酮、芳樟醇、2, 6二甲基壬烷、3-(2, 6, 6-三甲基-1-环己烯基)-2-丙烯醛和十五烷醛、(R)-二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸二丁酯和2, 4-二叔丁基-6-硝基苯酚。
3.2 沙福芽孢杆菌GL2对雪茄烟叶中性致香成分含量的影响GL2发酵雪茄烟叶后中性致香成分总量及各主要致香成分含量均有所增加，这与毛多斌等[32]研究结果类似。许春平等[31]研究发现，利用单一芽孢杆菌发酵可使烤烟中羰基类、酸类、酯类和内酯、烃类、杂环类及酚类等香气成分含量均升高，但混菌发酵结果则相反。瞿娇娇等[33]通过加大枯草芽孢杆菌接种浓度，探明发酵后烟叶中醇、酸、酯类总量较未接种烟叶分别增加28.15%、102.66% 和22.29%。GL2发酵后烃类、酮类、醇类物质含量增加，其中烃类的新植二烯、正十二烷和正十五烷等成分含量显著增加，加入烷烃类化合物对烟丝有明显的保润效果[34]，因此推测烃类含量的提高可提升雪茄烟叶的保润作用；酮类物质中茄酮、β-大马酮、巨豆三烯酮A和巨豆三烯酮B和醇类中的植物醇、反 - 橙花叔醇和香叶基芳樟醇等致香成分含量大大增加。这些致香成分含量的提升有助于改善雪茄烟叶的感官质量[35]。而含量减少的致香成分种类为酯类和醛类，这一结果不同于瞿娇娇等[33]的研究，这可能与微生物的种类有关，不同菌种对烟叶致香成分影响各异[36]，感官品质的提升不仅由香气量和重要致香成分的提升来实现，还与不良成分的消减有关。以上结果表明，GL2不仅可增加重要香气成分含量，还可有效降低苯乙醛、2, 4-二叔丁基-6-硝基苯酚、(R)-二氢猕猴桃内酯和邻苯二甲酸二丁酯等与刺激性相关的成分含量[25, 27]。
3.3 沙福芽孢杆菌GL2对雪茄烟叶感官品质的影响雪茄烟叶经GL2发酵处理后，烟叶香气增加、刺激性明显降低。大量研究表明，将微生物应用于雪茄烟叶可提高烟叶发酵质量和品质，所用菌种多以芽孢杆菌属为主。薛云等[37]使用芽孢杆菌ZZ-8发酵广西河池地区C4F烟叶后能有效提升香气质、降低刺激性和杂气。陈兴等[38]通过添加西姆芽孢杆菌V16及其所产酶提升了烟叶的内在品质。杨培香等[39]使用分离自烤烟叶面的枯草芽孢杆菌Van3发酵烟叶，显著提升了烟叶品质。瞿娇娇[33]等加大枯草芽孢杆菌接种浓度，发现可以提高发酵烟叶的香气质，改善吃味，减少杂气，降低刺激性，使烟气细腻、柔和，提高整体感官品质。本文利用分离自雪茄烟中的GL2发酵雪茄烟叶，没有改变烟叶香型，仍以干香、花香为主，但可显著提高干香、花香浓度，明显提升烟叶的香气量和感官品质，可以应用于雪茄烟叶发酵生产中。
4 结论通过人工接种分离来自雪茄烟中的GL2发酵雪茄烟叶，可明显提高烟叶中香气总量，增加成分以烯烃类、酮类和醇类为主，其中包括香叶基丙酮、金合欢基丙酮、2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮、异佛尔酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烯二酮、β-大马酮、茄酮和新植二烯等。基于多元统计方法，共筛选得到13种差异中性致香成分，其中9种差异致香成分含量显著上调，且与雪茄烟叶香气呈正相关，有7种达到显著正相关，分别为2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮、2, 6, 6-三甲基-1, 4-环己二酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮、新植二烯、茄酮和植物醇，可被认为是GL2发酵雪茄烟叶的关键差异致香成分；另有4种差异致香成分含量显著下调，分别是(R)-二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醛和2, 4-二叔丁基-6-硝基苯酚，均与雪茄烟叶香气呈负相关，其中2, 4-二叔丁基-6-硝基苯酚与雪茄烟叶的整体香气呈显著负相关。GL2发酵后雪茄烟叶关键差异中性致香成分中2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1, 4-二酮、香叶基丙酮、茄酮和植物醇对香气的贡献增大，使整体香气的干香、花香更加浓郁。
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(责任编辑 马春敏)